Методическая статья

Fluorogenic пептид расщепления Assay экран для протеолитической активности: приложения для коронавирус Спайк активации белка

DOI:

10.3791/58892

⸱

9 января 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 3Virologie et Immunologie Moléculaires, Domaine de Vilvert, INRA, 4Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем assay расщепления fluorogenic пептид, который позволяет быстрое скрининг протеолитической активности протеаз пептиды, представляющий сайт расщепления пептидов вирусных фьюжн. Этот метод также может использоваться на любой другой мотив аминокислоты в последовательности белка для проверки активности протеаз.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оболочечных вирусов, таких как коронавирус или гриппа вирус требуют протеолитического расщепления их синтез белка, чтобы иметь возможность заразить клетки-хозяина. Часто вирусы экспонат клеток и тканей тропизма и адаптированы к конкретным клетки или ткани протеаз. Кроме того эти вирусы могут ввести мутации или вставки в их геном во время репликации, что может повлиять на раскол и таким образом могут способствовать адаптации к новому хозяину. Здесь мы представляем assay расщепления пептидов fluorogenic, который позволяет быстрое скрининг пептидов, подражая сайт расщепления белков вирусной фьюжн. Методика является очень гибкой и может использоваться для изучения протеолитической активности одного протеазы на многих различных субстратах, и Кроме того, он также позволяет исследовать деятельности нескольких протеаз на один или несколько пептидных субстратов. В этом исследовании мы использовали пептиды, подражая мотивы сайте расщепления белка Спайк коронавирус. Мы протестировали человека и верблюд производных коронавирус Ближнего Востока респираторный синдром (РВК-CoV) продемонстрировать что одноместные и двухместные замен на сайте расщепления может изменять активность Фурин и резко изменить эффективность расщепления. Мы также использовали этот метод в сочетании с биоинформатики для проверки активности расщепления Фурин кошачьих коронавирус Спайк белков из различных серотипов и штаммов. Этот метод на основе пептида меньше труда и времени интенсивные, чем традиционные методы, используемые для анализа протеолитической активности вирусов, и результаты могут быть получены в течение одного дня.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирусная сплавливание с принимающей клеточной мембраны представляет собой решающий шаг в жизненном цикле оболочечных вирусов и облегчает проникновение в клетки и репликации вируса. Как правило вирусы обладают специализированными белок (или белки), которые связывается с рецепторами на хост клеточной мембраны и вызывает вирус клеточной мембраны фьюжн1. Вирусных синтез белков, были сгруппированы в три основные классы (I-III)1. Количество вирусов, которые в настоящее время являются серьезной проблемой для общественного здравоохранения, таких, как вирус гриппа (представляющий давно зоонозные эмерджентность от птиц) и Ближнего Востока респираторных синдром коронавирус (РВК-CoV) (представляющий недавно зоонозные появление из верблюдов), используют так называемый класс I синтез белков, которые требуют протеолитических обработки узла протеаз, приложить их fusogenic деятельности2. Аналогичным образом, кошачий коронавирус (FCoV), которая представляет собой угрозу основных болезней для диких и домашних кошек, также обладают класса я синтез белка. Класс I вирусных синтез белков синтезируются обычно как прекурсор uncleaved и обычно состоят из двух доменов, которые отвечают за рецептор привязки и вызывает событие фьюжн соответственно. На сегодняшний день, гриппа гемагглютинина (HA) является лучшее понимание синтез белка и многочисленные исследования описал свою механистический роль принимающей ячейки вход и фьюжн3. В этом случае расщепления белка слияние происходит в определенной последовательности или расщепление сайта в пределах га и в сочетании с рН зависимых конформационные изменения, результаты воздействия вирусных синтеза пептида1,2.

Синтез пептида и его предыдущей последовательности признание протеаз являются критическими для патогенности и принимающей адаптации вируса. Изменения в порядке признания протеазы могут изменить расщепления значительно с потенциально драматические последствия для вирус и разместить4. С одной стороны он может отменить расщепления и таким образом устранить жизненный цикл вируса. Но с другой стороны, мутация может увеличить субстратная специфичность для данного протеазы и/или позволяют «новых» протеазы расщеплять синтез белка. Впоследствии это также может расширить тропизм клеток и тканей, как, например, с гриппом вируса подтипов5,6. Обычно низкой патогенности вирусов птичьего гриппа (LPAI) и большинство человеческих вирусов гриппа приурочены к желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей из-за ограниченной локализации протеаз, которые активировать их. Как правило синтез пептида таких белков HA предшествует четыре амино кислоты последовательность, состоящую из 1-2-непоследовательных основных аминокислот, который признан трипсина как сериновые протеазы как трипсина, matriptase или TMPRSS27, 8. когда вирус получает вставки или мутации, которые изменяют сайт расщепления многоосновных сайт, он позволяет Фурин активировать HA и потенциально привести к гораздо более тяжелые системные инфекции6,9. Эти вирусы называются высокой патогенности вируса птичьего гриппа (HPAI), характерна штаммы H5N1.

В отличие от гриппа ха многие коронавирус, например РВК-CoV, имеют два отдельных расщепления сайтов в пределах их Спайк белка. S1/S2 сайт домена фьюжн C-терминал (S2), отделяет N-концевой домен рецептор привязки (S1) с второй сайт расщепления, называется S2', вниз по течению от сайта S1/S2, в близости к синтез пептида10. Было высказано мнение о том, что сайты являются последовательно, расщепляется на следуют S2 S1/S2 '. В отличие от HA большинства штаммов вируса гриппа, РВК-CoV S белка S1/S2 и S2' сайты могут быть признаны протеаз семейства proprotein конвертазы (ПК), как Фурин. Члены этой семьи прилепится в парных основных остатков с мотив R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Как правило аминокислоты вверх по течению расщепления сайта называются P1, P2, P3, и т.д. считая от расщепления сайта и аминокислоты вниз по течению обозначены как P1', P2', P3', и т.д. 11. FCoV штаммы могут иметь либо одно- или двойной расщепления сайта. Как РВК-CoV, некоторые штаммы FCoV также обладают два расщепления сайтов (S1/S2 и S2') в их белка S. Однако эта характеристика не включает серотип я FCoVs (клады A). В отличие от этого, члены группы II (клады B) серотип только у одного расщепления сайт (S2')2,12. Несколько протеаз было предложено прилепится FCoV расщепление сайтов, включая Фурин, трипсин как протеаз и катепсина. Было предложено, что белок S кишечных FCoV (также известен как кошачий кишечных коронавирус или FECV), скорее всего, расщепляется, Фурин на сайте S1/S2 и мутации в этом сайте (а также в S2') приводит к изменениям в требованиях протеазы. Эти мутации были связаны с изменениями в тропизма и патогенности этих вирусов, позволяя вирус стать системной и Макрофаг Тропик (также известный как кошачий инфекционный перитонит вирусов или FIPV)13.

Вирусы естественно ввести мутации в их геном во время каждого цикла репликации и часто новые подтипы и штаммов гриппа, РВК-CoV и FCoV описаны14,,1516. Будучи частью быстрой оценки для оценки общественного здравоохранения угрозы новых вирусов критически важно для изучения изменений в расщепления сайта и как она влияет на спектр протеаз, активация этих вирусов. Здесь мы описываем пептидной основе assay, который позволяет очень быстро оценить влияние изменения сайта расщепления белка S РВК-CoV субстратная специфичность данного протеазы и быстро экран различные протеаз за их способность расщеплять заданной или множественные последовательности4. Во втором наборе экспериментов мы использовали технику для определения активности расщепления Фурин через различные серотипы FCoV и штаммов.

Пептиды, используемые в этот assay изменяются с парой энергии флуоресценции резонанс передачи (лад), 7-methoxycoumarin-4-yl ацетил (MCA) на окончание N и N-2,4-dinitrophenyl (DNP) в C-terminus. В ходе анализа MCA взволнован и излучает световую энергию, которая является закаленном ДНП, до тех пор, как пара находится в непосредственной близости друг к другу. Если происходит расщепление, однако, DNP не способна утолить выбросов больше и он может быть прочитан флуоресценции пластины читателя. Изменения в флуоресцировании измеряется в ходе эксперимента для определения скорости расщепления пептидов и чтобы рассчитать скорость, с которой протеазы расщепляет конкретных пептида (также известный как Vmax)17.

В целях разработки пептидов, ген соответствующих синтез белка должны были виртуализации или доступны в базе данных. Однако этот метод менее интенсивный труд и дорогостоящим, чем обычные методы, которые обычно требуют клонирования синтеза белка гена в векторы выражения выразить его в mammalian клетках для анализа расщепления. От начала до конца это может занять несколько дней до нескольких недель, в то время как пептид анализов, представленные здесь может быть сделано в течение одного дня, как только пептидов и протеаз доступны. Настройка assay занимает от 5 до 30 мин в зависимости от количество выборок и выполнения в reader пластины флуоресценции что 1 ч. анализ данных может занять до 2 ч снова в зависимости от размера выборки.

Здесь мы выбрали два различных примеров представить assay. В первом примере мы представляем данные, сравнивает Фурин опосредованной расщепление человеческого и верблюд производные РВК-CoV, чтобы оценить потенциал верблюд производные штаммов активируемая в организме человека, если они пересекают видовой барьер. Во втором примере, мы использовали пробирного пептидные fluorogenic для определения Фурин опосредованной расщепления S1/S2 и S2' сайты или S2' сайт двух serotype я и два серотип II FCoV штаммов, соответственно. Для этих экспериментов мы использовали трипсина расщепления как позитивный элемент управления.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Разработка и подготовка пептиды

  1. Приобретают последовательность синтез белка интереса со стороны общественности или базы данных как NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) вирус возбудителя (https://www.viprbrc.org). Выберите сайт признание протеазы, предшествующий синтез пептида и включают в себя 2-3 аминокислот вверх и вниз по течению этой последовательности.
  2. При заказе пептидов, измените их с ЛАДАМИ пара 7-methoxycoumarin-4-yl ацетил (MCA) на окончание N и N-2,4-dinitrophenyl (DNP) в C-terminus.
    Примечание: Некоторые поставщики обеспечивают эти изменения. Цена и время доставки зависят от выбора поставщика. Однако альтернативные модификаций существует, которые различаются по чувствительности и требуют корректировки пластины читателя с точки зрения длины волн.
  3. Ресуспензируйте пептида в соответствии с рекомендациями производителей, нежно закупорить вверх и вниз. Например Ресуспензируйте пептидов в 70% этанол до конечной концентрации 1 мм.
  4. При необходимости добавьте трубка, содержащая пептида и растворителя в sonication ванну до тех пор, пока он полностью высокомобильна, если пептида не очень хорошо Ресуспензируйте, закупорить.
  5. Аликвота пептида в легких увлажнения или стойкие трубы для защиты пептида от обесцвечивания. Держите аликвота размеры малы, чтобы избежать нескольких циклов замораживания/оттаивания (например, 100 мкл). Хранить аликвоты при-20 ° C.

2. Подготовка читателя пластины флуоресцирования

  1. Включите пластины читателя и дождитесь завершения самопроверки.
  2. Откройте программное обеспечение на компьютере, прилагаемый и убедитесь, что это связано с читателем пластины.
  3. Открыть настройки температуры и равным 30 ° C (или требуемой температуры для обеспечения оптимальной производительности протеазы).
  4. Нажмите на управления | Инструмент установки для настройки эксперимента.
  5. Выберите кинетическую.
  6. Выберите флуоресценции.
  7. Введите возбуждения и выбросов длин волн: 330 Нм и 390 нм соответственно.
  8. Снимите флажок автоматического отключения.
  9. Выберите средний, нормальной чувствительности.
  10. Среда 1 ч для assay и выберите одно измерение каждые 60 s.
  11. Набор 5 s, перемешивая до первого измерения и 3 s перед каждым измерением
  12. Выберите скважин для чтения и начать пробу.

3. Подготовка Assay

  1. Подготовка аналитического буфера расчета соответствующих величин для каждого ингредиента и добавив его. Для Фурин, сделать буфер, состоящий из 100 мм HEPES, 1 мм CaCl2, 1 мм 2-меркаптоэтанол, 5% Тритон X-100. Для трипсина используйте стандартные фосфат буфер солевой раствор (PBS).
    Примечание: Объемы по 10 мл или менее достаточно. Буфер варьируется в зависимости от protease(s), используемый в assay.
  2. Холод в буфере на льду.
  3. Место пластину пробирного на льду с тонкой металлической пластиной под поддержка охлаждения и стабильности. Использование твердого черного пенополистирольные плиты 96-луночных с плоским дном и не лечить.
    Примечание: Важно использовать черный пластины для предотвращения флуоресцентные «утечки» от соседних скважин.
  4. Вычислить соответствующее количество протеазы для добавления каждой реакции на основе предыдущих публикаций или экспериментальных данных. Для Фурин используйте 1 единицу в реакции, которая соответствует 0,5 мкл. Для трипсина используйте 0.5 мкл 160 Нм TPCK трипсина.
  5. На сэмпл Подготовьте 3 технические реплицирует на пробы в суммарный объем 100 мкл на сэмпл.
    Примечание: Он был экспериментально оценены, что он не делает разницы ли дозирование осуществляется при нормальных условиях освещения или уменьшить яркость света. Однако пептиды должен не подвергаться воздействию света для длительного периода времени.
  6. Пипетка соответствующее количество аналитического буфера (94,5 мкл, как описано в разделе Шаг 3.1) в каждой скважине.
  7. Добавьте протеазы в каждой скважине. Для обоих Фурин и TPCK трипсина, используйте 0.5 мкл на сэмпл. 6 скважин (3 скважины для пустого элемента управления) и 3 скважины для элемента управления, пептид добавьте 0,5 мкл буфера вместо соответствующих протеазы.
  8. Добавьте пептида в конечной концентрации 50 мкм для каждой скважины, за исключением пустой элемент управления. В этом случае Пипетка 5 мкл пептид, подготовленный, как описано в шаге 1.3. Добавьте пустой элемент управления вместо пептид 5 мкл буфера.
    Примечание: Несколько концентрация пептида первоначально были протестированы с описанных фермента концентрации для обеспечения что ферменты были насыщенным.
  9. Вставьте пластину в читатель пластины флуоресценции и нажмите кнопку Пуск.

4. анализ данных

  1. Сохраните файл эксперимент.
  2. Нажмите на Экспорт и экспортировать в формате .txt.
  3. Импортируйте файл .txt в электронную таблицу.
  4. Для каждого технического реплицировать на сэмпл создайте граф заговоре относительных единицах флуоресцентные (РФС) на оси y с временем по оси x (Дополнительные рис. 1).
  5. Выберите диапазон данных, где граф диапазона линейной и ближе к началу рост флуоресценции.
  6. Печать выбранных данных на втором графике и добавить линейного тренда.
  7. Выберите в параметрах тренда уравнение отображения на графике. Уравнение покажет Vmax.
  8. Рассчитайте средний Vmax для каждого образца из 3 технические реплицирует.
  9. Повторите дважды больше эксперимент для получения 3 биологических реплицирует.
  10. Вычислить стандартное отклонение на основе данных из 3 независимых биологического реплицирует.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В первой части этого исследования, мы использовали пептидов, которые представляют S2' расщепления сайт три различных белков РВК-CoV S: от прототипа EMC/2012 человека штамма (Genbank AFS88936.1) и из двух выбранных верблюд производные РВК-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) и Mor215 (Genbank AVN89324.1) штаммов, изолированных в Египте и Марокко, соответственно (Таблица 1)16,18.

По сравнению с EMC/2012 штамм, HKU205 S2' расщепления сайт имеет две мутации в P1 и P2' позиции, которые могли бы потенциально влияние его признание, Фурин и изменить расщепления эффективности (Таблица 1). Кроме того мы были заинтересованы, чтобы исследовать, если и как каждый индивидуальный мутации в HKU205 штамм влияет на Фурин расщепления. Мы, таким образом, включены два пептиды, где отдельные замен были введены в последовательности пептид EMC/2012 (S2 EMC/2012 mutA-S' и EMC/2012 mutS-я S2') (Таблица 1). Фурин смог расщеплять пептид EMC/2012 эффективно с Vmax 6.3 ± 1,2 РФС/мин, в то время как мы обнаружили почти нет расщепления при использовании S2' пептидные HKU205 штамма (Vmax 0,5 ± 0,1 РФС/мин) (рис. 1a). При расследовании S2 EMC/2012 mutA-S' пептид, мы обнаружили, что раскол был сильно снижается по сравнению с дикого типа последовательности (Vmax 3.6 ± 1 РФС/мин). Существует почти нет расщепления при тестировании mutS EMC/2012-я S2' пептида (Vmax 1.1 ± 0,9 РФС/мин) (рис. 1a).

Недавно РВК-CoV изоляты от Западной Африки сообщили, что филогенетически отличается от РВК-CoV находятся в Аравийском полуострове16. Один из недавно описан изолятов это Mor213 штамм, который носит лейцина вместо аргинина в положении P4 S2' сайт (Таблица 1), и которые могут потенциально влияние его признание, Фурин и изменить эффективность расщепления. Наши пептид пробирного показали, что только минимальные расщепление Mor213 S2' сайт по сравнению с EMC/2012 сайт (рис. 1b). Vmax для Mor213 пептид-1,0 ± 0,1.

Для второй части данного исследования мы использовали же assay пептид для оценки Фурин опосредованной расщепления сайтов расщепления белка FCoV S. Мы использовали пептиды, подражая S1/S2 расщепления сайт двух FCoV серотип я вирусов: FECV I и-4 (от лаборатории Whittaker) и FIPV я черный (Genbank AB088223.1). Мы также использовали пептиды, подражая S2' сайт этих вирусов, а также два FCoV серотип II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) и штаммов FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) (Таблица 1). Как правило Фурин расщепления происходит, когда основные остатков (аргинин и лизин) присутствуют в P1 и P4 позициях на сайте расщепления. Мутации в P1 и P4 P1' должности предлагается вмешиваться Фурин спайности, таким образом изменяя требования протеазы белка. (Таблица 1). Фурин расщепления было отмечено для прототипом S1/S2 пептид FECV I и-4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7,61 РФС/мин), но не мутировал S1/S2 пептид FIPV я черный S1/S2 (Vmax -1.37 ± 1.29 РФС/мин) (рис. 2A). Аналогичным образом, Фурин смог прилепится прототипом S2' пептид FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0,97 РФС/мин), но не мутировал S2' пептиды FECV I S2 и-4' (Vmax 0.26 ± 0,11 РФС/мин), FIPV я черный S2' (Vmax 0.30 ± 0,14 РФС/мин) и FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0,11 РФС / мин) (рис. 2B). Мы использовали трипсина как положительный контроль для расщепления пептидов и мы наблюдали трипсина расщепления в всех пептиды используется (дополнительный рисунок 2).

figure-results-1

Таблицы 1. Пептиды используется и соответствующих аминокислот. Пептиды, используемые в анализов содержат пары (MCA/DNP) лад ацетил/2,4-dinitrophenyl (7-methoxycoumarin-4-ил). P1 и P4 расщепления сайт позиционируется аргинин (R) остатков, которые признаны Фурин, выделены жирным шрифтом. Остатки в красном соответствуют мутации, по сравнению с ссылка последовательности.

figure-results-2
Рисунок 1 . Фурин опосредованной протеолитического расщепления человека и верблюд производные РВК-CoV S2' сайтов fluorogenic пептидов. A. Фурин расщепления assay человека РВК-CoV EMC/2012 S2' сайт и штамм верблюд производные HKU205 (двойной мутант), наряду с одного мутанта варианты EMC/2012 (mutA-S и mutS-я). B. Фурин расщепления assay человека РВК-CoV EMC/2012 S2' сайт и верблюд производные штамм Mor213. Для панелей с рекомбинантным Фурин инкубировали A и B, пептиды и увеличение флуоресценции протеолитических обработки была измерена с помощью флуориметр. Анализы были проведены в triplicates с результаты, представляющие средние Vmax от трех независимых экспериментов (n = 3). Планки погрешностей указывают SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 2 . Фурин опосредованной протеолитического расщепления FCoV S1/S2 и S2' сайтов fluorogenic пептидов. A. Фурин расщепления пробирного FECV I и-4 и FIPV я черный S1/S2 сайтов. Пептиды инкубировали с рекомбинантным Фурин. B. Фурин расщепления пробирного FECV I и-4, FIPV, я черный, FECV II 1683 и FIPV II 1146 S2' сайты. Увеличение флуоресценции протеолитических обработки была измерена с помощью флуориметр. Анализы были проведены в triplicates с результаты, представляющие средние Vmax от трех независимых экспериментов (n = 3). Планки погрешностей указывают SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Справочная таблица 1: Vmax значения, используемые для рис. 1 и рис. 2. Vmax, которые были рассчитаны значения из диаграммы, как показано в дополнительном Рисунок 1 и описано в протоколе раздела 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительные Рисунок 1: Иллюстрация необработанных данных полученных из программного обеспечения читателя пластина. Увеличение флуоресценции течение времени графики, которые были использованы для определения Vmax. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительные Рисунок 2: трипсин опосредованной протеолитического расщепления FCoV S1/S2 и S2' сайтов fluorogenic пептидов. Трипсин расщепления пробирного FECV I и-4 и FIPV черный S1/S2 сайты и FECV I и-4, FIPV, я черный, FECV II 1683 и FIPV II 1146 S2' сайты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем здесь assay fluorogenic пептид, который позволяет для быстрого скрининга белковых последовательностей для их протеолитического расщепления протеаз. В нашем первом примере мы выбрали разные расщепления сайта мотивы протеина Спайк (S) РВК-CoV чтобы проиллюстрировать одну заявку на этот assay. Несколько оболочечных вирусов, которые обладают класса я синтез белков, таких как РВК-CoV, гриппа и ОРВИ-CoV (тяжелый острый респираторный синдром) являются основными проблемами для здоровья населения и новые подтипы постоянно развиваются, имеют потенциал для кросс видов барьеры из их естественной хостов для людей1,,1516. Изоляция вирусов и выращивание их в лаборатории не всегда возможно или требует специальных лабораторий, которые не доступны в каждом объекте исследования. Следовательно существует необходимость для оценки потенциальной угрозы общественного здравоохранения новых вирусов, которые могут проводиться в условиях регулярных лабораторных методов. Помимо вирусов ориентации людей, некоторые животные вирусы как FCoV также обладают же сорта синтеза белков, таким образом, аналогичными признаками, чем их коллеги-человека. Изолировать эти вирусы также может быть сложной задачей, что делает использование инновационных средств для их изучения необходимых.

Решающим шагом в жизненном цикле вышеуказанных вирусов является запись хоста клеток и синтез протеолитических обработка соответствующих синтез белка при посредничестве принимающей протеаз1,2. Стандартный способ для изучения этой части вирусный жизненного цикла является transfect mammalian клеток, которые позволяют для выражения протеина, инкубировать или совместно transfect с протеазы интерес, изолировать, чтобы клонировать синтеза белка гена в mammalian выражение вектор белка и выполнять Западный анализ помаркой. Этот метод поставляется с некоторыми ограничениями: наличие вирусной ДНК/РНК для клонирования, расходы для синтеза гена, если не ДНК или РНК, наличие антител для обнаружения синтез белка и его продуктов расщепления и это может занять несколько недель до тех пор, пока выполняется всего исследования. Он даже становится больше времени, деньги и трудоемким, если интерес исследования расследовать некоторые мутации на сайте расщепления, потому что он требует сайт Направленный мутагенез. Пробирного пептидные fluorogenic, которую мы опишем здесь не имеют эти ограничения. Пептиды интерес может быть разработан на основе публично доступных последовательностей, есть несколько поставщиков, которые предоставляют широкий спектр рекомбинантных протеаз, которые актуальны для этих видов исследований и анализа, включая анализ может быть выполнена в рамках один день.

В нашем примере, мы рассмотрели Фурин опосредованной расщепление S2' протеазы признание сайт белка S РВК-CoV, полученных от людей и верблюдов из Египта и Марокко. Как человека EMC/2012, так и верблюд HKU205 S2' сайты содержат типичный RXXR Фурин расщепления мотив. Однако, по мнению расщепления PiTou 2.0, забив алгоритм HKU205 S2' сайт не предсказал, чтобы быть расщепляется, Фурин, который мы экспериментально подтверждено19. Причина почему HKU5 S2' не обрабатывается Фурин может быть обусловлено изолейцина в P1' позиции. Когда мы проверили два пептидов, которые отдельные мутации в EMC/2012 S2' последовательности, мы были в состоянии подтвердить, что изолейцин в P1' основном аннулирует расщепления, тогда как аланина Серина замещения привели к сокращению расщепления. Mor213 S2' сайт не содержит Фурин расщепления мотив и это было не удивительно обнаружить почти не расщепления. Мы также рассмотрели, как Фурин расщепляет S1 S2 и S2' протеазы признание сайты белка FCoV S. Мы были в состоянии соблюдать Фурин расщепления пептидов как FECV (FECV I и-4 S1/S2 и FECV II 1683 S2'), в то время как мутировал последовательности от FIPV вирусов были не расщепляется, Фурин.

При сравнении Фурин опосредованной расщепление EMC/2012 S2' пептида (рис. 1A) с пептидами FECV I и-4 S1/2 (рисунок 2A), мы обнаружили, что существует приблизительно эмиссия разница в Vmax. Это можно объяснить мотив Фурин расщепления в обеих последовательностях (Таблица 1). В то время как минимальное требование для расщепления Фурин RXXR мотив, RXRR последовательность является гораздо более благоприятной2. Таким образом, EMC/2012 S2' пептид, который имеет RSAR мотив, расщепляется с менее специфика, по сравнению с пептидной FECV I и-4 S1/2, который содержит сайт расщепление RSRR Фурин (Таблица 1).

Однако одним из основных ограничений assay является, что пептиды не отражают третичную структуру протеина, которую они обычно встроены в. Расщепление полная длина синтез белка предоставляет синтеза пептида и триггеры принимающей ячейки ввода1. Взаимодействие между протеазы и синтез белка могут быть затронуты также Третичная структура синтез белка, в то время как мы предполагаем, что пептиды являются более или менее линейной. Следовательно расщепление, обнаруженных в assay пептида возможно, искусственной и могут не отражать ситуацию в естественных условиях . Об этом сообщила для расщепления гриппа H3N2 га подтип matriptase. Хотя несколько групп описанный расщепления H3N2 га matriptase в пептидной анализов, также было показано, что инкубации полная длина H3N2 га протеина и matriptase в клеточной культуре не привели к fusogenic HA белка4,20, 21. Существуют другие примеры, которые показывают, что биологически важные регулирование протеолитического расщепления находится на уровне конформации белка. Он был описан синтез белков иногда нужно серии предварительно фьюжн событий, чтобы иметь возможность подвергать расщепления сайтов после слияния. Семлики лес вирус синтез белка, например, требует структурных перестроек во время prefusion событий для того, чтобы разоблачить его синтез белка и сделать его доступным для активации протеолитических22. Таким образом результаты, полученные в assay пептидные fluorogenic должны быть одобрены клеток фьюжн анализов или подобные эксперименты. Однако пептид assay по-прежнему позволяет быстрый показ нескольких комбинаций протеазы/пептида и сократить труда и время последующих экспериментов, поскольку комбинации, которые не показывают расщепления весьма вероятно выставлять же результат в естественных условиях.

Вторым крупным ограничение assay касается протеаз. Пока это возможно только для тестирования растворимых протеаз, но не трансмембранного протеаз. В зависимости от замысла эксперимент это может быть проблемой. К примеру гриппа HAs активируются ряда трансмембранного протеаз, расположенный в клеточных мембранах8. В определенной степени эту проблему можно обойти, используя растворимых протеолитических активных доменов, но результаты должны интерпретироваться с осторожностью и должны быть проверены с обычными методами. Мы хотим сослаться на пример beforementioned с matriptase и его деятельности в направлении H3N2 га. В естественных условиях matriptase расположен в клеточной мембраны, но коммерчески доступных фермент — растворимые каталитического домен. Как уже говорилось в отношении синтез белков, возможно, что она также требует полнометражного протеазы взаимодействовать с полнометражного белкового субстрата для получения расщепления и что тестирование только отдельные домены может привести ложных срабатываний.

Эта методология показал, чтобы быть эффективным для изучения расщепления определенных аминокислотных последовательностей, Фурин. Однако применения техники экстентов в любых доступных протеазы (например, катепсинов, proprotein конвертазы), что делает его полезным методом для экрана пептид кандидатов для расщепления протеазы. Кроме того было показано, что этот assay может также использоваться для проверки эффективности ингибиторов протеазы и таким образом обеспечивает быстрый и простой инструмент для экрана белковых ингибиторов23.

Fluorogenic пептид расщепления assay описанных здесь представляет собой дополнение к bioinformatic расщепления, алгоритмы, который предсказывает расщепления пептидов определяется протеазы, на основе свойств аминокислоты и последовательности. Эти две методики, в сочетании с традицией западной blotting методы может использоваться как эффективный метод для изучения протеазы расщепления в пробирке.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование исследований для РВК проект, представленный в этой рукописи была предоставлена NIH Грант R21 AI111085. Кошачий коронавирус исследование было поддержано научно-исследовательских грантов от Моррис животных Фонд, Уинн кошачьих фонда и центр здоровья кошачьих Корнелл. Мы также хотели бы поблагодарить Малик Пейрис за предоставленную нам с Mor213 последовательность, прежде чем он был общедоступным.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПептидыBiomatikN/A
FurinNEBP8077S
Трипсин, обработанный TPCKSigma-Aldrich4352157-1KT
HEPESSigma-AldrichH3375
CaCl2Sigma-AldrichC1016
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM6250
Triton-X100Sigma-AldrichX100
PBSCorning21-040-CV
SpectraMax GeminiXPS Молекулярные устройстваXPS
SoftMax Pro 6.5.1 Молекулярные приборыN/A
96-луночная пластина (твердый черный полистирол с плоским дном и необработанный)Costar3915
Light демпфирующие трубкиWatson Lab131-915BL или 131-915BR
Microsoft ExcelMicrosoftN/A
Prism 7GraphPadN/A

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
  2. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
  3. Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
  4. Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827(2017).
  5. Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
  6. Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
  7. Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
  8. Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
  9. Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
  10. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  11. Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. , 43-76 (1989).
  12. Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
  13. Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
  14. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84 (19), 9733-9748 (2010).
  15. Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
  16. Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
  17. Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
  18. Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
  19. Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
  20. Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
  21. Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
  22. Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
  23. Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Proteolytic Activity ScreeningFurin Cleavage ActivityFRET Peptide DesignFluorescence Plate ReaderKinetic Fluorescence AssayPeptide Substrate AnalysisProtease Inhibitor CharacterizationViral Fusion Protein Activation

Похожие статьи