Методическая статья

Расширение двух измерение Electrospun нановолокно коврики в три измерение подмости

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58918

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья демонстрирует технику расширения традиционной, два измерение (2D) electrospun нановолокно мат в три измерения (3D) леску через разгерметизации подкритической CO2 жидкости. Эти дополненной подмостей являются 3D, тесно имитировать сотовой nanotopographic сигналы и сохранить функции биологических молекул, инкапсулируются в нановолокон.

Аннотация

Electrospinning был предпочтительной технологии в производстве синтетических, функциональный эшафот благодаря biomimicry внеклеточного матрикса и легкость контроля состава, структуры и диаметр волокон. Однако несмотря на эти преимущества, традиционные electrospun нановолокно, подмости поставляются с ограничениями в том числе дезорганизованы нановолокно ориентации, низкую пористость, малые поры и главным образом двумерных коврики. Таким образом существует большая потребность в разработке новый процесс для изготовления electrospun нановолокно леса, которые можно преодолеть указанные выше ограничения. В настоящем документе изложены Роман и простой метод. Традиционные 2D нановолокно мат преобразуется в 3D леску с нужной толщины, зазор расстояние, пористость и nanotopographic сигналы для заполнения ячейки и распространения через разгерметизации подкритической CO2 жидкости. Помимо леску для регенерации тканей происходит, этот метод также предоставляет возможность инкапсулировать биологически активных молекул, таких как противомикробные пептиды для местных лекарств. CO2 расширены нановолокно подмости провести большой потенциал в регенерации тканей, заживление ран, моделирование 3D ткани и актуальные лекарств.

Введение

Концепция разработки синтетических эшафот, что может быть имплантирован в пациентов для оказания помощи в ткани ремонт и восстановление является одним, что пронизывает поле регенеративной медицины на протяжении десятилетий. Идеально синтетической лески призвана побудить миграции клеток от окружающих здоровых тканей, обеспечивает архитектуру для клеток посева, адгезии, сигнализации, пролиферации и дифференцирования, поддерживает васкуляризации, позволяет для адекватной оксигенации и Доставка питания и поощряет узла иммунной активности для обеспечения успеха после имплантации1. Кроме того она может использоваться как носителя для встраивания антимикробной молекул для оказания помощи в ранозаживляющее1,3,6,,78,9. Способность контролировать временного освобождения этих биологических молекул из синтетической лески является еще одним желательным атрибутом, который считается когда инженерных помостами1.

Electrospinning был оптимально техника для производства нановолокно подмости1,2,3,4,5,6. Предыдущие попытки создания нановолокно леску как обсуждаемые здесь было сделано с различной степенью успеха. Однако традиционные нановолокно леса имеют ограниченные способности для достижения этих целей. Традиционные нановолокно леса были главным образом двумерных коврики1,3. Эти nonexpanded леса плотно упакованы с размерами малые поры; Это ограничивает клеток инфильтрата, миграции и дифференциации, как он не способствовать созданию условий, которые аналогичны достаточно найдено в естественных условиях1,,78,9. По этой причине были созданы новые методы подготовки эшафот нановолокно 3D electrospun внести самосущие пороки, которые приходят с 2D нановолокно коврики. Эти методы приводят в 3D леса; Однако они ограниченную применимость из-за методов производства, требующих водных растворов и для процедур. Такая обработка приводит к случайное распределение nanofibers без ограничения Организации, надлежащей толщины или желаемого пористость предоставлять адекватные nanotopographic сигналы, которые необходимы для распространения и миграции клеток. Эти факторы приводят в предыдущих подмостей нановолокно 3D electrospun, которые не имеют адекватного мимикрии жизни тканей1,,78,9.

Более недавние попытки разработки расширенного, 3D леску с лучше biomimicry внеклеточного матрикса (ECM) выполнены с использованием водного раствора натрия боргидрид (NaBH4) решения лечения и готовые формы для лучшего контроля Результирующая форма эшафот7,8. Однако этот метод не является идеальным, как это требует использования водные растворы, химических реакций и паром для лиофильной сушки, что может помешать полимеров и любой инкапсулированные биомолекул, которые растворимы. Добавки, используемые также могут вызывать побочные эффекты во время регенерации тканей8,9. Метод расширения CO2 , изложенные в этой статье, значительно уменьшает время обработки, устраняет потребность в водных растворах и сохраняет размер и функциональность биологически активных молекул в большей степени, чем ранее установленные методы9.

В предыдущих исследованиях, антибиотики, серебро, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3и антимикробного пептида LL-37 были загружены в подмости нановолокно индивидуально и в сочетании исследовать потенциал этих лесов выпустить агентов Далее помощь в ранозаживляющее9,10,12,13. Для целей демонстрации этот метод расширения нановолокно эшафот, Клексан 6, флуоресцентные краски, загружается в эшафот чтобы продемонстрировать потенциал внедрения на эшафот с различными желаемых соединений. Этот метод изготовления расширенной нановолокно леса в сочетании с инкапсулированным биоактивных молекул имеет большой потенциал в регенерации тканей, заживление ран, создание моделей 3D ткани и актуальные доставки наркотиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры в естественных условиях , изложенных ниже были утверждены Комитетом IACUC медицинского центра Университета Небраски.

1. Подготовьте решения для стандартных Electrospinning

  1. В 20 мл стеклянной трубки, растворяют 2 g poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 кДа) в жидкостной смеси Дихлорметан (DCM) и N, N-Диметилформамид (DMF) с рационом 4:1 (v/v) в концентрации 10% (w/v).
    Предупреждение: Ручка DCM и DMF в хорошо проветриваемом капот чтобы избежать воздействия дымов. Не подвергать DCM пластиковых материалов.
  2. Место стеклянной трубки в лаборатории ротатор, до тех пор, пока решение становится ясно. Решение может смешать всю ночь.
  3. Если намерены внедрить биоактивных материалов, таких как пептидов или наркотиков в эшафот, создайте отдельное решение и хранить при 4 ° C до готовой к использованию.
    1. Приготовляют раствор Люминесцентную краску (50 мг/мл) с использованием 20 мл раствора PCL.

2. Установите аппарат Electrospinning (рис. 1A)

  1. Добавьте решение PCL на 20 мл шприц тупой иглой 21 калибровочных прилагается. Убедитесь, что не воздух в шприц и связанные труб.
  2. Поместите вращающийся барабан стальной с земли коллекционер 12 см от кончика иглы.
  3. С помощью крокодил, подключите источник питания высокого напряжения постоянного тока (DC) к иглы и убедитесь, что сборщик обоснована.
    Предупреждение: Всегда отключайте источник питания перед обработкой любых связанных материалов.

3. Electrospinning

  1. По 20 мл раствора PCL, установите параметры шприцевый насос следующим: диаметр = скорость потока, 20.27 мм = 0,5 мл/ч. Проверка, если капли формируются на кончике иглы.
  2. Если включение биоактивных молекул, настроить аппарат для co-axial electrospinning (рис. 1B). Создание заказной коаксиальный сопла с помощью иглы.
    Примечание: Такой насадки также доступны коммерчески. Обратите внимание, что раствор красителя готова имитировать Добавление таких молекул.
    1. Приготовляют раствор 1% флуоресцентного красителя 6 кумарина в воде. Добавьте небольшой шприц 3 мл 1% красителя. Подключите шприц же коаксиальный сопло как решение PCL. Опять же убедитесь, что нет пузырьков воздуха.
    2. Для этого 3 мл раствора, задать параметры шприцевый насос следующим: диаметр = скорость потока, 9.49 мм = 0,02 мл/ч. Проверка, если капли формируются на кончике иглы.
  3. Применение электрического потенциала 20 кв между прядильная (22-иглы) и коллекционер земли расположен 20 см от прядильная. Соберите унифицированных нановолокно коврики в барабан вращается на 2000 об/мин. Соберите коврики нановолокно PCL, как только они достигают толщиной ~ 1 мм.

4. поколение PCL нановолокно коврики с отверстиями выстроились.

  1. Изготовить PCL нановолокно коврики.
    1. Растворите PCL бусины в жидкостной смеси, состоящей из DCM и DMF с коэффициентом 4:1(v/v) в концентрации 10% (PCL) (w/v). Насос PCL раствора со скоростью потока 0,7 мл/ч с помощью шприца насоса во время потенциал 20 кв применяется между прядильная (22-gage иглы) и заземленной коллектор расположен 12 см помимо прядильная.
    2. Соберите нановолокно мембраны, используя вращающийся барабан с вращающейся скорость больше, чем 500 об/мин.
  2. Погружать PCL нановолокно коврики в жидкости N2 для 5 мин (т.е., стать жесткими). Держите PCL нановолокно коврики в жидкости N2 и удар PCL нановолокно коврики с удар 0,5 мм в диаметре.

5. расширение 2D нановолокно коврики с/без выстроились отверстия через подкритической CO2 жидкости (рис. 2).

  1. Поместите PCL нановолокно коврики в жидкого азота на 5 мин и разрезать на квадраты 1 см x 1 см, используя острые ножницы хирургические во время погружения в жидкий азот, чтобы избежать деформацию краев.
  2. Место разреза ковра в 30 мл пластиковых пробирок с ~ 1 g сухого льда. Плотно колпачок крышки и позволяют сухого льда превращаться в жидкость CO2.
  3. После того, как жидкость сформировалась в трубе, быстро Освободите давление, открыв крышку.
    Предупреждение: Используйте надлежащий тепловой защитное снаряжение, при работе с жидким азотом и сухого льда. Не открывайте под давлением трубки к лицу. Пластиковых пробирок не должны использоваться повторно.
  4. Удалите и наблюдать пыхтел леска из трубки. Место эшафот в новых пластиковых пробирок с сухим льдом и повторять до достижения требуемой толщины. Стерилизуйте расширенный нановолокно подмости в окись этилена до инкубации с ячейками.

6. характеристика расширенной нановолокно подмости

  1. Характеризуют морфологии и структуре расширенного нановолокно подмостей, используя растровая электронная микроскопия (SEM).
    1. Поместите образцы с двухсторонней Проводящие Ленты металлические шпильки и пальто с платиновым за 40 s с помощью распыления нанесения покрытий на 40 мА.
    2. Изучите волокон, с помощью SEM согласно предыдущих исследований9. Собирать изображения на ускоряющего напряжения 15 кв.
  2. Характеризуют в vitro релиз профили и отпорности выпустила пептидов.
    1. Вес 10 мг нановолокно мембран до и после расширения CO2.
    2. Погружать образцы в PBS буфера и собирать 10 мкл супернатант в разное время точках (0-28 дней).
    3. Используйте комплект твердофазный иммуно сорбента анализа (ИФА) для количественного определения концентрация пептида LL-37 в собранных супернатант.
  3. Изучите клеточной инфильтрации в естественных условиях и принимающих ответ.
    1. 9 - неделя старый крысах Sprague-Dawley (SD) в камеру, анестезии, подключиться к изофлюрановая пара и анестезировать крыс. Передача крыс на операционный стол после того, как крысы стали полная анестезия без чувства. Непрерывно анестезировать крыс с помощью изофлюрановая носовой конус с испарителя во время операции. Брить волосы спинок Раца, бритва животного и стерилизовать его с йодом и алкоголя кожу скрабом. Создание подкожной карманы через разрезы 1,5 см на supraspinal участках на тыльной поверхности с помощью скальпеля.
    2. Вставьте один расширенный нановолокно лески (1,5 мм) в подкожной карман, используя пинцет для каждого разреза. Закройте разрез с помощью степлера.
    3. В 1 2 и 4 недели, усыпить крыс с 95% CO2. Аккуратно вскрыть экспланта и окружающие ткани, используя Ножницы хирургические. До гистологический анализ погружать ткани в формалином для по крайней мере 3 дней, а затем вставлять с парафином. В разделе ткани с микротом, а затем выполнить гематоксилином и эозином (H & E), Masson trichrome окрашивание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективность расширения традиционных 2D electrospun нановолокно коврики в 3D леса через разгерметизации подкритической CO2 жидкости был продемонстрирован в различных качествах: толщина подмости увеличилась с 1 мм при лечения до 2,5 мм и 19,2 мм с одной и двумя CO2 обработки, соответственно (Рисунок 3А-C). Пористость а характеристика архитектуры критических для заполнения ячейки-также увеличилась в положении, соответству...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Преобразование традиционной 2D electrospun нановолокно коврики в расширенной 3D леса, который был исследован через CO2 разгерметизации. Традиционные 2D нановолокно маты являются успешно расширенной через подкритической CO2 жидкости. Важнейшие шаги являются изготовить 2D нановолокно маты под оптимизированного состояния и сократить маты без деформирования края (например., используя острые ножницы хирургические). Это CO2-расширенный нановолокно леса имеют много пре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана, субсидии от национального института Генеральной медицинской науки (NIGMS) в низ (2P 20 GM103480-06 и 1R01GM123081 к J.X.), Отис Glebe медицинский исследовательский фонд, NE LB606 и запуска средства от Медицинский Университет штата Небраска Центр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПоликапролактонSigma-Aldrich440744
N,N-диметлиформамидFisher ChemicalD-199-1
ДихлорметанFisher ChemicalAC61093-1000
Кумарин 6Sigma-Aldrich546283
Вращающийся стальной барабанпо индивидуальному заказуСлужит коллектором во время электропрядения.
Шприцевой насосFisher Scientific14-831-200Для коаксиального спиннинга требуются два одиночных шприцевых насоса.
RevolverLab Net InternationalH5600Регулируемый лабораторный ротатор для смешивания растворов
Игла для подкожных инъекций (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Это часть показанного примера индивидуального коаксиального ноззеля.
Игла для подкожных инъекций (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416Это часть показанного примера индивидуального коаксиального ноззеля.
Высоковольтный источник питания постоянного токаГамма Высоковольтный исследовательскийES30
Сканирующий электронный микроскопFEINova 2300
Флуоресцентный микроскопZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA KitHycult BiotechHK321-02

Ссылки

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DCO2

Похожие статьи