Методическая статья

Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан

DOI:

10.3791/58945

⸱

7 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол, который сочетает в себе в пробирке нейроэндотелиальной системы ко-культуры и метаболического включения силогликан с биоортогональных функциональных групп для расширения первичных нейронных стволовых и прародителей клеток и этикетки их поверхности sialoglycoproteins для визуализации или масс-спектрометрии анализа маркеров поверхности клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронные стволовые и клетки-прародители (NSPCs) являются клеточной основой для сложных структур и функций мозга. Они расположены в специализированных нишах in vivo и могут быть изолированы и расширены in vitro,служа важным ресурсом для трансплантации клеток для восстановления повреждения мозга. Тем не менее, NSPCs являются неоднородными и не четко определены на молекулярном уровне или очищены из-за отсутствия конкретных маркеров поверхности клеток. Представленный протокол, о котором сообщалось ранее, сочетает в себе нейроэндотелиальную систему кокультуры с метаболическим методом маркировки гликанов для идентификации поверхности сиологликопротеом первичных NSPCs. Система сокультуры NSPC-эндотелиальной позволяет самообновлять и расширять первичные NSPCs in vitro,генерируя достаточное количество NSPCs. Sialoglycans в культурных NSPCs помечены с помощью неестественной сиалевой кислоты метаболического репортера с биоортогоналальных функциональных групп. Сравнивая сиалогликопеом из самообновляющихся NSPCs, расширенный в эндотелиальной кокультуры с дифференциацией нейронной культуры, мы определяем список мембранных белков, которые обогащаются в NSPCs. Протокол подробно включает в себя: 1) создание андотелиальной культуры НСПК и дифференциационную культуру НСПК; 2) маркировка с азидосахаром за О-ацетиляцию N-азидоацетилманносамина (Ac4ManNAz); и 3) спряжение биотина с модифицированным сиалогликаном для визуализации после фиксации нейронной культуры или извлечения белка из нервной культуры для анализа масс-спектрометрии. Затем кандидаты на обогащенные поверхностью кандидаты, обогащенные NSPC, отбираются путем сравнительного анализа данных масс-спектрометрии как из расширенных NSPC, так и из дифференцированных нейронных культур. Этот протокол очень чувствителен для определения мембранных белков низкого изобилия в исходных материалах, и он может быть применен к обнаружению маркеров в других системах с соответствующими модификациями

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронные стволовые клетки определяются как многопотентная популяция клеток, которые могут самообновляться для поддержания пула стволовых клеток и дифференцироваться в нейроны и глию. Они являются основными типами клеток в нервной системе и может предложить большой терапевтический потенциал в регенеративной медицине через пересадку клеток в больные и поврежденные мозги1,2. По мере развития популяция нервных стволовых клеток становится неоднородной3,4,а доля нервных стволовых клеток в головном мозге постепенно уменьшаетсяна 5. Вообще говоря, эмбриональные нервные стволовые клетки и другие нервные клетки-прародители, коллективно называемые нервными стволовыми и клетками-потоменками (NSPCs), расположены в зародышевых зонах, желудочковой зоне и субвентрикулярной зоне у мышей6. В эмбриональном мозге нервные стволовые клетки генерируют нейроны прямо или косвенно через промежуточные клетки-прародители (ИПК), а у некоторых видов через внешние субжелудочковые зоны прародителей (ОРГ)7,8. Специфическая молекулярная подпись, морфология, расположение в нише стволовых клеток и потенциал дифференциации определяют роль каждого подтипа в органогенезе мозга и клинических приложениях9. Однако имеющиеся в настоящее время маркеры поверхности клеток не могут однозначно дискриминировать и очищать различные подтипы NSPCs, ограничивая понимание и использование этих подтипов.

Идентификация первичных поверхностных маркеров NSPCs ограничена тремя основными препятствиями. Первый из них является ограниченное количество клеток NSPCs в ткани, что затрудняет подготовку образцов клеточного белка поверхности для общего анализа масс-спектрометрии. Вторым ограничением является трудность в производстве чистых подтипов клеток для генерации подтип-специфических данных мембранного белка. Наконец, третьей проблемой является низкое соотношение белков поверхности клеток в целых белках клеток, что затрудняет их чувствительность обнаружения с помощью анализа масс-спектрометрии.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали химиопротеомный подход к выборочноо обогащать и идентифицировать белки поверхности клеток в первичных NSPCs путем метаболически маркировки sialoglycoproteins10. Для создания достаточного количества NSPCs, мы воспользовались установленным протоколом для расширения и поддержания первичных эмбриональных NSPCs в недифференцированных состояниях in vitro, путем совместного культивирования NSPCs с мышью мозга эндотелиальных клеточных линий с использованием проницаемой поддержки матричная вставка(например, трансвелл) система11. В отличие от этого, NPSCs культивируется в одиночку без эндотелиальных клеток генерировать дифференцированное потомство11,12. Таким образом, образцы белков из этих двух систем культуры могут быть сравнительно проанализированы для выявления белков, которые дифференцированно выражены в NSPCs и дифференцированных нейронов. Поскольку большинство белков поверхности клеток модифицируются сиалевой кислотой13, неестественный сиалевой кислоты предшественник аналог N-азидоацетилманнозамин-тетраацилат (Ac4ManNAz) был использован для захвата внутренней метаболической пути так, что эндогенные, вновь синтезированные sialoglycans помечены группами азидо, генерации химической ручкой14. Через азидо-алкино-опосредованные биоортогональные реакции, которые спрягают биотин с силогликанами, белки поверхности клеток могут быть визуализированы и обогащены для протеомальной идентификации с помощью стрептавидидного фторофора или матрицы14.

Здесь мы выполняем анализ геля SDS-PAGE поверхности сиологликопротеома из NSPCs, расширенного в эндотелиальной кокультуры и дифференциирующих ячеек в не-кокультурной системе. Мы также избирательно очищаем поверхность силогликопеома в двух культурных системах для протеомического сравнения. Наш протокол, по сравнению с традиционными центрифугина на основе протоколов очистки поверхности клеток15, повышает эффективность экстракции за счет сокращения процедур экстракции поверхностного белка через конкретные спряжения тегов и сродство Очистки. Между тем, это увеличивает чистоту извлечения белков поверхности клеток на основе предпосылки, что сиилиляция происходит в основном на поверхности клеток белков. Хотя эндотелиальные факторы не могут полностью блокировать дифференциацию расширенных NSPCs, сравнительное исследование между совместной культурой и дифференцированной культурой обеспечивает удобный метод определения обогащенных стволовыми клетками поверхностных белков без необходимости анализировать белки из NPCs, очищенных FACS16. Мы считаем, что этот подход может быть применен к исследованиям поверхностных белков в других системах с соответствующими изменениями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены IACUC (Институциональный комитет по уходу за животными и использованию) Университета Цинхуа и выполнены в соответствии с руководящими принципами IACUC. Лабораторное животное в Университете Цинхуа было аккредитовано AAALAC (Ассоциация по оценке и аккредитации Организации по уходу за животными International). Для постановки эмбрионов, в середине дня вагинальной вилки определены был рассчитан как эмбриональный день 0,5 (E0.5).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки культивируются в клеточном инкубаторе в условиях 37 и 5% CO2.

1. Подготовка мыши эндотелиальной культуры в проницаемые вставки поддержки

ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки BEND3 поддерживаются в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Подготовка BEND3 клеточной среды (BM), добавив 50 мл FBS и 5 мл пенициллина-стрептомицина в 500 мл DMEM и хорошо перемешать.
  2. Аспирируй среду из тарелки и мыть культуры клеток BEND3 с 1 мл PBS один раз. Добавьте 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в клетки и инкубировать клетки в течение 4 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Добавить 1 мл БМ в клетки, чтобы нейтрализовать Трипсин-EDTA и пипетка вверх и вниз осторожно, чтобы полностью разъединить клетки. Перенесите суспензию клетки в новую коническую трубку 15 мл и гранулы центрифугированием при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин при 400 х г.
  4. Приготовьте супернатант из трубки и resuspend клетки с 9 мл свежего БМ, затем добавить 1 мл клеточной подвески в одну проницаемую опорную вставку. Добавьте еще 2 мл свежего БМ на скважину в нижней камере матрицы. Продолжайте культивировать клетки в течение одного дня.

2. Подготовка мыши Первичной Кортикальной NSPCs культуры

  1. Подготовка культуры пластины, папаин пищеварения среды, и корковых приверженцев культуры среды (AM)
    1. Пальто 6-колодцы пластины с поли-L-лизин (PLL) путем добавления 1 мл раствора PLL в хорошо в 6-колодные пластины. Затем инкубировать пластины на RT в течение 30 минут.
    2. Перенесите раствор PLL в коническую трубку длиной 15 мл. Вымойте тарелки 3 раза с двойной дистиллированной водой. Airdry пластин и положить их в сторону до использования.
    3. Подготовка папаин пищеварения среды, добавив 50 U папаина, 50 Л L L L-глютамин, и 50 л 100 мг/мл ацетил-L-цистеин в 5 мл DMEM. Смешайте среду кратко и разогреть его до 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут для активации фермента.
    4. Подготовка корковых клеток приверженец культуры среды (AM): добавить 500 л L L L-глютамин, 500 л пирувата натрия, 500 л 100 мг/мЛ N-ацетил-L-Цистеин, 500 Л N2, 1 мл B27, и 5 мЛ 100 мкг/м0. Смешайте среду хорошо и разогреть его до 37 градусов по Цельсию перед использованием.
  2. Подготовка первичных корковых клеток головного мозга и последующее покрытие
    1. Пожертвуйте E10.5 приурочен беременной мыши шейки матки дислокации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На E10.5, большинство клеток размножаются NSPCs в коре головного мозга, что приводит к большим клонам потомства в пробирке.
    2. Стерилизовать брюшной полости на 75% этанола. Используйте тонкие ножницы и микрозубные щипцы, чтобы открыть живот, разрезая кожу и лежащие в основе мышцы вдоль правой стороны средней линии. Выньте матку из брюшной полости осторожно с зубчатыми щипками и вырежьте ее из брюшной полости тонкими ножницами.
    3. Вымойте матку 40 мл предварительно охлажденных HBSS в 10 см Чашка Петри. Затем перенесите матку в новую 10-сантиметровую чашку Петри и снова промойте ее 40 мл предварительно охлажденных HBSS.
    4. Перенесите матку в новую 10-сантиметровую чашку Петри с 40 мл предварительно охлажденных HBSS. Удалить эмбрионы из матки и амниотической мембраны, а затем сократить головы эмбрионов от стволов с Jewelers microforceps.
    5. Вымойте головки с 40 мл предварительно охлажденных HBSS и передать головы на новый 10 см Петри блюдо с 40 мл предварительно охлажденной HBSS. Используйте Microforceps Jewelers, чтобы очистить кожу от кожи и хряща, покрывающих мозг, затем отрежьте кортики головного мозга и соберите их в конической трубке 15 мл с предварительно охлажденной HBSS.
    6. Пеллет кортики центрифугированием в течение 3 мин при 4 кв и 300 х г. Аспирировать супернатант из трубки, затем добавить активированный папаин пищеварения среды и 15 qL 4 мг /мЛ DNase I в ткани гранулы.
    7. Resuspend ткани гранулы кратко нежный вихрь. Инкубировать ткань при 37 градусах По цельсии в течение 30 мин. В течение этого времени, ослабить ткани путем краткого вихря каждые 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце пищеварения, не должно быть видимых частей ткани в трубке.
    8. Пеллеткорные клетки центрификацией в течение 10 мин при 4 кв и 450 х г. Приготовьте супернатант из трубки и промойте клеточные гранулы с предварительно охлажденным DMEM. Повторите этот шаг один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пищеварения и мытья, будьте осторожны, чтобы не пипетка тканей и клеточных гранул примерно, чтобы избежать повреждения клеток с сильной силой стрижки.
    9. Аспирировать супернатант из трубки затем добавить 1,5 мл предварительно охлажденных HBSS в трубку. Диссоциатив ныетические клетки гранулы на одиночные клетки с нежным пипеттингом. Подсчитайте номер ячейки гемоситометром.
    10. Добавьте 2 мл AM и 2 x 104 корковых клеток на 6-колодые пластины. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 3 ч, чтобы клетки прикреплялись к пластине.

3. Настройка нейронно-эндотелиальной кокультуры и системы маркировки Ac4ManNAz

  1. Через день после покрытия BEND3 ячеек в вставках, осторожно аспирируем среду в нижней камере, а затем вставки. Вымойте облицо вставки 3 раза с предварительно подогретых DMEM. Вымойте внешнюю поверхность вставок путем полоскания предварительно подогретых DMEM.
  2. Добавьте 1 мл предварительно разогретого АМ в одну вставку, затем перенесите вставки в колодцы с первичными корковыми клетками. Инкубировать со-культуру при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 12 ч.
  3. Растворите Ac4ManNAz в DMSO для достижения концентрации запасов 200 мМ. 12 ч после создания нейроэнделиальной кокультуры добавьте 1 зл ac4ManNAz на нижнюю камеру и 0,5 л акций на одну вставку в со-культуру. Встряхните тарелки сразу и осторожно, чтобы смешать среду хорошо. Для контрольных ячеек добавьте равный объем DMSO.
  4. Культура клетки в течение еще 5 дней при 37 кС и 5% CO2. Подготовка AM с 10x bFGF как кормление среды (RM). В течение этого времени, добавить 100 л РМ на вставку и 200 Л Л РМ на нижнюю камеру, чтобы перекормить эндотелиальных и нервных клеток через день. Во время кормления, не поставляются Ac4ManNAz или DMSO в культуру.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание сиалогикопротеинов в Расширенные первичные NSPCs и дифференцированные нейроны

  1. Подготовка BTTAA-CuSO4 комплекса 1 30x запас, содержащий 1,5 мм CuSO4 и 9 мм BTTAA в двойной дистиллированной воды. Приготовьте свежеконюгбитовый буфер 1, содержащий 50 мкм биотин-алкин, аскорбат натрия 2,5 мм и комплекс 1x BTTAA-CuSO4 в PBS.
  2. Удалите вставки из пластин совместной культуры. Аспирируйте среду культуры из нижних колодцев и мыть нервные клетки один раз с предварительно разогретым PBS.
  3. Аспирируй PBS из скважин. Добавьте 1 мл предварительно охлажденных 4% параформальдегида PBS раствор а также в клетки и исправить клетки на RT в течение 10 минут. Затем промыть клетки 3 раза с предварительно охлажденной PBS.
  4. Аспирировать PBS из скважин и добавить 1 мл свежеприготовленного биотина-конъюгированного буфера 1 на хорошо в клетки. Инкубировать клетки на RT в течение 10 мин.
  5. Призадыхайный буфер реакции из скважин. Вымойте клетки 3 раза с ПОМОЩЬю PBS. Подготовьте окрашивание буфера, содержащего 1% FBS и 1 мкг/мл Alexa Fluor 647-стрептавидин. Добавьте 1 мл окрашивающего буфера на хорошо в клетки и инкубировать клетки на RT в течение 30 минут.
  6. Призадыхать окрашивающий буфер из колодцев и промытых клеток 3 раза с предварительно охлажденной PBS. Подготовьте блокирующий буфер, содержащий 5% BSA и 0,3% неионического моющего средства-100 в PBS. Добавьте 1 мл блокирующего буфера на скважину в клетки и инкубировать на RT в течение 10 минут.
  7. Подготовьте основной антитело, разбавив анти-нестхин и анти-тбулулин III антитела вместе в блокирующий буфер в соотношениях 1:20 и 1:1,000, соответственно. Удалите блокирующий буфер из скважин и добавьте 1 мл первичного раствора антитела в скважины. Инкубировать клетки при 4 градусах Цельсия в течение ночи.
  8. Удалите основной раствор антитела из скважин. Вымойте клетки 3 раза с предварительно охлажденной PBS. Подготовка вторичного решения антитела путем разбавления Alexa Fluor 488 коза анти-мышь IgG1, Alexa Fluor 546 коза анти-мышь IgG2b, и DAPI вместе в блокирование буфера при разбавлении 1:1,000. Аспирировать PBS из скважин и добавить 1 мл вторичного раствора антитела в хорошо в клетки. Инкубировать клетки на RT в течение 2 ч.
  9. Аспирируй раствор антител из колодцев и мыть клетки 3 раза с предварительно охлажденной PBS. После этого клетки готовы к захвату изображения.

5. Очистка сиалогикопротеинов от расширенных первичных NSPCs и дифференцированных нейронов

  1. Подготовка BTTAA-CuSO4 комплекса 2 15x запас, содержащий 1,5 мм CuSO4 и 3 мм BTTAA в двойной дистиллированной воды. Подготовка буфера повторной подвески белка А, содержащего 4% SDS и 10 мМ EDTA в двойной дистиллированной воде; белок resuspension буфер B, содержащий 150 мм NaCl, 50 мм триэтаноламин, и 1% полиоксиэтилен олеил эфир (например, Brij97) в двойной дистиллированной воды с рН 7,4. Перед использованием смешайте буфер A:buffer B 1:8 (vol/vol), чтобы подготовить полный буфер повторной протеин. Подготовка белка стиральный буфер 1, содержащий 2% SDS в PBS; белковый буфер для мытья 2, содержащий 8 м мочевины в 250 мМ бикарбонат аммония (ABC); и буфер промывки 3, содержащий 2,5 M NaCl в PBS.
  2. Удалите вставки из пластин совместной культуры. Аспирируй среду культуры из нижних колодцев и мыть нервные клетки один раз с предварительно охлажденной PBS.
  3. Аспирировать PBS из скважин и добавить 200 л предварительно охлажденных буфера RIPA на хорошо в пластины. Инкубировать пластины на льду в течение 5 мин. Соберите белковый лисис в трубки 1,5 мл. Пеллеты клеточного мусора центрифугированием в течение 10 мин при 4 кв кв и 12000 х г.
  4. Перенесите супернатант в новые трубы длиной 1,5 мл. Определить концентрацию белка с комплектом BCA в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 1 мг/мл.
  5. Добавьте 100 мкм алкин-биотина, аскорбат натрия 2,5 мм и 1x BTTAA-CuSO4 комплекса 2-1 мл белкового лиза и хорошо перемешайте раствор. Инкубировать смесь на RT для 1 ч.
  6. Перенесите реакционный раствор в 20 мл предварительно охлажденного метанола в конической трубке 50 мл. Хорошо перемешать и инкубировать при -30 градусов на ночь, чтобы осадок белков.
  7. Пелле белок осаждает центрифугирование в течение 15 мин при 4 градусах и 4500 х г. Вымойте протеиновые гранулы дважды с 20 мл предварительно охлажденный метанол. Аспирируй супернатант из трубки. Отостановите протеиновые гранулы с 4 мл буфера повторного протеина и перенесите отсрочку белка в новую коническую трубку 15 мл.
  8. Возьмите 50 л стрептавидина бусин и мыть их 3 раза с PBS. Добавьте промытые бусины в белковую отсрочку. Инкубировать раствор при 4 градусах по Цельсию на 3 ч на вертикальном ротаторе со скоростью вращения 20 об/мин.
  9. Вымойте бисер последовательно с 6 типами буферов: белок стиральный буфер 1, буфер промывки белка 2, буфер промывки 3, 0,5 М ABC, 0,25 M ABC и 0,05 M ABC.
  10. После мытья, resuspend бусинки с 20 Л ПБС и передать бисер в новую трубку 1,5 мл. Добавьте 20 qL 2x буфера загрузки белка в бусы и обработать при 95 градусах По Цельсия в течение 10 минут. Образцы белка должны быть подвергнуты SDS-PAGE и окрашены Coomassie блестящий синий R-250 в соответствии с инструкциями производителя. Вырезать белки в гель, как указано Coomassie блестящий синий R-250 для анализа масс-спектрометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вся процедура расширения in vitro и метаболической маркировки первичных эмбриональных NSPCs занимает 6 дней(рисунок 1A). Качество линии ячейки BEND3 и недавно изолированных первичных NSPCs являются ключом к успешному эксперименту. Клетки BEND3 являются источником растворимых факторов, стимулирующие самообновление и распространение NSPCs. Следует обеспечить, чтобы клетки BEND3 были свободны от какого-либо загрязнения и активно делятся с минимальной гибелью кле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поверхностные маркеры обычно используются для маркировки и очистки определенных типов клеток in vitro и in vivo17,18. Открытие поверхностных маркеров вносит значительный вклад в регенеративную медицину и исследования стволовых клеток, предоставляя молекулярные инструменты для выборочного обогащения популяции стволовых клеток от нормальных или патологических тканей и культурных блюд, предлагая очищенную клетку ресурс для клинического использования или изучения био...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1B, 1C, 1E и 1F воспроизводятся на Бай и др. . 10 Лет с разрешения Королевского общества химии. Мы благодарим И Хао в лаборатории X. C. для редактирования фигур. Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (No 91753206 до З. С. и Х. К., No 31371093 до З. С., и No 21425204 и 21672013 до X. C.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BEND3ATCCCRL-229
DMEMGibco11960044
L-глутаминGibco250300811%
пируват натрияSigmaP52801%
N2 добавкаGibco17502048от 1 до 100
N-ацетил-L-цистеинSigmaA72501 мМ
папаинWorthingtonLS00372610 Ед/мл
Добавка B27Gibco175040441 до 50
Поли-L-лизинSigmaP4707
Основной фактор роста фибробластовGibcoPHG026110 нг/мл
Пенициллин-стрептомицинGibco151401221%
Фетальная бычья сывороткаGibco1009914110%
HBSSGibco14175095
Tripsin-EDTA, 0,25%Gibco25200056
DPBSGibco14190094
TranswellCorning3450
параформальдегидсигма1581274%
сахарозысангонA100335
DAPIGibco62248
Буфер RIPAThermo Scientific89900
SDS-PAGE загрузочный буфер 2xSolarbioP1018
6-луночный планшетCorning3335
Трис-Глицин протеингель invitrogenxp00100box
Мышиный моноклональный анти-НестинИсследование развития Hybridoma BankRat-4011 до 20
Мышиный моноклональный анти-бета-тубулин IIISigmaT88601 к 1 000
Alexa Fluor 488 козий анти-мышиный IgG1инвитрогенA-21121от 1 000
Alexa Fluor 546 козий анти-мышиный IgG2bинвитрогенA-211431 до 1 000
Альбумин крупного рогатого скота VAmresco0332
Triton X-100Amresco0694
BCA набор для анализа Thermo Scientific23225
ДиметилсульфоксидSigmaD2650
Brij97АладдинB129088
CuSO4Sigma209198
алкин-биотинClick Chemistry ToolsTA105
BTTAAClick Chemistry Tools1236
Ac4ManNAzИнструменты для химии клика1084100 & микро; M
9AzSiaсинтезирован в лаборатории
аскорбат натрияSigmaA4034
МетанолSigma34860
ЭДТАСангонA100322
NaClСангонA100241
SDSСангонA100227
Alexa Flour 647-конъюгированный стрептавидинinvitrogenS21374от 1 до 1,000
ТриэтаноламинСигмаV900257
Dynabeads M-280 Стрептавидин invitrogen60210
Бикарбонат аммонияSigma9830
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278
ИзофлуранRWD Life Science Co.970-00026-00
ДНКаза IсигмаDN2512 и микро; г/мл
мочевиныSigmaU5378

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365(2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи