В этом протоколе мы продемонстрировать как породы Астианакт гракл взрослых, поднять личинки и выполнять целом гора иммуногистохимия на пост личинок рыб для сравнения фенотипов поверхности и пещера Морфотипы.
Методическая статья
Повышение мексиканской Tetra Астианакт гракл для анализа Post-larval фенотипов и целом гора иммуногистохимии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Реки и пещеры адаптированных популяций Астианакт гракл показывают различия в морфологии, физиологии и поведения. Исследования сосредоточены на сравнении взрослых форм выявило генетическую основу некоторых из этих различий. Меньше известно о отличиях населения на пост личиночных стадиях (в начале кормления). Такие исследования могут обеспечить проницательность в как cavefish выжить до зрелого возраста в их естественной среде. Методы для сравнения развития после личинок в лаборатории требуют стандартизированных аквакультуры и кормления режимов. Здесь мы опишем, как привлечь рыбу на диете коловраток питательн-богатые люди в воде циркуляционные для до двух недель пост оплодотворения. Мы продемонстрируем собирать после личинок рыб из этого питомника системы и выполнять иммуноокрашивания целом гора. Иммуноокрашивания является привлекательной альтернативой трансген выражение анализа для изучения развития и функции гена в A. гракл. Питомник метод может также использоваться как стандартный протокол для установления соответствия плотности населения для роста в взрослых.
Введение
Мексиканский тетра, гракл Астианакт, является один вид рыб, который существует как река жилого популяций (поверхности рыбы) и ряд местонахождения троглофильных населения (cavefish) с именем пещеры, которые они населяют (т.е. Tinaja, Молино, Pachón). Растущее количество исследователей используют A. гракл расследовать генетические и развития основы поведенческих1,2,3,4, метаболические5,6 ,,78и морфологической эволюции9,10,11. Имеющиеся ресурсы для исследования A. гракл включают последовательности и аннотированный генома12; транскриптом13; развития промежуточной таблице14; методы для разведения15,16,17, создавая мутация18, и редактирования генов19. Распространение дополнительных инструментов и обновленные стандартные протоколы ускорит рост cavefish научно-исследовательского сообщества (см. Этот методы сбора20).
Наша цель – чтобы добавить существующие Справочника инструментов, обеспечивая надежный метод оценки гена деятельность на местах в постсоветском личиночной A. гракл, в аналогии между лабораториями. Есть две проблемы для достижения этой цели. Во-первых существует необходимость для стандартизированных режимов для штриховки и разведение рыбы между лабораториями, как различия в параметрах, таких как питание и плотность влияют на рост и созревание, таким образом влияющие на активность гена. Во-вторых существует необходимость для метода стандартизированных еще адаптированы для изучения моделей активности генов в постсоветском личинок рыб. Мы эти вопросы здесь, создания стандартной практики для разведение рыбы на пост личиночной стадии и внедрения надежной иммуногистохимия целом гора (IHC) протокол для оценки экспрессии генов в A. гракл.
Мы сначала продемонстрировать как развести рыбу через естественный нерест и идентифицировать оплодотворенных яиц. Описано далее, как Люк оплодотворенных яиц (личинки) и перенести их в питомник контейнеров, где они поддерживаются на плотность 20 рыб в контейнере в течение двух недель без рециркуляции или меняя воду. В 5-дневный пост оплодотворение рыба разработали после личиночной стадии (не имеющих желток питания) и предоставляются кормили водоросли Brachionus складчатое (коловраток) в качестве источника пищи питательн-богатые люди, которые не требуют ежедневного пополнения. Этот метод обеспечивает стабильный рост параметры для развития личинок и пост личинок.
Для оценки функции гена, мы демонстрируем как удалить рыбы из питомника контейнеров и выполнять IHC целом гора. IHC метод представил заимствован из протоколов, разработанных для использования с данио рерио21 и эффективна для изучения антигены во всех тканях A. гракл испытания, включая мозг, кишечника и поджелудочной железы. IHC является более быстрой альтернативой создания трансгенных животных для изучения экспрессии генов и белков локализации. Этот протокол будет полезным для исследований, направленных на рост A. гракл и сравнивая фенотипов поверхности рыбы и cavefish на пост личиночных стадиях.
Протокол
Процедуры, описанные в этот протокол были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) при Гарвардской медицинской школе.
1. Разведение
Примечание: Существует несколько опубликованных методов для разведения15,16,17,20 , которые также могут быть использованы на этот шаг. Перед селекции, взрослых рыб ведутся на 10:14 свет: темные цикла при 23 ° C и откармливаются Пелле (см. таблица материалов) один раз в день. Рыбы могут быть разводят в рециркуляционные системы с механической фильтрации и УФ стерилизации. Разведение также может быть достигнуто в статические (без рециркуляции) танков, но рыбы не следует оставлять в статической танк для более чем 3 дней, как быстро ухудшает качество воды.
- Заполнить бак 5 gal с водой рыбы готовые (дехлорированию воды, с учетом: рН = 7.1 + / 2, проводимость = 900 + / 150 мкс, температура = 23 ° C).
- Поставить пластиковые сетки (см. материалы) в нижней части бака. Если разведение в статических танков, аффикс подогреватель воды в сторону танка. Если разведение в системе рециркуляции, место подогреватель воды в колодце системы.
Примечание: Пластиковая сетка препятствует взрослых потребления яиц. - Место одна женщина и два мужчины A. гракл рыбы более чем 1 год в бак. Разрешить рыбу, чтобы акклиматизироваться на 30 мин.
- Установите температуру нагревателя до 24 ° C (или 1 ° C теплее, чем стартовой температуры).
- После 24 часов повышение температуры на 1 ° C.
- После 24 часов повышение температуры на 1 ° C. Проверьте танков ежедневно для яиц, светит фонариком в нижней части бака. Удержать рыбу от пищи в этот 3-дневный период.
- Если нереста не индуцированных после 3 дней, выключите прибор и дайте воде вернуться к комнатной температуре (RT) до переезда рыбы в их оригинального танка.
2. Кроме того, штриховку оплодотворенные яйца
- После того, как яйца определены в баке размножения, удалите взрослых и пластиковые сетки и уменьшить воду на глубину до 10 см, с помощью стакан или чашку.
Примечание: Чтобы оценить время нереста, используйте передачи пипетку поместить несколько яиц в чашку Петри и просматривать их с стереомикроскопом для определения стадии14 и оценить время оплодотворения. - Переместить танк удобную рабочую поверхность и удалите все непрозрачные яйца или калом, оставляя только полупрозрачные, плодородные яйца в баке.
Примечание: В это время может быть записано количество оплодотворенных яиц. - Заполните бак с рыбы готовые воды (см. шаг 1.1) и добавить 6-7 капель метиленового синего в бак, как вода наполняет.
Примечание: Конечная концентрация метиленовым синим — примерно 1,5 ppm. - Добавьте нагреватель и барботер аквариум (прилагается к воздушный насос, с регулятором) в бак.
- Установите обогреватель до 24 ° C и Отрегулируйте регулятор airstream производить нежный поток пузырьков.
- Поместите крышку на баке, чтобы помочь поддерживать температуру воды.
Примечание: Яйца следует начать штриховки в течение 24 часов время нереста.
3. Передача вылупившиеся личинки питомник контейнеров
- Добавить 20 г соли (см. материалы) до 8 L рыбы готовые воды (см. шаг 1.1) и перемешать до растворения. Заполните каждый контейнер питомник 1,5 Л (см. материалы) с 1 Л подготовленной воды.
- Используйте передачу пипетки для перемещения вылупившиеся личинки в подготовленных питомник контейнеры на плотность 20 рыб в контейнере.
Примечание: Фара может быть полезным для обнаружения и передачи вылупившиеся личинки. - После того, как были удалены все видимые вылупившиеся личинки, агитируйте воду в баке, помешивая, и/или пенообразующих струи воды в края и углы танка с пипеткой.
Примечание: Это поможет выявить личинки, которые были упущены на первом проходе. - Распоряжаться неиспользуемых личинок на данном этапе, с использованием руководящих принципов управления лаборатории благосостояния (OLAW). Добавьте гипохлорита натрия в бак для достижения окончательного 6,15% концентрации. Подождите по крайней мере 5 минут перед льется в раковину.
- Этикетке каждого контейнера питомник с указанием даты и время оплодотворения. Просмотреть контейнеры питомник ежедневно и продолжить удаление любых погибших личинок.
4. Подготовка на основе коловратки рыб
- Посмотреть Таблицу материалы информацию о получении коловраток. Выполните указанный протокол к устанавливать, поддерживать и урожай коловраток22.
- Подготовить рыбу пищи, добавив 3 мл смеси водорослей (см. Таблицу материалы) до 1 Л заготовленной коловраток. Эта смесь добавляется непосредственно в питомнике контейнеры снабжения продовольствием.
5. питание после личинок рыб
- Когда рыба что 5 дней после оплодотворения (dpf), добавьте 3 мл корма для рыб (подготовленных на шаге 4.2) для каждого контейнера, питомник. При оптимальной плотности коловраток должны быть видны в плотных группах на углах контейнеров, питомник и менее очевидными в центре контейнера. Добавьте дополнительные коловратки смесь, пока не будет достигнуто соответствующей плотности.
- Проверка контейнеров ежедневно на наличие коловраток и добавить больше, если концентрация получает истощены. Продолжить удаление любых погибших личинок.
- Когда рыбы достигают 14 dpf, переместите их в бак, подходят с системой рециркуляции на плотности 5 рыб/л воды.
Примечание: Количество выживших после личинок рыб могут быть записаны в это время.
6. всего гора иммуногистохимия пост личинок рыб
- Удалить после личинок рыб желаемого этапа от пищи в течение 24 ч, поливая питомник контейнер, содержащий рыбу через нейлон сетки сито и размещение ситечко в контейнер с водой чистой рыбы готовые (см. шаг 1.1).
Примечание: Важно, чтобы удалить все питание. Даже небольшое количество пищи в кишечнике авто люминесцентные и будут влиять на изображение. - Собирать и усыпить рыбы.
Примечание: Протокол эвтаназии должны следовать руководящим принципам OLAW и утвердил свой институциональный уход животных и использования Комитетом. Мы отметили, что tricaine только не усыпить пост личинок рыб и рыб начинают двигаться при передаче из tricaine фиксатором если рыба не также хранятся на льду.- Готовят раствор tricaine в стакан, добавляя 0.4 g tricaine-S и 0,8 г бикарбоната натрия 1 Л деионизированной воды и поместите его на льду.
- Залейте водой, содержащей рыбы через сетчатый нейлон собирать рыбу. Аккуратно погружаться ситечко в ледяной решения Tricaine и оставить его на льду за 10 мин.
- Исправьте Усыпленных рыбы.
- Используйте передачу пипетки с наконечником, вырезать для передачи рыбы Конические трубки.
- Удаление решения Tricaine с передачей пипетки и Замените фиксатор. Проинкубируйте с качания.
Примечание: Фиксатор и фиксация времени должен определяться на основании антитела, используемые. 10% раствор формалина (4% формальдегида, просмотреть материалы) на ночь при 4 ° C для антител, перечисленных в Таблица материалов.
Предупреждение: Формалин токсичными и легковоспламеняющимися. Носить средства индивидуальной защиты (перчатки, лаборатории пальто и всплеск очки) и обрабатывать в химические вытяжки. Растворы, содержащие формалин должны удаляться как опасные отходы. - Используйте передачу пипетки для осторожно снимите фиксатор не нарушая рыбы. Добавить 3 мл фосфата буфер солевой раствор Тритон решение [PBS с 0.1% Тритон (PBST), смотрите материалы] и Инкубируйте 15 мин на RT с качания.
- Удаление PBST и замените свежим PBST и инкубировать на 15 мин повторить это «стирка» одно дополнительное время.
Примечание: Рыба может храниться в PBS, содержащие азид натрия 0,02% при температуре 4 ° C на несколько недель.
- Выполните иммуноокрашивания целом гора.
- Подготовка 50 мл блокирования решения [PB-0.5% Тритон X, 0,2% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 1% диметилсульфоксида (ДМСО), азид натрия 0,02%, 5% сыворотки осел].
Предупреждение: Азид натрия и ДМСО являются токсичными. Средства индивидуальной защиты (перчатки, лаборатории пальто и всплеск очки) должны использоваться при обработке. Любые решения должны удаляться как опасные отходы. - Используйте передачу пипетки для передачи рыбы 4 мл стеклянный флакон с винтом верхней крышкой. Использование пипетки передачи для удаления PBST и добавить 3 мл, преграждая разрешение. Инкубируйте 1 час на RT с качания.
- Использование пипетки передачи Удалить блокирующий решение и добавить основное антитело, разбавленный преграждая разрешение. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре с перемешиванием.
Примечание: К примеру, добавить разведение 1: 250 анти ЮК/HuD нейрональных белков мыши моноклональные антитела (см. Таблицу материалы список антител, которые были успешно использованы в A. гракл). Набор рыб с не основное антитело добавил должны быть включены на этом шаге. Количество антител должно быть достаточно для покрытия рыбы и агитации. - Промойте рыбу 3 раза с PBST, как описано в шаге 6.3.4. Замените PBST на вторичные антитела, разбавленный преграждая разрешение и Инкубируйте на ночь на RT с перемешиванием.
Примечание: Концентрации оптимальных первичных и вторичных антител, время инкубации и температуры инкубации должна определяться для каждого антитела. Ночевка в РТ было эффективным для антител, перечисленных в Таблице материалов. - Промойте рыбу 3 раза с PBST, с каждого мытья, продолжительностью 15 мин, как описано в шаге 6.3.4.
- Передача рыбы в PBS для краткосрочного хранения перед рассечения, монтаж, или секционирование рыбы.
- Подготовка 50 мл блокирования решения [PB-0.5% Тритон X, 0,2% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 1% диметилсульфоксида (ДМСО), азид натрия 0,02%, 5% сыворотки осел].
Результаты
Таблица 1 показывает успех в течение одного года размножения поверхности рыбы и Tinaja, Молино и Pachón cavefish в цистернах статических размножения. Поверхность и Pachón нерестится с оплодотворенной всегда зародышей вылупились личинки, в то время как Molino и Tinaja были неудачными, некоторое время (2/6 и 2/18, нереста события не производят вылупившиеся личинки, соответственно). Есть различия в размере сцепления, как представляется, не объяснить возраст рыбы родительского. Таблица 2 показывает общее количество вылупившиеся личинки, результатом некоторых из нереста событий и возраст рыбы родительского. В целом, мы обнаружили, что поверхности рыбы производят наибольшее количество личинок на икру (средняя 1550 ± 894, n = 5), а затем Pachón (средняя 879 ± 680, n = 6), Tinaja (среднее ± 570 373, n = 11) и Молино (средняя 386 ± 276, n = 3). Количество личинок производится обычно больше, чем необходимо на эксперимент или для роста в взрослых. Мы обычно созданы 6-18 питомник контейнеры (120-360 личинки) и усыпить оставшихся рыбы.
Чтобы измерить успех Протокола питомника мы записали количество вылупившиеся личинки и выживших после личинок рыб от успешного нереста событий. Таблица 3 показывает данные от 1 месяца разводить в рециркуляционных танков и включает в себя количество личинок, переданы питомник контейнеры, которые дошли до 14 dpf. В течение этого месяца выживаемость варьировались от 41-81%, что приводит к 65-293 рыбы доступны на населения для экспериментов или роста в взрослых.
Чтобы определить, если иммуноокрашивания целом гора является успешным, мы сравнили флуоресценции образцы инкубировали с основное антитело для тех, кто инкубировали с вторичное антитело только. Флуоресцентного сигнала видна только в рыбе, инкубировали с основное антитело. Мы использовали этот протокол для успешно нейронов10 (рис. 1) и клеток поджелудочной железы6 label на этапах до 12,5 dpf в обе поверхности и пещера Морфотипы.
Рисунок 1: маркировка нейрон. Целом гора иммуноокрашивания из A. гракл. Изображение 12,5 dpf поверхности рыбы () и Pachón cavefish (b). Изображение области середине тела [насиженным желтой канве, показано в (a) и (b)] поверхности рыбы (c) и Pachón cavefish (d) окрашенных с Пан нейронов антитела (Ху). (e) Confocal образ региона поверхности рыбы кишки показаны кишечных нейронов (Ху) и их прогнозов (ацетилированный тубулин). Для этого изображения кишечника был расчлененный и монтируется в среде, содержащей DAPI пятно ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| населения | попытки | нереста события | муфты |
| поверхность | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Таблица 1: резюме данных из одного года селекции A. гракл в статических танков. Количество размножения попыток, нереста события, в результате и количество нереста события, которые произведены вылупившихся личинок.
| населения | возраст родителей | Вылупившиеся личинки |
| поверхность | 1 год | 989 |
| поверхность | 1 год | 1050 |
| поверхность | 3-х лет | 2214 |
| поверхность | 3-х лет | 432 |
| поверхность | 3-х лет | 1768 |
| поверхность | 4 лет | 2852 |
| Pachón | 1 год | 1194 |
| Pachón | 1 год | 1933 |
| Pachón | 1.5 года | 371 |
| Pachón | 3-х лет | 480 |
| Pachón | 4 лет | 1190 |
| Pachón | 4 лет | 110 |
| Tinaja | 9 месяцев | 259 |
| Tinaja | 9 месяцев | 253 |
| Tinaja | 10 месяцев | 1100 |
| Tinaja | 11 месяцев | 857 |
| Tinaja | 1 год | 713 |
| Tinaja | 1 год | 853 |
| Tinaja | 1 год | 542 |
| Tinaja | 1.5 года | 360 |
| Tinaja | 1.5 года | 58 |
| Tinaja | 1.5 года | 1100 |
| Tinaja | 4 лет | 185 |
| Molino | 2,5 года | 460 |
| Molino | 2,5 года | 619 |
| Molino | 3-х лет | 81 |
Таблица 2: приблизительная женский возраст и количество вылупившиеся личинки из отдельных нереста событий из указанных населения A. гракл.
| населения | попытки | нереста события | муфты | Размер муфты | Личинки переданы питомник чашки | После личинок рыб на 14dpf | выживание (%) |
| поверхность | 4 | 3 | 2 | 576 и 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Таблица 3: сводка данных из одного месяца племенных A. гракл рециркуляционные системы и повышение личинки. Количество разведение попытки, в результате чего нереста события, муфты, производимых вылупившиеся личинки, среднее количество личинок за сцепление, личинки, переданы в питомник контейнеров и пост личинок рыб находящихся в контейнерах питомник после 14 дней.
Обсуждение
Сравнивая активность генов между поверхностью и пещера A. гракл требует тщательно контролируемых параметров окружающей среды и методов, которые могут реплицироваться лаборатории. Наш протокол для повышения A. гракл обеспечивает последовательное питательности во время развития после личинок. После этого режима кормления функции гена можно уверенно сравнить между населением, с использованием протокола надежные иммуногистохимии, которую мы представляем. Здесь мы обсуждаем значение этого метода, а также его ограничения и будущих приложений.
Для достижения соответствия плотности роста, мы обнаружили, что пост личинок рыб может быть поднят без рециркуляции воды на две недели в 1,5 Л контейнеров на диете коловраток. Этот протокол также может использоваться для повышения рыбы на систему рециркуляции; Однако коловраток необходимо добавить ежедневно компенсации для тех, кто потерял через отток танк. Только что вылупившихся науплий артемии обычно используются в качестве источника пищи в аквакультуре, но мы обнаружили, что использование коловраток имеет значительные преимущества, в том числе: снижена цена, совершенствование биозащиты, последовательного питания и улучшения качества воды (см. ниже).
Во-первых Недельная стоимость в расходных материалов составляет 4 долларов для коловраток, по сравнению с 14 долларов для артемии. Что касается биологической безопасности, коловраток выращиваются в лаборатории в контролируемых условиях, в то время как артемии собраны из дикой природы и естественной видоизменяться в микробной или патогена содержание23. Кроме того питательный состав науплий артемии экологически решимости и поэтому непоследовательными. Хитиновой процветают на их собственные магазины энергии после вылупления; они быстро теряют питательную ценность, как они развивают и оптимально должны подаваться с рыбой в течение нескольких часов. Артемия начать кормление в 12 доме после вылупления, представляющие в первый раз, что они могут обогащаться питательно; Однако на этом этапе они стали слишком большими для 5 dpf рыбы, чтобы потреблять. В сравнении коловраток непрерывно питаются морских водорослей, что приводит к высоким содержание питательных веществ, независимо от того, когда собирают коловраток. Коловраток гораздо меньше, чем Artmeia хитиновой (160 - 400 мкм), что делает их легче для рыбы, чтобы захватить и глотать. После личиночной поверхности рыбы и cavefish потребляют коловраток в аналогичных количествах, предполагая никакой разницы в предпочтения или возможность захвата коловраток10.
Наконец науплий артемии начинают умирать в пресной воде несколько часов после того. Недоеденные хитиновой будет распадаться, стремительно уменьшается качество воды, если они не будут удалены вручную. Удаление мертвых Артемия является длительным и опасным для пост личинок рыб, не намного больше, чем артемии и могут быть случайно удалены или ранения. Коловраток может бесконечно жить в контейнерах питомник и давать пищу для рыб во все времена без значительно влияния на качество воды.
Хотя с помощью коловраток, как источник питания имеет значительные преимущества, для поддержания запасов, водоросли коловратки необходимо добавить к системе культуры ежедневно. Это может быть достигнуто с автоподатчиком, который распределяет жидкость водорослей в контейнер культуру коловратки (см. Таблицу материалы). Коловраток должны также быть найденным этой настройки каждые 24-48 часов для поддержания здоровья культуры. Исследователи, которые породы рыбы очень редко (раз в год, например) и не касается сравнений между населением после личиночной стадии могут предпочесть Артемия как источник пищи, так как осумкованного эмбрионы могут быть вылупившихся в любое время.
Мы рекомендуем отслеживать количество насиженными и живых личинок для наблюдения за успех вылупления и роста. Если большинство эмбрионов или личинок умереть, это может быть связано бактериальной или грибковой загрязнения. Рекомендуется контролировать качество воды воды, рыба готовые и стерилизовать любого оборудования с 70% этиловом спирте. Питомник контейнеры могут использоваться повторно, после того, как их чистить и стерилизовать. Для сведения к минимуму риска заболеваний, важно также, чтобы удалить любой мертвой рыбы из питомника контейнеров и не добавлять коловраток до 5 dpf, когда рыбы начинают питаться.
A. гракл половозрелыми примерно один год старый. Это ограничение для создания трансгенных A. гракл по сравнению с данио рерио (данио рерио), способны размножаться в 10-12 недель24. Иммуногистохимия (IHC) является альтернативный метод для изучения экспрессии генов и белков локализации. Протокол, описанные здесь могут быть адаптированы на каждом шагу и используется для выявления антигенов в любой ткани интерес. Важно отметить, однако, что некоторые ткани могут быть более трудно визуализировать в поверхности рыбы из-за пигментации (барьер, который не существует в непигментированные cavefish), которая может повлиять на толкование сравнительных исследований. Для решения этой потенциальной проблемы, поверхности рыбы пигмент может беленой после фиксации с помощью 3% перекиси водорода.
IHC требует успешного ткани фиксации, блокировки и антитела проникновения. Методы для каждой зависимости от ткани и протеина интереса. Фиксатор и фиксация времени должны сохранить клетки архитектуры при сохранении эпитопов антигена. Для этого протокола мы используем сшивки фиксатором (параформальдегида) и опустить денатурируя фиксатором (например, метанол или ацетона). Мы обнаружили, что инкубации в ацетоне уменьшается сигнал антитела для маркеров нейрональных и поджелудочной железы. Блокирование шаг имеет важное значение для предотвращения антител от привязки непромысловых белков в ткани. Этот метод использует комбинацию нормальной сыворотки (5%) и BSA (0,2%) в решении блокировки. Блокирующие решение содержит антитела и белками, которые связывают с реактивной сайты на белки в ткани, снижение неспецифической привязки первичных и вторичных антител.
Для достижения антитела проникновения, ткани должны быть permeabilized. Это может быть достигнуто с моющими средствами или денатурируя растворителей, но должны быть оптимизированы для сохранения эпитопов антигена. Наш протокол использует комбинацию Тритон и этанного сульфоксида (ДМСО). Тритон ДМСО включены и во время блокирования и Антитело инкубации шаги в концентрации 0,5% и 1%, соответственно. С помощью этой концентрации, мы наблюдали пятнать в мозг, поджелудочной железы, кишечника и мышц, предполагая, что это скорее всего эффективен для проникновения всех тканей. Размер рыбы могут также влиять проникновения. Этот протокол не был протестирован на рыб, больше, чем 14 дней (около 7 мм в длину). Для устранения неполадок на окрашивание, рекомендуется изменить шаги проникновения фиксации, блокировки и антитела. Важно также изучить последовательность сохранения immunogen с A. гракл протеина интереса, используя доступные генома25.
A. гракл является прекрасной моделью для изучения эволюции как населения того же вида, которые превратились в резко различных средах может сравниться непосредственно в лаборатории. Стандартные животноводства протоколы, как внутри, так и среди лабораторий, важны для понимания биологических различий между поверхности рыбы и cavefish. Наша статья предоставляет метод для изучения развития и активность гена в пост личинок рыб подвержены параметрами последовательного роста.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья [HD089934, DK108495].
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| метиленовый синий | Kordon | B016CBHZUS | противогрибковый |
| обогреватель | Finnex | 4711457836017 | 100 Вт Цифровое управление |
| airstone | Lee's Aquarium & Товары для домашних животных | 10838125202 | одноразовая воздушная каменная |
| соль | Instant Ocean | 51378014021 | Морская соль |
| питомника | IPC | 21545-002 | 40 унций или 1,5 л прозрачные контейнеры |
| для переноса пипетки | VWR | 414004-002 | пластиковые пипетки для луковиц |
| компактная культуральная система (CCS) стартовый набор с Brachionus plicatilis (L-тип) коловратки | Reed Mariculture | na | корм для рыб |
| RGcomplete | APБрид | 817656016572 | бутылка корма для коловраток на 32 унции |
| Программируемый автоматический дозирующий насос DP-4 | Jebao | DP-4 | автоматическая кормушка для коловраток |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | обезболивающий для рыб |
| бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S5761-500G | для триканового раствора |
| нейлоновая сетка сетчатый фильтр | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | диаметром 3 дюйма |
| , нейтральный буферный, 10% | фиксатор | Sigma-Aldrich | HT501128-4L |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | буфер, разбавить до 1X с использованием дистиллированной воды |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | моющее средство |
| азид натрия | Sigma-Aldrich | S2002-25G | антибактериальный |
| бычья сыворотка альбумин | Sigma-Aldrich | A9647-100G | блокирующий реагент |
| стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой | 4мл Wheaton | 224742 | окрашивающий флакон |
| пластиковая сетка сита для селекционного бака | Pentair | N1670 | Разрезанный на прямоугольник на 6мм больше по всем краям, чем размеры дна племенного танка. Вырежьте квадрат толщиной 6 мм из каждого угла прямоугольника. Загните края сетки вниз по всем четырем краям. Поместите пару магнитов с виниловым покрытием диаметром 6 мм с обеих сторон (сверху и снизу) сетки на каждом углу. Экран должен быть максимально плотно прилегать к бортам бака. Сетку можно снять с емкости с помощью металлической сетки для рыбы. |
| Дисковые магниты с виниловым покрытием | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A гранулированный корм для рыб | New Life International | na | Adult fish food. Список розничных продавцов этого продукта доступен на веб-сайте компании |
| Antibodies | |||
| insulin антитела из морской свинки | Dako | A0564 | 1:200 |
| антитела к глюкагону от овец | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| антитела к ацетилированному тубулину от мыши | Sigma | T6793 | 1:500 |
| антитела HuD/HuC от мышиный | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| антитело к синтазе оксида азота (nNOS) из кролика | Abcam | ab106417 | 5μ г/мл |
| холинацетилтрансферазы (ChAT) из кролика | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| сератонина (5HT) из кролика | Immunostar | 20080 | 1:500 |
Ссылки
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189(2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877(2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659(2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370(2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
Перепечатки и разрешения
