Методическая статья

Хроматин ИммунопрецитатА Ассасси использованием микрококковой nucleases в клетках млекопитающих

DOI:

10.3791/59375

⸱

10 мая 2019 г.

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроматин иммунопрецитисцией (ЧИП) является мощным инструментом для понимания молекулярных механизмов регуляции генов. Тем не менее, метод включает в себя трудности в получении воспроизводимого фрагментации хроматина с помощью механической стрижки. Здесь мы предоставляем улучшенный протокол для проведения анализа CHIP с использованием ферментативного пищеварения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы выразить клеточные фенотипы в организмах, живые клетки выполняют экспрессию генов соответственно, а транскрипционные программы играют центральную роль в экспрессии генов. Клетовая транскрипционная техника и его белки модификации хроматина координируют регулирование транскрипции. Для анализа транскрипционной регуляции на молекулярном уровне доступны несколько экспериментальных методов, таких как электрофоретический сдвиг подвижности, переходный репортер и хроматин иммунопреципция (ЧиП). Мы подробно описываем в этой статье измененный анализ CHIP из-за его преимуществ в непосредственном показе модификаций гистона и взаимодействия между белками и ДНК в клетках. Одним из ключевых шагов в успешном анализе CHIP является стрижка хроматина. Хотя sonication обыкновенно использован для стрижки chromatin, трудно определить воспроизводимые условия. Вместо того, чтобы стрижка хроматина путем звуковой, мы использовали ферментативное пищеварение с микрококковой нуклеазы (MNase), чтобы получить более воспроизводимые результаты. В этой статье мы предоставляем простой протокол анализов CHIP с использованием MNase.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выражение генов в клетках млекопитающих жестко и динамично регулируется, и транскрипция является одним из ключевых шагов. Транскрипция гена в основном регулируется транскрипционными факторами и гистонами. Фактор транскрипции является белком, который связывается с конкретными последовательностями ДНК и контролирует транскрипцию генов. Эти факторы либо способствуют или препятствуют набору РНК-полимеразы II (PolII), котораяинициирует синтез мРНК из геномной ДНК в качестве шаблона 1. Гистон модификации, такие как ацетилирование и метилирование остатков хвоста гистона положительно и негативно влияют на транскрипцию генов, изменяя структуру хроматина2. Поскольку изменения в экспрессии генов влияют на клеточный контекст, важно изучить молекулярные механизмы, с помощью которых регулируется транскрипция.

На сегодняшний день имеется несколько методов исследования регуляции транскрипции генов. Электрофоретическая мобильность сдвиг анализа (EMSA), также называемый гель сдвиг анализ, используется для анализа белка-ДНК взаимодействия3. Ядерный экстракт из интересных клеток инкубируется радиоактивным изотопом (например, 32P) с маркировкой ДНК-зондом и электрофоресом на геле полиакриламидов. Его авторадиограмма показывает, что ДНК-белковый комплекс мигрирует медленнее, чем зонд в геле. При наличии антитела к белку комплекс ДНК-белка-антитела мигрирует в гель медленнее, чем в ДНК-белковый комплекс. Эта сверхсмещенная полоса выявляет специфическую связывание между ДНК и белком. Тем не менее, EMSA определяет только специфическое взаимодействие ДНК-белка в системе, свободной от клеток, и поэтому остается неизвестным, контролирует ли взаимодействие транскрипцию в живых клетках. Переходный репортер ассси, обычно называемый luciferase репортер асссее, был разработан для решения регулировки экспрессии генов в клетках. Как правило, в репортерскую плазмиду вставляется ген ген, который временно трансгруппируется в клетки, и измеряется активность репортера. Разнообразие мутантов удаления позволяет идентифицировать регионы, которые отвечают за регуляцию генов. Несмотря на то, что анализ репортера является полезным инструментом для выявления транскрипционных факторов и связывания последовательностей ДНК, контролирующих транскрипцию, этот метод имеет большой недостаток в том, что репортер плазмида свободна от структуры хроматина и не отражает "реальные" транскрипционно-транскрипционном механизме. Кроме того, изменения в модификациях гистона не могут быть определены системой.

Развитие метода иммунопреципиции хроматина (ChIP) было основано на сообщениях Джексона и Чалкли о том, что «целая клетка» фиксации с формальдегидом сохранившейся хроматина структуры4,5. С тех пор, многие соответствующие методы были разработаны и улучшены6. В анализах CHIP клетки фиксируются формальдегидом, чтобы связать ДНК и белки. Хроматин фрагментируется, а затем иммунопроцелитируется антителами, представляющими интерес. Иммунный комплекс промывают, а ДНК очищается. Усиление ПЦР с помощью грунтовок, ориентированных на определенный регион генома, свидетельствует о заполняемости белков, представляющих интерес для генома.

Хотя CHIP является мощным инструментом для выявления взаимодействий белков, таких как транскрипционные факторы и модифицированные гистоны с ДНК, метод включает в себя некоторые трудности, такие как шаг фрагментации хроматина, на практике. Соникация широко используется для стрижки хроматина; однако определить воспроизводимые условия обременительно. Лечение микрококковой нуклеазой (MNase) является альтернативным методом стрижки хроматина. MNase является эндо-экзонуклеизом, который переваривает двуцепочечную, одноцепочечную, круговую и линейную ДНК и РНК. Относительно легко определить условия, в том числе количество хроматина и фермента, температуру и время инкубации, для оптимальной фрагментации хроматина. Мы изменили и упростили существующие протоколы, и мы создали простой и воспроизводимый метод. В этом документе содержится протокол для tIP-ассссссса с использованием MNase в клетках млекопитающих.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка реагентов

  1. Сделать 18,5% параформальдегида (PFA) раствор. Добавьте 0,925 г ПФА, 4,8 мл воды (использовать ультраочищенную воду на протяжении всего протокола) и 35 кЛ 1 М КНв в конической пластиковой трубке 50 мл. Закройте крышку плотно и нагрейте трубку в стакане 400-600 мл, содержащем около 200 мл воды с помощью микроволновой печи. Удалите трубку, прежде чем вода начнет кипеть и вихрь трубки для растворения PFA. Разрешить PFA остыть до комнатной температуры и хранить на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите нагревание и перемешивание до полного растворения PFA. Подготовьте решение PFA непосредственно перед перекрестным соединением (шаг 2.1.3).
  2. Сделать 1,25 М глицин решение. Растворите 14,07 г глицина в 150 мл воды и процедите через фильтр размером 0,22 мкм. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  3. Сделайте буфер lysis клетки CHIP. Растворите 378 мг PIPES, 10,6 мл 2 М ККЛ и 1,25 г разветвленной октилфенокси поли (этилененосокси)этанола в воде. Отрегулируйте рН до 8,0 с 1 М кН при 4 градусах Цельсия и сделать до 250 мл. Фильтр через фильтр размером 0,22 мкм и храните при 4 градусах Цельсия.
  4. Сделайте буфер пищеварения микрококковой нуклеазой (MNase). Чтобы сделать 1 мл, смешайте 0,1 мл 10-x mNase буфера пищеварения, 10 л 100-x раствора BSA, 10 л 0,1 М дитиотрейтол и 0,88 мл воды.
  5. Сделать 1 M NaHCO3. Растворите 4,2 г NaHCO3 в 50 мл воды и процедите через фильтр размером 0,22 мкм. Хранить при комнатной температуре.
  6. Сделать 10% сульфат атрия додецил (SDS). Растворите 5 г SDS в 50 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
  7. Сделайте буфер elution. Смешайте 15 зл 1 М NaHCO3, 15 л 10% SDS, и 120 л воды, чтобы получить 150 л буфера элютации для одного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объемов пропорционально в зависимости от количества образцов.
  8. Сделайте 3 M ацетат натрия (pH 5.2) раствор. Растворите 24,6 г ацетата натрия anhydrous в воде. Отрегулируйте рН до 5,2 с уксусной кислотой и составьте 100 мл. Фильтр через фильтр размером 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.

2. Определение условий пищеварения MNase

ПРИМЕЧАНИЕ: В шаге 2 протокола, примере использования VCaP, раковые клетки простаты человека представлены. Любые линии клеток млекопитающих могут быть использованы; см. Примечание на ступенях.

  1. Препарат перекрестного хроматина
    1. Поддержание клеток VCaP в глюкозе DME-высокой дополнился 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) при 37 градусах По Цельсия в инкубаторе двуокиси углерода. Семена VCaP клетки на 4 х 106 клеток в шесть 6 см блюда в 4 мл культуры средств массовой информации и культуры в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие культурные носители для каждой линии ячейки. До 10 х 106 клеток могут быть посеяны в 6 см или 10 см блюдо. Для взвешенных клеток, семенных клеток в T25 колбы. Количество блюд или колб зависит от количества доз проверены на пищеварение MNase. Если 4 дозы проверены, подготовить 6 блюд или колбы. Смотрите также шаг 2.2.
    2. Отсоедините клетки VCaP от одной тарелки с помощью трипсина и посчитайте клетку. Рассчитайте номер ячейки в одном блюде. Для взвешенных клеток, удалить небольшое количество клеточной подвески из одной колбы и рассчитывать номер ячейки.
    3. Добавьте 0,229 мл из 18,5% PFA к 6-сантиметровому блюду в 4 мл культурных носителей при окончательной концентрации 1%. Аккуратно, но тщательно закружить блюдо или колбу, чтобы равномерно распределить PFA. Инкубировать при комнатной температуре ровно 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе хроматин и белки пересекаются. Как PFA является токсичным, выполнять этот шаг в химический капот дыма и использовать надлежащее индивидуальное защитное оборудование.
    4. После 10 мин добавьте 0,47 мл раствора гличина 1,25 М при конечной концентрации 125 мМ. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицин нейтрализует избыток PFA, чтобы остановить дальнейшее перекрестное соединение.
    5. Аспир формальдегид /глицин/культура СМИ. Вымойте клетки, добавив 4 мл фосфат-буферного солья (PBS) дважды. Для подвесных клеток перенесите суспензию клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Призадыхать супернатант и добавить один средний объем PBS и полностью приостановить. Повторите этот шаг. Утилизировать жидкие отходы должным образом, так как они содержат формальдегид.
    6. Подготовка PBS, содержащий протеазы и фосфатазы ингибитор коктейль (PIC) путем добавления 1/100 том 100x PIC для PBS. Аспирировать PBS из блюда и добавить 1 мл на блюдо PBS, содержащий PIC. Очистите клетки и перенесите суспензию клетки в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Для подвесных ячеек просто перенесите подвеску на трубку 1,5 мл.
    7. Центрифуги трубки на 3000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы восстановить клетки гранулы. Удалите PBS полностью с помощью пипетки. Запись номера ячейки на трубку и хранить клетки гранулы на -80 градусов по Цельсию.
  2. Лизис клеток и пищеварение MNase
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем реагента в следующих шагах основан на одной трубке, содержащей 6 х 106 ячеек. Регулировка объема реагента пропорционально в зависимости от числа клеток; когда одна трубка содержит 2 х 106 ячеек, используйте 100 qL буфера лизиса ячейки CHIP (шаг 2.2.1), буфер пищеварения MNase (шаг 2.2.3), и буфер разбавления ChIP (шаг 2.2.5), и 10 qL 0.5 M EDTA (pH 8.0) (шаг 2.2.4).
    1. Оттепель хранимых клеточных гранул (клеток VCaP, содержащих 6 х 106 ячеек на трубку), подготовленных в шаге 2.1.7 на льду. Подготовьте буфер lysis ячейки CHIP, дополненный PIC, добавив 1/100 том 100x PIC в буфер. Добавьте 300 кЛ буфера лиза циза клетки CHIP, дополненного PIC, и тщательно приостановите гранулы. Вихрь трубки для 15 с и инкубировать подвеску на льду в течение 10 минут.
    2. Центрифуга при 9000 х г в течение 3 мин при 4 градусах по Цельсию и полностью удалите супернатант. Приостановите действие гранул в 300 кл.л буфера пищеварения MNase.
    3. Разбавить MNase (2000 гель единицы / QL) с MNase пищеварения буфера дать 50 единиц геля / Л. Добавить 0, 0,5, 1, 2, 4 л 50 геля единиц / L MNase к подвеске и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение ровно 10 мин, смешивая инверсии каждые 2,5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 показывает оптимальное количество MNase в нескольких клеточных линиях.
    4. Добавьте 30 юл 0,5 М EDTA (pH 8.0), чтобы завершить переваривание MNase и вихрь кратко. Инкубировать в течение 5 мин на льду. Центрифуга при 9000 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию и полностью удалите супернатант.
    5. Подготовьте буфер разбавления CHIP, дополненный PIC, добавив 1/100 том 100x PIC в буфер. Повторное увеличение гранул в 300 л буфера разбавления ЧИП, дополненного PIC.
    6. Сонифицировать подвеску на льду с помощью звукового сигнала, оснащенного микротиповым зондом. Используйте следующие условия звукования: амплитуда 2, обработанное время 15 с, пульс ON 5 s, пульс OFF 30 s. Возьмите 1 кЛ подвески и пятно на слайд стекла и наблюдать за ними с помощью микроскопа. Убедитесь, что структура ячейки почти сломана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1А показаны репрезентативные микрофотографии суспензии клеток VCaP до и после звуковой передачи. Этот шаг предназначен для высвобождения переваренных хроматин в супернатант, нарушая ядерные мембраны. Настройка питания должна быть скорректирована до менее 5% от максимальной мощности и попробуйте звукование в течение 5 с три раза с более чем 30-s интервал. Если контроль мощности доступен, отрегулируйте настройку мощности до 5 Вт и обработайте образцы для общего количества 15 с, как упоминалось выше, чтобы дать общую мощность 70-75 J. Проверьте, сломана ли структура ячейки, как упоминалось выше. Если этого недостаточно, повторите еще раз. Состояние, описанное выше, практически применяется ко всем клеточным линиям, проверенным.
    7. Центрифуга при 9000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию, перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку 1,5 мл и сохраните 20 л переваренных хроматина для ступени 2.3. Храните остаток при -80 градусах Цельсия.
  3. Обратная перекрестная связь, очищение ДНК и анализ переваренного хроматина
    1. Добавьте 75 л воды, 4 л из 5 M NaCl и 1 л протеиназа К в винтовую трубку 1,5 мл. Добавьте 20 зЛ переваренных хроматина из различных условий пищеварения MNase, приготовленных в шаге 2.2.7 к трубам, содержащим воду, NaCl и протеиназа K. Закройте крышку плотно, полностью перемешайте и инкубировать трубку при 65 градусах Цельсия за одну ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для удаления перекрестных связей между белком и ДНК.
    2. Подготовьте две микроцентрифуги 1,5 мл на состояние. Добавьте 100 кл л фенола: хлороформ:изоамилалкоголь (25:24:1) (PCI) в одну трубку 1,5 мл. Добавьте в другую трубку 10 зл 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2 Л л гликогена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование хлороформа:изоамилалкоголь не является необходимым7. Увеличение объема может привести к низкому восстановлению ДНК после выпадения этанола8.
    3. Centrifuge трубки, содержащие переваренный хроматин от шага 2.3.1 кратко и добавить 100 Зл Л PCI. Закройте крышку плотно, и вихрь энергично образуется эмульсия. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)для 30 с при комнатной температуре.
    4. Аккуратно возьмите верхнюю фазу, содержащую ДНК, и добавьте в трубку, содержащую PCI, подготовленную в шаге 2.3.2. Вихрь энергично и центрифуги трубки, как шаг 2.3.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нижняя фаза загрязнена, центрифуги трубки снова, или удалить большую часть нижней фазы во-первых, центрифуга трубки, и принять верхнюю фазу.
    5. Тщательно возьмите верхнюю фазу, описанную в шаге 2.3.4, и добавьте в трубку, содержащую ацетат натрия и гликоген, приготовленный в шаге 2.3.2. Добавьте 250 л этанола. Смешайте инверсией и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация раствора при комнатной температурене влияет на восстановление ДНК 8,9.
    6. Подтвердите гранулы на дне трубки. Тщательно удалите супернатант, чтобы не нарушить гранулы и добавить 500 зл 70% этанола. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Удалите супернатант полностью и высушите гранулы в течение примерно 5 минут при комнатной температуре. Растворите гранулы в 20 л из 10 мм Трис HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). Измеряйте концентрацию ДНК с помощью УФ-спектрофотометра.
    8. Смешайте 0,5 мкг ДНК с гель загрузки красителя и нанесите на 2% агарозный гель. Электрофориз пробы при 100 В в буфере трис-ацетат-ЭДТА до фиолетового красителя мигрировали в две трети геля и пятно гель с 0,5 мкг/мл бромистого этидия в течение 10 минут. Сфотографируй гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее о рисунке 2.

3. ХроматинИммунопреция

  1. Препарат переваренных хроматина
    1. Приготовь клетки. Для клеток адептов, семена 2-10 х 106 клеток на блюдо в 2 блюда (6 см или 10 см) на лечение группы и позволяют клеткам прикрепляться к нижней части блюд в течение более 1 дня. Для взвешенных клеток, семена в 2 T25 колбы на лечение группы. Относитесь к клеткам по желанию.
    2. Возьмите одно блюдо или колбу от каждой группы и подсчитайте номер ячейки, как описано в шаге 2.1.2. Подготовьте перекрестный хроматин, как уже упоминалось в шагах 2.1.3-2.1.7.
    3. Лизе клеточной гранулы и MNase пищеварения, как описано в шагах 2.2.1-2.2.7. Используйте оптимальное количество MNase для переваривания хроматина, как это определено в шаге 2. Хранить переваренный хроматин при -80 градусах По Цельсию.
    4. Обратная перекрестная связь 20 зл и л переваренных хроматина и очищение ДНК, как описано в шаге 2.3.8. Измерьте концентрацию ДНК, описанную в шаге 2.3.7. Электрофорезы образцы в 2% агарозный гель, чтобы проверить размер переваренных хроматин, как упоминалось в шаге 2.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ДНК идентична концентрации хроматина, накопленного в шаге 3.1.3.
    5. Разбавить обратный перекрестный переваренный образец хроматина со ступени 3.1.4, чтобы дать 10 нг/Л с водой и последовательно разбавить, чтобы сделать концентрации 1, 0,1, и 0,01 нг/Л. Хранить при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы используются для стандартов ПЦР в реальном времени.
  2. Иммунопрециция
    ПРИМЕЧАНИЕ: В шагах 3.2-3.5 протокола определяется заполняемость 3.2-3.5 протокола, антитриметилированный гистон H3 лизин 4 (H3K4me3) заполняемость в клетках VCaP. Смотрите также Рисунок 3.
    1. Оттепель переваривается хроматин от шага 3.1.3. Храните все образцы на льду.
    2. Подготовьте буфер разбавления CHIP, дополненный PIC, добавив 1/100 том 100x PIC в буфер. Разбавить переваренный хроматин до 5 мкг/500 л с буфером разбавления CHIP, дополненным PIC. Подготовьте 1000 qL плюс дополнительные для (1) IP с неиммунным IgG (Контроль IgG), (2) IP с H3K4me3.
    3. В качестве входной пробы (1% от одного ИС) добавьте 5 кЛ 5 мкг/500 мл переваренных хроматина. Храните образец при -80 градусах По Цельсию.
    4. Добавьте 500 мл каждый из 5 мкг/500 юл переваренный хроматин в 1,5 мл винтовой трубки в качестве образца IP. Добавьте 2 мкг антител в трубку. Закройте крышку и инкубировать трубку при 4 градусах Цельсия на ночь с нежным смешивания с помощью качалки платформы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя оптимальное количество антител должно быть определено эмпирически, 2 мкг на ИС рекомендуется в первую очередь.
    5. Добавьте 30 зл и содержание белка ChIP-класса G магнитных бусин ок на IP. Инкубировать трубку при 4 градусах по Цельсию на 2 ч с нежным смешиванием с помощью качалки платформы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предмыкать магнитные бусины не стоит.
  3. Мытье иммунного комплекса и обращение вспять перекрестных ссылок
    1. Спин вниз трубки от шага 3.2.5 кратко. Поместите трубку в полиэтиленовую стойку, содержащую неодиниумные магниты на 1 мин. Тщательно удалите супернатант аспирией.
    2. Добавьте 0,5 мл на трубку низкосолевого иммунного комплекса стирального буфера. Разогнать бусинки, осторожно нажав или кратко вихря трубки. Инкубировать трубку при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут с нежным смешиванием с помощью качалки платформы. После 5 мин повторите шаг 3.3.1.
    3. Добавьте 0,5 мл буфера с высоким содержанием соли иммунного комплекса для мытья по трубе. Разогнать и вымыть бисер в виде шага 3.3.2. После стирки повторите шаг 3.3.1.
    4. Добавьте 0,5 мл буфера иммунного комплекса LiCl на трубку. Разогнать и вымыть бисер в виде шага 3.3.2. После стирки повторите шаг 3.3.1.
    5. Поместите трубку в магнитную стойку на 1 мин. Удалите оставшийся супернатант полностью.
    6. Добавьте в трубку 150 л буфера элюции. Вихрь трубки для разгона бисера полностью. Закройте крышку и инкубировать трубку при 65 градусах По Цельсию в течение 30 минут, смешивая путем инверсии или вихря каждые 5 минут, чтобы разогнать бисер тщательно.
    7. Во время инкубации подготовьте винтовую трубку 1,5 мл и добавьте 6 л 5 М NaCl и 2 л протеиназа K. Оттепель 1% входной образец подготовлен в шаге 3.2.3. Добавьте 150 юл элевционного буфера, 6 л 5 M NaCl и 2 л протеиназа K до 1% входной образца.
    8. После инкубации, спина вниз трубки. Поместите трубку в магнитную стойку в течение 1 мин и перенесите супернатант в винтовую трубку, содержащую NaCl и протеиназа K, подготовленные в шаге 3.3.7.
    9. Закройте крышку и вихрь все IP и входные образцы, чтобы полностью смешать. Инкубировать трубку при 65 градусах Цельсия на ночь.
  4. Очистка ДНК
    1. Подготовьте трубку, как описано в 2.3.2, и добавьте 150 кЛ PCI вместо 100 КЛ. В другой трубке добавьте 12 л из 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2 Злгликогена.
    2. Удалите трубку из инкубатора. Спин вниз трубки и добавить 150 л PCI.
    3. Вихрь энергично трубки для формирования эмульсии. Центрифуги трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г) для 30 с при комнатной температуре.
    4. Тщательно перенесите 140 л верхней фазы в трубку, содержащую PCI, подготовленную в шаге 3.4.1. Повторите шаг 3.4.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите также Примечание в шаге 2.3.4.
    5. Тщательно перенесите 120 л верхней фазы в трубку, содержащую ацетат натрия и гликоген, приготовленный в шаге 3.4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите также Примечание в шаге 2.3.4.
    6. Добавьте 300 л этанола. Смешайте инверсией и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    7. Центрифуга трубки на максимальной скорости (например, 20000 х г)в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте гранулы, как описано в шаге 2.3.6.
    8. После сушки гранулы, как описано в шаге 2.3.7, растворите гранулы в 50 Зл Te. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  5. Обнаружение фрагментов ДНК с использованием ПЦР в реальном времени
    1. Оттепель следующие образцы: (1) IP с управлением IgG, (2) IP с анти-H3K4me3, (3) 1% входной образец. Оттепель также 4 дозы стандартов подготовлены в шаге 3.1.5 (всего 7 образцов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандарты одной и той же группы для количественной оценки количества ДНК в образцах ввода и ИС.
    2. Сделать ПЦР рабочее решение для 8 образцов. Смешайте 40 зл 2x в режиме реального времени ПЦР супермикс, 8 qL каждый из 4 ММ вперед и обратные грунтовки, и 8 л воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна смесь реакции ПЦР содержит 5 qL 2x в режиме реального времени ПЦР супермикс, 1 Зл каждый из 4 ММ вперед и обратный грунтовки, и 1 л воды. Последовательность праймерперечислений указана в таблице 2.
    3. Aliquot 8 Л рабочего раствора ПЦР в одну скважину пластины ПЦР. Добавьте 2 qL образцов со ступени 3.4.8 или стандарты от шага 3.1.5.
    4. Печать пЦР пластины и запустить ПЦР, используя следующие условия: 1) 95 КК в течение 3 мин для первоначального денатурации, 2) 95 КК для 10 с для денатурации, 3) 56 КК для 30 с для annealing, 4) 72 КК для 30 с для расширения и сбора данных , повторные шаги 2) до 4) для 55 циклов. После езды на велосипеде измерьте кривую плавления продукта ПЦР. Проанализируйте данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные для рисунка 3 отображаются в таблице 3. Рассчитайте стартовое количество образцов с помощью стандартной кривой. Умножьте S в 1% входна на 100, чтобы настроить образец ввода 1% на один IP, чтобы дать скорректированный СЗ в вводах (Eq. 1). Разделите СЗ в выборке IP путем корректировки СЗ в ввода, чтобы дать% вхоженной стоимости (процентный метод ввода, Eq. 2). Чтобы рассчитать обогащение складок, разделите СЗ в ИС с анти-H3K4me3 по S'в IP с контролем IgG (метод разогнания, Eq. 3).
      Скорректированная СЗ при вводах - (СЗ в 1% входных данных) x 100 (1)
      Процент ввода H3K4me3 и 100 х (СЗ в IP с анти-H3K4me3) / (Скорректированный СЗ при вводах) (2)
      Сложить обогащение H3K4me3 ( (СЗ в IP с анти-H3K4me3) / (СЗ в IP с контролем IgG) (3)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переваривание хроматина является одним из важных шагов для анализчив ЦИП. Мы использовали MNase для переваривания хроматина, чтобы получить смесь нуклеосомного олигомеров. В шаге пищеварения MNase, MNase может пройти через ядерную мембрану и переварить хроматин. Однако переваренный хроматин не может пройти через мембрану и остается в ядрах. Для высвобождения переваренных хроматина из ядер необходима короткая звуковая. На рисунке 1А показаны микрофотографии до и после звуковой суспензии клето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя sonication обыкновенно использован для того чтобы получить фрагментированный хроматин, оно требующий много времени и громоздкое для того чтобы определить воспроизводимые условия. В этом протоколе мы использовали пищеварение MNase, потому что пищеварение ферментов должно быть легче определить воспроизводимые условия. Краткий шаг sonication после пищеварения MNase (см. шаг 2.2) был необходим для того чтобы сломать мембрану клетки и выпустить переваренный хроматин. Таким образом, тонизация в нашем протоколе должна быть...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддерживается Genentech роялти в город надежды. Эта работа не поддерживается в целом или частично Национальными институтами здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 м ЭДТА (pH 8,0)Thermo ScientificAM9010
2 м KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Зеленая суперсмесьBio-Rad1706862
5 м NaClThermo ScientificAM9010
50.н. ДНК-лестницаНовая Англия BiolabsN3236S
Агарозныйисследовательский продукт InternationalA20090
Разветвленный октилфенокси поли(этиленокси)этанолМиллипоры SigmaI8896IGEPAL CA-630
ChIP-класс белок G магнитные шарикиТехнология клеточной сигнализации9006S
Хроматин Иммунопреципитация (ChIP) Разбавляющий буферMillipore Sigma20-153Состав буфера: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 мМ ЭДТА, 16,7 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 167 мМ NaCl.
Гелевый краситель фиолетового цвета (6x)New England BiolabsB7024S
ГлицинBio-Rad161-0724Электроферез класса
ГликогенMillipore SigmaG176719-22 мг/мл
Коктейль из протеазы и ингибитора фосфатазы Halt, без ЭДТА (100x)Thermo Scientific78445
Иммунный комплекс с высоким содержанием соли Буфер для промывкиMillipore Sigma20-155Буферная композиция: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 500 мМ NaCl.
Histone H3K4me3 антитело (pAb)Active Motif39915
LiCl Иммунный комплекс Wash BufferMillipore Sigma20-156Состав буфера: 0,25 М LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% дезоксихолевая кислота (натриевая соль), 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис, pH 8,1.
Низкосолевой иммунный комплексMillipore Sigma20-154Состав буфера: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 150 мМ NaCl.
Стойка Magna GrIP (8 лунок)Millipore Sigma20-400Подойдет любая магнитная разделительная стойка, совместимая с пробиркой объемом 1,5 мл.
Микрококковая нуклеазаNew England BiolabsM0247Sпоставляется с 10-кратным буфером (500 мМ Tris-HCl, 50 мМ CaCl2, pH 7,9 при 25 °°; C) и 100x БСА (10 мг/мл)
NaHCO3JT Baker3506-01
Нормальный кролик IgGMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Proteinase KMillipore Sigma3115887001
система для ПЦР в реальном времениBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 антителоActive Motif39749
SDSBoehringer Mannheim100155Electropheresis
grade sodium acetateMillipore SigmaS5636
Sonator оснащен зондом с микронаконечникомQSONICAQ700Любой вид ультразвуковых аппаратов, совместимых с трубкой объемом 1,5 мл, подойдет.
Ультрачистый фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8,05

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ChIPMNase

Похожие статьи