Хроматин иммунопрецитисцией (ЧИП) является мощным инструментом для понимания молекулярных механизмов регуляции генов. Тем не менее, метод включает в себя трудности в получении воспроизводимого фрагментации хроматина с помощью механической стрижки. Здесь мы предоставляем улучшенный протокол для проведения анализа CHIP с использованием ферментативного пищеварения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хроматин ИммунопрецитатА Ассасси использованием микрококковой nucleases в клетках млекопитающих
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Чтобы выразить клеточные фенотипы в организмах, живые клетки выполняют экспрессию генов соответственно, а транскрипционные программы играют центральную роль в экспрессии генов. Клетовая транскрипционная техника и его белки модификации хроматина координируют регулирование транскрипции. Для анализа транскрипционной регуляции на молекулярном уровне доступны несколько экспериментальных методов, таких как электрофоретический сдвиг подвижности, переходный репортер и хроматин иммунопреципция (ЧиП). Мы подробно описываем в этой статье измененный анализ CHIP из-за его преимуществ в непосредственном показе модификаций гистона и взаимодействия между белками и ДНК в клетках. Одним из ключевых шагов в успешном анализе CHIP является стрижка хроматина. Хотя sonication обыкновенно использован для стрижки chromatin, трудно определить воспроизводимые условия. Вместо того, чтобы стрижка хроматина путем звуковой, мы использовали ферментативное пищеварение с микрококковой нуклеазы (MNase), чтобы получить более воспроизводимые результаты. В этой статье мы предоставляем простой протокол анализов CHIP с использованием MNase.
Введение
Выражение генов в клетках млекопитающих жестко и динамично регулируется, и транскрипция является одним из ключевых шагов. Транскрипция гена в основном регулируется транскрипционными факторами и гистонами. Фактор транскрипции является белком, который связывается с конкретными последовательностями ДНК и контролирует транскрипцию генов. Эти факторы либо способствуют или препятствуют набору РНК-полимеразы II (PolII), котораяинициирует синтез мРНК из геномной ДНК в качестве шаблона 1. Гистон модификации, такие как ацетилирование и метилирование остатков хвоста гистона положительно и негативно влияют на транскрипцию генов, изменяя структуру хроматина....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка реагентов
- Сделать 18,5% параформальдегида (PFA) раствор. Добавьте 0,925 г ПФА, 4,8 мл воды (использовать ультраочищенную воду на протяжении всего протокола) и 35 кЛ 1 М КНв в конической пластиковой трубке 50 мл. Закройте крышку плотно и нагрейте трубку в стакане 400-600 мл, содержащем около 200 мл воды с помощью микроволновой печи. Удалите трубку, прежде чем вода начнет кипеть и вихрь трубки для растворения PFA. Разрешить PFA остыть до комнатной температуры и хранить на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите нагревание и перемешивание до полного растворения PFA. Подготовьте решение PFA непосредственно перед перекрестным соединением (ша....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Переваривание хроматина является одним из важных шагов для анализчив ЦИП. Мы использовали MNase для переваривания хроматина, чтобы получить смесь нуклеосомного олигомеров. В шаге пищеварения MNase, MNase может пройти через ядерную мембрану и переварить хроматин. Однако переваренный хроматин не может пройти через мембрану и остается в ядрах. Для высвобождения переваренных хроматина из ядер необходима короткая звуковая. На рисунке 1А показаны микрофотографии до и после звуковой суспензии клето.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя sonication обыкновенно использован для того чтобы получить фрагментированный хроматин, оно требующий много времени и громоздкое для того чтобы определить воспроизводимые условия. В этом протоколе мы использовали пищеварение MNase, потому что пищеварение ферментов должно быть легче определить воспроизводимые условия. Краткий шаг sonication после пищеварения MNase (см. шаг 2.2) был необходим для того чтобы сломать мембрану клетки и выпустить переваренный хроматин. Таким образом, тонизация в нашем протоколе должна быть.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование поддерживается Genentech роялти в город надежды. Эта работа не поддерживается в целом или частично Национальными институтами здравоохранения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5 м ЭДТА (pH 8,0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 м KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Зеленая суперсмесь | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 м NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50.н. ДНК-лестница | Новая Англия Biolabs | N3236S | |
| Агарозный | исследовательский продукт International | A20090 | |
| Разветвленный октилфенокси поли(этиленокси)этанол | Миллипоры Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-класс белок G магнитные шарики | Технология клеточной сигнализации | 9006S | |
| Хроматин Иммунопреципитация (ChIP) Разбавляющий буфер | Millipore Sigma | 20-153 | Состав буфера: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 мМ ЭДТА, 16,7 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 167 мМ NaCl. |
| Гелевый краситель фиолетового цвета (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Глицин | Bio-Rad | 161-0724 | Электроферез класса |
| Гликоген | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 мг/мл |
| Коктейль из протеазы и ингибитора фосфатазы Halt, без ЭДТА (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| Иммунный комплекс с высоким содержанием соли Буфер для промывки | Millipore Sigma | 20-155 | Буферная композиция: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 500 мМ NaCl. |
| Histone H3K4me3 антитело (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Иммунный комплекс Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Состав буфера: 0,25 М LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% дезоксихолевая кислота (натриевая соль), 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис, pH 8,1. |
| Низкосолевой иммунный комплекс | Millipore Sigma | 20-154 | Состав буфера: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,1, 150 мМ NaCl. |
| Стойка Magna GrIP (8 лунок) | Millipore Sigma | 20-400 | Подойдет любая магнитная разделительная стойка, совместимая с пробиркой объемом 1,5 мл. |
| Микрококковая нуклеаза | New England Biolabs | M0247S | поставляется с 10-кратным буфером (500 мМ Tris-HCl, 50 мМ CaCl2, pH 7,9 при 25 °°; C) и 100x БСА (10 мг/мл) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Нормальный кролик IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| система для ПЦР в реальном времени | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 антитело | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis |
| grade sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonator оснащен зондом с микронаконечником | QSONICA | Q700 | Любой вид ультразвуковых аппаратов, совместимых с трубкой объемом 1,5 мл, подойдет. |
| Ультрачистый фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8,05 |
Ссылки
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalen....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
