Method Article

Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор Bacillus subtilis

DOI:

10.3791/59388

⸱

April 15th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Germinant рецептор белков кластера в «germinosomes» в внутренняя мембрана спор Bacillus subtilis . Мы описываем протокол, с помощью супер резолюции микроскопии и флуоресцентных белков репортер для визуализации germinosomes. Протокол также идентифицирует споро внутренняя мембрана доменов, которые преимущественно окрашенных краской мембраны FM4-64.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Небольшой размер спор и относительно низкой обилие всхожесть белков, вызывают трудности в их микроскопического анализа с помощью эпифлуоресцентного. Супер-резолюции трехмерной структурированного освещения микроскопии (3D-SIM) является перспективным инструментом для преодолеть этот барьер и выявить молекулярные детали процесса прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis). Здесь, мы описывают использование модифицированных SIMcheck (ImageJ)-помощник 3D визуализации процесса и флуоресцентные репортер белков для SIM микроскопии спор B. subtilis germinosomes, появление всходов белков. Мы также представляем (стандарт) 3D-SIM изображений процедура FM4-64 пятнать B. subtilis споро мембран. С помощью этих процедур, мы получили непревзойденное разрешение для germinosome локализации и показать, что > 80% B. subtilis KGB80 спящие споры, полученные после заспорение на определенный минимальный средний MOPS имеют один или два Герд-GFP и GerKB-mCherry очаги. Светлые очаги были также наблюдается в FM4-64 витражные изображения 3D-SIM споры, предполагая, что внутренняя мембрана липидов домены различных текучести вероятно существуют. Дальнейшие исследования, которые используют двойной маркировки процедур с мембраной красителей и germinosome репортер белки для оценки сотрудничества локализации и таким образом получить оптимальный обзор организации Bacillus всхожесть белков в мембраны внутренние споры возможно.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Споры по приказу Bacillales и Clostridiales метаболически неактивных и чрезвычайно устойчивы к суровым обеззараживания режимов, но если они прорастают, не может вызывать вредное воздействие на людей1. В питательных germinant срабатывает прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis) инициирование событий является germinant привязку к germinant рецепторы (гр), расположенные в споро внутренняя мембрана (IM). Впоследствии гр передают сигналы на белок канала SpoVA, также расположенный в IM. Это приводит к начала обмена споро ядро пиридин-2,6-дикарбоновых кислота (dipicolinic кислота; DPA; состоит из 20% споро основной сухой wt) для воды через SpoVA канал. Впоследствии ДПВ релиз триггеров активации коры мукопептида гидролиза, а дополнительные воды следует за2,3,4. Эти события приводят к механическим воздействиям на слои пальто, его последующие разрыв, начала нарост и, наконец, вегетативного роста. Однако по-прежнему далеки от разрешаются точные детали молекулярный процесс прорастания.

Основной вопрос о прорастания спор касается биофизических свойств липидов, окружающих IM всхожесть белков, а также белки IM SpoVA канала. Это во многом неподвижной IM липидного бислоя является основным проницаемость барьером для многих маленьких молекул, включая токсичные химические консерванты, некоторые из которых оказывают их действий в споро ядро или вегетативная клетка цитоплазме5,6. IM липидный бислой, вероятно, в состоянии геля, хотя значительная часть мобильных липидов в IM5. Споро IM также имеет потенциал для значительного расширения5. Таким образом, 1,6 раза увеличивает площадь поверхности им после прорастания без дополнительных мембраны синтеза и сопровождается потерей этой мембраны характерным низкая проницаемость и липидов неподвижность5,6.

В то время как молекулярные детали активации белков всхожесть и организация им липидов в споры являются привлекательные темы для исследования, небольшой размер спор B. subtilis и относительно низкой обилие всхожесть белков, представляют собой вызов микроскопические анализы. Гриффитс et al. неопровержимые доказательства эпифлуоресцентного микроскопа, с использованием флуоресцентных репортеров, сливается с прорастания белков, свидетельствует о том, что в спор B. subtilis эшафот белка Герд организует три подразделения GR (A, B и C) для Гера, B и K гр, в кластер7. Они придумал термин «germinosome» для этого кластера всхожесть белков и назвал ~ 300 Нм большой IM белка очагов8структур. После начала прорастания спор, флуоресцентный germinosome очагов в конечном итоге превращаются в большие разогнать флуоресцентные шаблоны, с > 75% населения споро, отображение этот шаблон в споры проросшие за 1 час с L-валин8. Обратите внимание, что упомянутые выше используется бумага среднем изображения из десятков последовательных флуоресцентных изображений, чтобы получить статистическую мощность и преодолеть барьер низкой флуоресцентные сигналов во время визуализации. Это мысленное представление этих структур в бактериальных спор был на краю того, что является технически осуществимым с классической микроскопических инструменты и ни оценки количества очагов в одном spore ни была их более подробные субцеллюлярные локализации возможно с этим подходом.

Здесь мы продемонстрировать использование структурированных освещения микроскопии (SIM) для получения подробной визуализации и количественной оценки germinosome(s) в спор B. subtilis, а также их IM липидных доменов9. Протокол также содержит инструкции для заспорение, слайд подготовки и анализа изображений, SIMcheck (v1.0, плагинов imageJ) а также ImageJ10,,1112.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. б. subtillis заспорение (сроки: 7 дней до микроскопические наблюдения)

  1. 1 день
    1. Полоска бактериальной культуры на пластине (1% Триптон, экстракт дрожжей 0,5%, 1% NaCl, 1% агар) агар бульоне Лурия Бертани (LB)13 и инкубировать на ночь при 37 ° C для получения единого колоний. Используйте штамм B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry кошка, Кан Герд gfp) и его родительский фон штамм B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) как описано выше7.
      Примечание: Использование споры с ΔcotEΔgerE фон имеет важное значение в germinosome визуализации, чтобы свести к минимуму аутофлюоресценция споро пальто слои7.
    2. Простерилизуйте все средства массовой информации, трубы, пипец и другие культуры материалы для использования с соответствующими методами.
  2. День 2
    1. Прививать единую колонию в 5 мл LB средних рано утром и инкубировать и культуре при постоянном помешивании в трубу колпачок на 200 об/мин и 37 ° C пока ОД600 достигнет 0,3-0,4 (около 7 ч).
    2. Сделать 500 мл MOPS среды (рН 7,5) содержащий 3 Нм (NH4)6Пн7O24·4H2O, 0,4 мкм H3Бо3, 30 Нм CoCl2·6H2O 10 Нм CuSO4·5H2O, 10 Нм ZnSO4·7H2O, 1.32 мм K2HPO4, 0,4 мм MgCl2·6H2O, 0,276 мм K2так4, 0,01 мм FeSO4·7H2O, O22·2H CaCl 0,14 мм, 80 мм ШВАБРЫ, 4 мм Трицин, O22·2H НКД 0,1 мм, 10 мм D-глюкоза моногидрат и 10 мм NH4Cl.
    3. Подготовить в колпачок трубы 10-1- 10-7 серийных разведений LB культуры в 5 мл MOPS среднего и инкубировать культур на ночь при постоянном помешивании в 200 об/мин и 37 ° C.
      Примечание: Серийных разведений, здесь цель получить разрежения в ранней экспоненциальной фазе на следующее утро. Этот шаг и следующий шаг необходимо позволить клетки адаптироваться к MOPS буферизации роста среднего.
  3. День 3
    1. Выберите один из разведений швабры с ОД600 0,3-0,4. Прививок 0,2 мл культуры подогретым (37 ° C) 20 мл MOPS среды в конической 250 мл флакон и инкубировать при постоянном помешивании, пока ОД600 достигнет 0,3-0,4 (~ 7 h).
    2. Прививок средство на основе заспорение МОПЫ (250 мл) с предварительно культуры 1% (v/v) из шага 1.3.1 и инкубировать в течение 3 дней при 37 ° C в колбе конические литр при постоянном помешивании. FM4-64 окрашивание PS4150 споры, добавить 2 мкг/мл FM4-64 зонд (см. Таблицу материалы) до заспорение средних 1 или 2 ч после достижения пика ОП значение600 вегетативного роста (обычно около 2) и позволяют культуры Впоследствии sporulate, защищая его от света5.
  4. День 7: Заготовка споры
    1. Определите заспорение доходность (споры против растительной клетки) с помощью Фазово-контрастная микроскопия на 100 крат различать фазы яркие споры от фазы темных клеток и спор, возможно-Зрелые. Урожайность яркий спор фазы 90% ожидается.
    2. Пелле споры на 4270 x g 15 мин при 4 ° C в круглых дно пробирок. Вымойте споро гранул 2 - 3 раза с 40 мл стерильной Ультрачистые типа 1 деминерализованной воды в 50 мл конические пробирок (см. Таблицу материалы). Спин вниз на каждой стирки на 4270 x g 15 мин (4 ° C).
  5. День 7: Spore очистки
    1. Spore очистки: приостановить споро Пелле в 750 мкл среднего градиента неионогенных плотность 20% (см. таблицу материалов) и загрузить на 800 мкл 50% неионогенных плотность градиента среды в стерилизованные microcentrifuge трубы. Центрифуги для 60 мин в 21 500 x g. Полученные гранулы содержит бесплатно споры. Приостановить споро Пелле в 200 мкл 20% неионогенных плотность градиента среды и нагрузки на 1 мл 50% неионогенных плотность градиента среды в пробки microcentrifuge и центрифуги для 15 мин на 21 500 x g.
    2. Промывание окончательный споро подготовки и хранения: Полученные гранулы содержит очищенный неактивных споры. Мыть споро гранул 2 - 3 раза с 1,5 мл стерильного Ультрачистые типа 1 воды (см. Таблицу материалы) и спин вниз между ними на 9,560 x g 15 мин при 4 ° C. Наконец приостановите Пелле в стерильных ультра-чистой воде типа 1 окончательный ОД600 примерно 30. Аликвоты споры могут храниться при температуре-80 ° C для 8 недель14.

2. удаления покрытий

  1. Лечить PS4150 споры с 0,1 М NaCl/0.1 М NaOH/1% натрия Додециловый сульфат (SDS) / 0,1 М Дитиотреитол (DTT) при 70 ° C на 1 ч. вымыть споры в 10 раз с стерилизованные Ультрачистые типа 1 воды15,16. Поступая таким образом, любой адсорбированные FM4-64 зонд в spore внешней мембраны и внешние слои будут удалены.

3. Coverslip и подготовки слайд11 (времени: 1 H перед наблюдения)

  1. Предварительно чистой высокой точности coverslips (см. таблицу материалов) с HCl 1 M в слегка покачивая водяной бане 30 мин. Мыть coverslips дважды в ультра-чистой воде типа 1 и хранить их в 100% (vol/vol) EtOH. Пусть они сухие и проверить их ясности перед использованием. Предварительно очистить стекла слайды в 70% EtOH. Пусть они сухие и проверить их ясности перед использованием.

4. отбор проб флуоресцентные микросферы или споры в рамках гена слайд10 (сроки 15 мин)

  1. Предварительно теплой две 70% EtOH мыть и воздуха сушеные стеклянных скольжениях (см. таблицу материалов) на несколько секунд на Отопление блока 70 ° C, падение 65 мкл стерилизовать 2% агарозном состоявшейся в 70 ° C на вершине слайд один стакан и место на другой слайд стекла сверху для распространения b агарозы etween слайды. Патч агарозы высохнет примерно 5 мин.
  2. Нарезать 1 x 1 см раздел агарозы патч после удаления одной из стеклянных скольжениях, добавить 0.4 мкл образца (флуоресцентные микросферы или споры8~ 10/мл) и передачи, поместив coverslip на патч патч на высокой точности coverslip и сдвинув ее покинуть.
  3. Исправьте ген кадр (1.5 x 1.6 см2, 65 мкл) на сушеные слайд, на который помещается coverslip закрытия всех углах кадра, тем самым завершив слайд для использования в микроскопии.

5. Визуализация11,17(времени: 1 H)

  1. Захвата, передачи и флуоресценции изображений споры, а также смесь красного и желто зеленый карбоксилат модифицированные флуоресцентные микросфер на микроскопом структурированного освещения (см. таблицу материалов) оснащены 100 x объективных (масло Числовая апертура = 1,49), CCD камеры и изображений программное обеспечение для анализа (см. таблицу материалов). Генерировать все изображения при комнатной температуре без нарушения окружающего света. Убедитесь в том, чтобы всегда очищайте 100 x цель и слайд с 75% этанола до изображений.
  2. Сосредоточиться на 100 Нм (диаметр) флуоресцентных микросферы и оптимизировать точки распространения функция (ФСФ), регулируя коррекции кольцо на 100 x цели пока не получается симметричной ПСФ, таким образом к минимуму размытие изображения. Psf-импульсной или ответ съемочной системы точечного источника или объект point.
  3. Выберите поле зрения, с приблизительно 10 раунда флуоресцентные микросфер. Применить решетки сосредоточиться регулировки для обоих 561 Нм и 488 нм длины волны возбуждения как руководство для программного обеспечения для анализа изображения.
  4. Основное внимание споры с передачи света и передачи света образа в среднем режиме 16 × с экспозицией 200 мс для каждого изображения.
  5. Захват 3D-SIM флуоресцентных изображений raw спор с режимом освещения «3D-SIM», настройки камеры в режим индикации умножения электрона (EM) получить 10 МГц в 14-битный и получить EM в 175. Возбуждают FM4-64 зонд в PS4150 споры с 561 Нм лазерного света на 20% мощности лазера и освещение время 400 мс.
  6. Возбуждают GerKB-mCherry и Герд-ГФП в KGB80 споры с, соответственно, 561 Нм лазерного света на мощность лазера 30% для 1 s и 488 нм лазерный свет на 60% мощность лазера для 3 s. Z-стек параметры находятся в верхней к нижней режим, 0,2 мкм / шаг, 7 шагов и 20 шагов для germinosome и IM анализа, соответственно.
    Примечание: Эти параметры лазерного были применены с целью обеспечения максимальной яркости значение гистограмма около 4000.

6. Восстановление Raw изображений 3D-SIM FM4-64, окрашенных PS4150 споры

  1. Выполнение реконструкции ломтик N-SIM FM4-64, окрашенных PS4150 споры необработанных данных. Нажмите кнопку Param Реконструировать фрагмента на N-SIM площадку вкладку лист, чтобы открыть окно N-SIM срез реконструкции.
  2. Задайте параметры восстановления в окне N-SIM срез реконструкции . Чтобы получить идеальный восстановленные изображения, следовать предложение инструкции N-SIM и нажмите на соответствующие элементы управления в окне Срез реконструкции N-SIM установить Авто, высокий Контраст модуляция подсветки (IMC) Подавление шума резолюции (грн) 1.00 и Из подавления размытости фокус (OFBS) до 0,05 в качестве отправной точки.
  3. Нажмите кнопку Восстановить фрагмент в окне Срез реконструкции N-SIM для реконструкции изображения. Оцените качество восстановленных изображений путем быстрого преобразования Фурье (БПФ) изображения и реконструкции оценка, которая после реконструкции12.
  4. Отрегулируйте грн от 0,10 до 5.00 и OFBS от 0.01 до 0,50, нажав на соответствующие элементы управления в окне Срез реконструкции N-SIM пока получаются лучшие настройки параметров.
  5. Нажмите на кнопку Применить в окне Срез восстоновительные N-SIM применять измененные параметры. Нажмите кнопку Закрыть , чтобы закрыть окно.
  6. Сделайте FM4-64 PS4150 споры raw изображений активных и нажмите кнопку Восстановить фрагмент на вкладку лист N-SIM Pad выполнить Срез реконструкции. Сохраните восстановленные изображения.

7. анализ

  1. Преобразовать изображения псевдо-Widefield KGB80 germinosome
    1. Преобразование 3D-SIM raw изображений KGB80 в псевдо-Widefield изображения путем активации с левой кнопкой мыши плагинов ImageJ Утилита Необработанных данных SI SIMcheck Псевдо-Widefield12. Псевдо-Widefield среднем изображения из необработанных данных SIM и собирает, для сравнения, эквивалентен обычным widefield освещения12изображения. ImageJ сам см https://imagej.net/Welcome. Случайным образом выберите ~ 25 споры в каждом Перевернутый передачи изображения для последующего анализа germinosome в флуоресцентного изображения псевдо-Widefield.
    2. Выберите всего около 350 (в этом примере, 346) KGB80 споры в 14 полей зрения два слайда. Герд-GFP и GerKB-mCherry числа флуоресцентные очагов в отдельных KGB80 споры должны учитываться независимо друг от друга два исследователями. Исследователь может вернуться к raw изображений 3D-SIM всякий раз, когда вы сомневаетесь присутствия отдельных флуоресцентный germinosome очагов в спор.
    3. Оценка максимальной интенсивности каждого Герд-GFP и GerKB-mCherry направленность и интенсивность комплексной 3D изображения каждого KGB80 спор с ImageJ.
  2. Анализ изображения псевдо-Widefield KGB80 germinosome
    1. Используйте значение средняя интенсивность комплексной 7 стеков как интенсивность комплексной сигнала KGB80 споро. Определите интенсивность фона изображения фона штамм PS4150 с использованием одинаковых параметров. Считают флуоресцентные пятна в отдельных KGB80 спорами очагов germinosome когда они четко отличить от фона.
    2. Примените односторонний дисперсионный анализ тесты для определения значимости с программным обеспечением происхождения 9.0. Учитывая P значений < 0,05 как статистически значительным. Используйте ранга коэффициента корреляции Спирмена18 оценить соотношение числа очагов Герд-GFP и GerKB-mCherry и измерения интенсивности комплексного сигнала.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол представляет SIM Микроскоп изображений процедура для бактериальных спор. Процедуры подготовки заспорение и слайд были проведены, как показано на рисунке 1 до изображений. Позже, были применены процедуры обработки изображений и анализа как для dim (помечены всхожесть белки флуоресцентный белок) и яркий спор (витражи IM липофильного зонда) образцов, как показано в следующем тексте.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представил протокол содержит стандартный 3D-SIM процедуры для анализа FM4-64 окрашенных B. subtilis споры, включающий заспорение, подготовка слайдов и визуализации процессов. Кроме того, протокол описывает изменение SIMcheck (ImageJ)-при содействии 3D визуализации процесса для SIM микроскопии B. subtilis споро germinosomes помечены флуоресцентные журналистам. Последняя процедура позволила нам наблюдать этот тусклый каркаса с расширенной контраст. Путем соединения двух изображений процедур, можно визуали...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Christiaan Zeelenberg за его помощь во время визуализации SIM. JW признает Совет Китая стипендии PhD стипендии и спасибо Ирен Stellingwerf за ее помощь на начальном этапе обработки изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Стеклянные горки с воздушной сушкойMenzel Glä ser630-2870
APO TIRF N20R8 100&крат; масло объективное (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, Δ cotE::tet)
Erlenmeyer flask 1 лSigma-AldrichZ567868
Erlenmeyer flask 250 млSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres карбоксилат-модифицированные микросферыInvitrogen, 0,1 μ mF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz неионогенный градиент плотности средаSigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD камераAndor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB AgarSigma-AldrichL2897
Микрофуге пробирки 1,5 млThermo Fisher Scientific3451PK
Программное обеспечение для визуализацииNikon, ЯпонияNIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Сверхчистая деминерализованная водаMilliporeMilli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti микроскоп
полипропиленовая винтовая крышка бутылка 180 млThermo Fisher Scientific75003800
Прецизионные покровные стеклаPaul Marienfeld117650
Пробирки с круглым дном 15 млThermo Fisher ScientificNunc TM
Пробирки с винтовой крышкой 50 млThermo Fisher ScientificNunc TM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290(2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972(2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915(2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293(1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636(2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388(2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacillus subtilis SporesGerminosome Localization3D Structured Illumination MicroscopySuper Resolution ImagingInner Membrane AnalysisFluorescent Reporter ProteinsGermination Protein ClustersFM4 64 Membrane StainingImageJ SIMcheck PluginSpore Germination Process

Related Articles