Липидомика и транскриптомика при неврологических заболеваниях

Краткое содержание

В этой статье представлен модульный протокол для тканевой липидомики и транскриптомики, а также плазменной липидомики в моделях неврологических заболеваний мышей, нацеленных на липиды, лежащие в основе воспаления и активности нейронов, мембранные липиды, последующие мессенджеры и ферменты / рецепторы, кодирующие мРНК, лежащие в основе липидной функции. Описаны процедуры отбора проб, обработки проб, извлечения и количественной оценки.

Аннотация

Липиды служат основным интерфейсом для мозговых оскорблений или стимулов, способствующих неврологическим заболеваниям, и являются резервуаром для синтеза липидов с различными сигнальными или лигандными функциями, которые могут подчеркивать возникновение и прогрессирование заболеваний. Часто изменяясь на предсимптомном уровне, липиды являются новым источником лекарственных мишеней и биомаркеров. Многие неврологические заболевания проявляют нейровоспаление, нейродегенерацию и возбудимость нейронов в качестве общих признаков, частично модулированных специфическими липидными сигнальными системами. Взаимозависимость и взаимосвязь синтеза различных липидов побуждает к многолипидному, мультиферментному и мультирецепторному анализу с целью выявления общих и специфических особенностей неврологических контекстов и ускорения разгадки механистических аспектов возникновения и прогрессирования заболевания. Приписывание липидных ролей различным областям мозга способствует определению молекулярного фенотипа липидов и морфологии, связанных с неврологическим заболеванием.

Представленный здесь модульный протокол, подходящий для анализа мембранных липидов и последующих липидных сигналов вместе с мРНК ферментов и медиаторов, лежащих в основе их функциональности, извлеченных из дискретных областей мозга, которые имеют отношение к конкретному неврологическому заболеванию и / или состоянию. Для обеспечения точного сравнительного липидомного профилирования рабочие процессы и критерии работы были оптимизированы и стандартизированы для: i) отбора проб мозга и рассечения областей, представляющих интерес, ii) совместной экстракции нескольких липидных сигналов и мембранных липидов, iii) двойной экстракции липидов / мРНК, iv) количественной оценки с помощью мониторинга множественных реакций жидкостной хроматографии (LC / MRM) и v) стандартного профилирования мРНК. Этот рабочий процесс поддается малым количествам тканей, полученным путем отбора проб функционально дискретных субрегионов мозга (т.е. путем ударов мозга), что предотвращает смещение в многомолекулярном анализе из-за неоднородности тканей и / или изменчивости животных. Для выявления периферических последствий неврологических заболеваний и установления трансляционных молекулярных показаний неврологических болезненных состояний также проводится и описывается забор проб периферических органов, обработка и их последующий липидомический анализ, а также липидомика плазмы. Протокол демонстрируется на мышиной модели острой эпилепсии.

Введение

Последние достижения в области функции липидов и их роли в возникновении и прогрессировании неврологических заболеваний открывают новые научно-исследовательские и опытно-конструкторские площадки для новых терапевтических мишеней и выяснения механизмов ^{заболевания1}. Задокументированные различия в липидном составе в разных областях мозга, подчеркнутые современными методами молекулярной визуализации, такими как масс-спектрометрическая визуализация и расширенное профилирование масс-спектрометрии, смещают парадигму исследования липидов от всего мозга к функционально различным и дискретным областям мозга. Тот факт, что липидный состав варьируется в разных областях мозга, вызывает новую концептуализацию как мембранной липидной чувствительности, так и последующей липидной сигнализации в ответ на повреждение мозга или стимулы в функционально различных областях мозга. Следовательно, липидные протоколы требуют новых разработок для решения проблемы низких количеств тканей для обнаружения и количественной оценки с более высоким пространственным разрешением и одновременно анализа нескольких липидных компонентов клеточных мембран и сигнальных путей. Кроме того, определение ферментов, липидных лигандов и рецепторов, участвующих в регуляции их уровней и функций, имеет первостепенное значение для выяснения сигнальных путей, затронутых неврологическим заболеванием, и руководства новыми механистическими исследованиями в патофизиологическом контексте.

В дополнение к увеличению пространственного разрешения мозга, существуют две основные трудности, бросающие вызов разработке новых нейролипидомных подходов. Во-первых, липидные сигнальные молекулы, как правило, имеют очень низкое содержание по сравнению с мембранными конститутивными липидами. Во-вторых, липидом проявляет высокую структурную гетерогенность, которую трудно препарировать с помощью одного аналитического подхода. Следовательно, методы экстракции и анализа адаптированы к различным категориям липидов и обычно выполняются в разных образцах тканей.². Липидомические методы дробовика³ являются отличными инструментами для быстрого выявления широкого профиля мембранных липидов, в то время как повышенная чувствительность и селективность, обеспечиваемые целенаправленными методами открытия и количественной оценки масс-спектрометрических методов, используются для исследования низкообильных сигнальных липидов, включая: i) воспалительные липиды и ii) липиды, участвующие в модуляции нейрональной активности, такие как эндоканнабиноиды (eCB), аминокислотно-связанные липиды, и так далее.^4,5. Чтобы охватить изменения липидов как на клеточной мембране, так и на уровне сигнализации, происходящие в областях мозга моделей неврологических заболеваний, обычно экстракция и анализ липидов проводятся в отдельных образцах тканей, полученных из различных партий животных или из разных полушарий, или путем рассечения более крупной области ткани на несколько частей. Когда уровни мРНК ферментных рецепторов также представляют интерес, их исследование обычно требует получения отдельного образца ткани. Например, исследование мембранных липидов, эндогенных каннабиноидов и мРНК потребует трех различных образцов тканей (например, двух образцов для двух методов экстракции липидов - мембранных липидов и сигнальных липидов - и последующих двух методов анализа липидов - и одного образца для анализа мРНК). Исследование воспалительных липидов и эндогенных каннабиноидов требует двух различных образцов тканей, методов экстракции и методов анализа, соответственно. Другим примером является исследование мРНК и любой липидной категории в образце мозгового пунша или лазерной микродиссекции, что, следовательно, требует, чтобы два разных животных получали два образца на (под)область мозга. В таких случаях часто наблюдается значительная степень изменчивости и/или плохой воспроизводимости результатов, обусловленная биологической изменчивостью и/или неоднородностью тканей. Руководствуясь этими практическими ограничениями многомолекулярного анализа, происходящими, в частности, при высоком пространственном разрешении в головном мозге, был разработан трехмодульный протокол нейролипидомики, охватывающий: 1) коэкстракцию и совместный анализ LC / MRM воспалительных липидов (например, эйкозаноидов (EIC)) и липидов, участвующих в модуляции нейронной активности, таких как eCB²; 2) совместная экстракция фосфолипидов (ПЛ) и eCB с последующим мультисканированием LC/MRM и прекурсором/нейтральным анализом потерь²; и 3) двойная экстракция мембранных (фосфо)липидов и eCB, а также мРНК с последующим анализом секвенирования LC/MRM и qPCR или РНК⁶. В зависимости от биологического вопроса, подлежащего решению при неврологическом заболевании и интересующей области мозга, комбинация первого и второго протокола или первого и третьего протокола может быть применена к одному и тому же образцу ткани для тканей весом около 4 мг. Первый и третий протоколы могут быть независимо применены для тканей около 2 мг. Второй протокол может быть применен для тканей весом всего 0,5 мг. Независимо от выбранного модуля нейролипидомного протокола, забор тканей и преаналитическая обработка, выделение мозга и рассечение области, а также процедура жертвоприношения животной модели стандартизированы и идентичны для всех трех модулей протокола. В нашем исследовании неврологических заболеваний периферические органы, которые имеют отношение к патологическим последствиям заболевания, всегда также собираются и анализируются с использованием этих модульных протоколов. Кроме того, кровь регулярно отбирается для плазменной липидомики, чтобы служить инструментом считывания неврологических заболеваний с целью перспективного трансляционного применения. Представленный здесь модульный протокол липидомики очень универсален: масштабируется до больших количеств тканей и легко применим практически для любого типа тканей и заболевания. Для применения модульного протокола (Рисунок 1) при неврологических заболеваниях любая стандартизированная модель грызунов начала и прогрессирования неврологических расстройств, таких как черепно-мозговая травма, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или эпилепсия, поддаются лечению.

Эти протоколы широко применялись для изучения изменений в тканевом липидоме и/или транскриптоме в острой фазе эпилепсии в мышиной модели эпилепсии, индуцированной кайновой кислотой (КА^)2,7, модели, широко используемой в доклинических исследованиях из-за сходства с эпилепсией височной доли человека (TLE)^8,9,10,11. Используя эти протоколы, терапевтический потенциал таких препаратов, как Пальмитоилэтаноламид (ПЭА)^12,13, оценивали в той же мышиной модели эпилепсии. Исследование выявило изменения липидов и мРНК при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферии, в точке максимальной интенсивности острых приступов (при 60 мин после индукции после захвата) и при субхроническом и остром лечении ПЭА в четырех различных временных точках (20, 60, 120 и 180 мин) после индукции KA-припадка, временное окно, охватывающее острую фазу эпилепсии. Плазма, мозг и периферические органы необработанных мышей, введенных к КА, острых и субхронически обработанных ПЭА мышей, а также контрольных мышей с транспортным средством и ПЭА-транспортным средством, были собраны в каждый момент ^{времени12,13} и исследованы с помощью этого молекулярного анализа. Молекулярные данные коррелировали с поведенческими фенотипами, полученными с помощью оценки судорог, а также с данными иммуногистохимии о нейродегенеративных процессах, чтобы разгадать прогрессирование фазы острой эпилепсии и потенциал ПЭА для ее облегчения.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, соответствуют Директиве Совета Европейского сообщества от 22 сентября 2010 года (2010/63EU) и были одобрены местным комитетом по животным земли Рейнланд-Пфальц, Германия (ссылка на файл: 23 177-07/G16-1-075).

1. Животная модель острой и профилактически леченной KA-индуцированной эпилепсии

1. Выполняйте индукцию судорог, лечение и поведенческую оценку.
   1. Отдельные мыши (минимум n = 6 мышей в группе) в одиночных клетках.
   2. Готовят приступно-индукционный раствор и соответствующее средство (см. табл. 1), а также лечебно-инъекционный раствор и соответствующее транспортное средство (см. табл. 2).
   3. Вводите мышам внутрибрюшинно (т.п.) (10 мл/кг массы тела мыши) без анестезии в соответствии с их групповой идентичностью: болезнь, лечение или транспортное средство, обработанное (т.е. KA, ОБРАБОТАННОЕ ПЭА, и две группы транспортных средств). См. рисунок 2, таблица 1 и таблица 2.
   4. Мониторинг и оценка поведения в соответствии со следующей стандартизированной шкалой интенсивности приступов: 0 = отсутствие ответа; 1 = неподвижность и пристальный взгляд; 2 = разгибание передней конечности и/или хвоста, жесткая осанка; 3 = повторяющиеся движения, покачивание головой; 4 = вздыбление и падение; 5 = непрерывное вздыбление и падение; 6 = тяжелые клоно-тонические припадки; 7 = ^{смерть14,15} (рисунок 3).
2. Выполните процедуру жертвоприношения для липидомического и транскриптомического анализа.
   1. В четырех временных точках (т.е. 20, 60, 120 и 180 мин после КА- или впрыска транспортного средства соответственно) приносят в жертву шесть мышей из каждой из следующих групп: ПЭА, обработанная ПЭА, эпилептическая машина без ПЭА 1 и транспортное средство 2, в соответствии с протоколами, одобренными IACUC.
   2. Через десять секунд после достижения каждой временной точки обезболивайте мышей, используя пропитанную изофлураном ткань в стеклянной камере. Подтверждают анестезию потерей корректирующего рефлекса, о чем свидетельствует невозможность двигаться при медленном опрокидывании стеклянной камеры. Обезглавливайте мышей с помощью хирургических ножниц и собирайте плазму, мозг и периферические органы (см. шаги 2.2.2−2.2.4).
      ВНИМАНИЕ: Этические правила для процедур жертвоприношения варьируются между местными комитетами по животным. Обязательно проверьте и следуйте правилам, выпущенным местным комитетом по животным.
3. Следуйте процедуре жертвоприношения для иммуногистохимического анализа.
   1. Для иммуногистохимического ^{окрашивания13} поведенчески оценивают трех мышей из каждой из следующих групп: ПЭА, получавших ПЭА, ПЭА-нелеченная эпилепсия и транспортные группы, в течение всего временного курса (180 мин).
   2. Жертвоприношение и перфуз мышей через 5 дней. Глубоко обезболивать мышей (см. этап 1.3.1 для групп мышей) путем инъекции пентобарбитала (100 мг/кг) и бупренорфина (0,1 мг/кг) в качестве наркотических средств. Подтвердите глубокую анестезию потерей рефлекса между пальцами ног.
   3. Закрепите мышь на полистирольной пластине и сразу же откройте грудную клетку с помощью мелких ножниц и стандартных щипцов. Поместите бабочку в левый желудочек сердца и вырежьте правое предсердие тонкими ножницами.
   4. Отрегулируйте скорость и давление насоса до постоянного перистальтического потока со скоростью 2−3 мл/мин. Перфюсировать с ледяным фосфатом, буферизованным физиологическим раствором (PBS) в течение ~ 5 мин. При необходимости замените бабочку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При правильной перфузии внутренние органы (кроме селезенки) начинают отбеливаться в течение 1−2 мин.
   5. Переведите перфузию на ледяной 4% раствор параформальдегида (PFA) в течение ~5 мин. Изолируют весь мозг, как описано на этапе 2.2.2, и фиксируют в течение 24 ч в 4% растворе PFA при 4 °C.
   6. Инкубируют мозг в 30% растворе сахарозы в течение 48 ч при 4 °C. Удалите оставшуюся сахарозу сухой папиросной бумагой и заморозьте мозг на металлической пластине (-80 °C). Храните мозг при -80 °C для процедур ^{окрашивания13}.

2. Процедуры отбора проб для липидомического/транскриптомного анализа

1. Подготовьтесь к отбору проб.
   1. Предварительноохлаждаемые ЭДТА-трубки для отбора проб плазмы до 4 °C. Предварительно охладить центрифугу и вихревой аппарат до 4 °C. Предварительно охладите металлическую пластину, покрытую алюминиевой фольгой (чтобы защелкнуть замороженный мозг и / или другие ткани, представляющие интерес) на сухом льду (-80 ° C). Предварительно охладить меченые 2 мл и 5 мл пробирки на сухом льду (-80 °C) для аликвот плазмы, замороженной ткани и сбора мозга соответственно. Используйте янтарные трубки для защиты светочувствительных молекул, таких как EIC.
   2. Очистите оборудование для отбора проб и изоляции тканей (хирургические ножницы, прямые острые тонкие ножницы, прямые гладкие стандартные щипцы, тонкие щипцы с зеркальным покрытием, изогнутые щипцы и шпатель, пластину из пенополистирола и иглы для фиксации) дезинфицирующим средством (например, 70% этанолом).
2. Протоколы отбора проб
   1. Определите порядок отбора проб.
      1. Собирать кровь сразу после обезглавливания в предварительно охлажденных пробирках ЭДТА объемом 1 мл (см. шаг 2.2.3).
      2. Удалите весь мозг и заморозьте сразу после удаления. Этот шаг займет 1−2 мин. Храните замороженный мозг при -80 °C для дальнейшей обработки (см. шаг 2.2.2).
      3. Удалить периферические органы, представляющие интерес (например, легкие, сердце, печень), в течение 5 мин после удаления мозга, а также заморозить и хранить при -80 °C для дальнейшей обработки (см. этап 2.2.4).
   2. Удалить мозг для рассечения или пробивки процедур. Эта процедура занимает 1−2 мин/мозг.
      1. После обезглавливания (см. шаг 1.2) начните делать разрез средней линии в коже с помощью мелких ножниц. Освободите череп, перевернув кожу на глаза. Дотянитесь до верхней части черепа и сделайте небольшой каудальный разрез, начиная с уровня внутритеменной кости. Избегайте разрезания мозга.
      2. Плотно прорежьте самую переднюю часть черепа между глазами, чтобы облегчить удаление мозга. Наклоните одну сторону теменной кости с помощью изогнутых узких щипцов и отломите. Повторите последний шаг для другой стороны.
      3. Удалите мозговые оболочки. Сдвиньте шпатель под переднюю часть мозга (т.е. обонятельную луковицу) и осторожно наклоните мозг вверх. Сдвиньте шпатель дальше вниз, чтобы сломать зрительный и другие черепно-мозговые нервы.
      4. Вытащите мозг из черепа и немедленно заморозьте весь мозг на предварительно охлажденной (-80 °C) металлической пластине с вентральной стороной, обращенной к металлической пластине (спинной вверх).
      5. Позвольте мозгу полностью замерзнуть и перейти в предварительно охлажденные 5 мл пробирки и хранить при -80 °C до рассечения областей мозга или процедуры пробивки (см. шаги 3.1. и 3.2).
   3. Выполните отбор проб плазмы.
      1. Спайковые предварительно охлажденные ЭДТА-пробирки с 10 мкл свежеприготовленного индометацина-разведения до целевой концентрации 10 мкМ.
      2. Соберите кровь ствола сразу после обезглавливания путем мягкого сжатия организма в предварительно охлажденные трубки ЭДТА до максимального объема крови 1 мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В случае правильного кровяного давления сдавливание не требуется. Если объем крови составляет менее 1 мл, уменьшите время инкубации изофлурана, чтобы обеспечить правильный кровоток.
      3. Немедленно центрифугируют пробирки крови по 2000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
      4. Удаляют полученную верхнюю фазу плазмы и с целью мультилипидного анализа аликвотируют определенные объемы плазмы в предварительно охлажденных пробирках 2 мл следующим образом: 50 мкл для анализа eCB/EIC, 30 мкл для анализа PL и оставшийся объем плазмы в качестве резервного образца или для других типов анализа.
      5. Храните образцы плазмы при температуре -80 °C для дальнейшего извлечения (см. этапы 4.1.2 и 4.1.4).
   4. Выполните забор периферических органов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ссылки на анатомию ^мышей16 и документацию, предоставленную для обязательных курсов (FELASA), посещаемых исследователями животных, для идентификации отдельных органов, их соединительных тканей и / или кровеносных сосудов.
      1. Обездвижьте туловище мыши, чтобы облегчить удаление органов с помощью игл. Сделайте вентральный разрез средней линии с помощью прямых острых ножниц на высоте лобка. Используйте тупые стандартные щипцы для фиксации брюшной стенки во время разрезания, чтобы открыть брюшную полость.
      2. Обездвижить кожу, чтобы позволить удаление органов брюшной полости с помощью тупых щипцов. Для удаления сердца или легких продолжайте медиальный разрез в направлении грудной пещеры. Удалите легкие и / или сердце с помощью тонких щипцов.
      3. Осторожно откройте грудную полость, чтобы избежать кровотечения. Разрезайте соединительные ткани и кровеносные сосуды, закрепляющие соответствующий орган, не разрезая орган.
      4. Переложите кусочки ткани сразу на предварительно охлажденные металлические пластины (-80 °C) и дайте полностью замерзнуть. Переложите кусочки ткани в предварительно охлажденные пробирки и храните при -80 °C для дальнейшей обработки (см. этап 4.1).

3. Биологическая обработка материала

ПРИМЕЧАНИЕ: Для совместной экстракции eCB/EIC используйте 2 мл янтарных трубок в качестве экстракционных трубок и добавляйте в каждую трубку семь предварительно охлажденных стальных шариков. Для совместной экстракции PL/eCB и для двойной совместной экстракции липидов и РНК используйте 2 мл экстракционных трубок без РНК, шипованных керамическими шариками (Таблица материалов).

1. Выполняют рассечение мозга и обработку периферических органов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте увеличительные лампы для увеличения видимости мозга для рассечения.
   1. Очистите хирургические инструменты, в том числе щипцы с очень тонкими наконечниками, в 2 раза с 70% этанолом.
   2. Перенесите замороженный мозг с -80 °C в чашку Петри, содержащую предварительно охлажденный физиологический буфер (рН 5,5) Убедитесь, что чашка Петри находится при 4 °C. Позвольте мозгу полностью разморозиться, чтобы позволить рассечение. Тщательно проверяйте с помощью щипцов.
      ВНИМАНИЕ: Не держите мозг при температуре 4 °C дольше, чем требуется для размораживания.
   3. Предварительно охладите металлическую пластину на льду (4 °C) и накройте ее влажными тканями, пропитанными ледяным физиологическим буфером (рН 5,5), и аккуратно перенесите мозг вентральной стороной вверх на предварительно охлажденную (4 °C) металлическую пластину на льду. Накройте его влажными тканями, пропитанными ледяным физиологическим буфером (рН 5,5).
   4. Рассекайте области мозга в течение максимум 5 минут, используя супер тонкие щипцы. Начните с гипоталамуса (HYP) и поверните спинную сторону вверх, чтобы продолжить с правой стороны. Изолируйте гиппокамп (HCr), префронтальную кору (PFCr), полосатое тело (STRr) и кору головного мозга (cCTXr). Затем рассекните левую сторону. Изолируйте гиппокамп (HCl), префронтальную кору (PFCl), полосатое тело (STRl) и кору головного мозга (cCTXl). Рассечение мозжечка и таламической области. Используйте опубликованные анатомические ^{ссылки16,17} для идентификации области мозга.
   5. Переложите каждый рассеченный кусок непосредственно на покрытую алюминиевой фольгой предварительно охлажденную металлическую пластину (-80 °C). Позволяют заморозить и перенести изолированные участки мозга в меченые предварительно охлажденные 2 мл пробирки.
   6. Измельчите кусочки ткани с помощью тканевого измельчителя (при -80 °C), избегая оттаивания ткани. В холодном помещении аликвотный тканевый порошок в меченых, предварительно охлажденных экстракционных трубках, содержащих керамические бусины или стальные шарики. Для двойного анализа липидомики / транскриптомики взвесьте аликвоты порошка ткани в холодной камере. Для анализа только на липидомику выбирайте между нормализацией веса тканей или содержанием белка. Для последних действуйте дальше без взвешивания тканей.
   7. Разрезать ткани периферических органов на кусочки с максимальным весом 20 мг. Приступайте к измельчению тканей, как показано на этапе 3.1.6.
   8. Продолжайте извлечение образцов тканей (см. этапы 4.1.1, 4.1.3 или 4.1.5) или храните пробирки при -80 °C для последующего извлечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица мозга также может быть использована, если позволяет дизайн исследования. Однако метод больше подходит для дискретного и ограниченного числа областей мозга, и нецелесообразно препарировать и изолировать все вышеупомянутые области мозга в установленные сроки.
2. Выполняйте удары мозгом.
   1. Установите целые, замороженные мозги на монтажную систему (Таблицу материалов) в криостате. Установите толщину 50 мкм и нарежьте в режиме обрезки близко к интересующей области.
   2. Окрашивание мозгового среза (18−20 мкм) с использованием толуидина синего (0,1%−1%) в качестве ориентира для локализации интересующего субрегиона. Осмотрите окрашенные срезы с помощью микроскопа, чтобы определить области, представляющие интерес для пробивки. Используйте атлас мышей в качестве ссылки, чтобы найти соответствующие анатомические области ^мозга16. Возьмите перфораторы диаметром 0,8−1,0 мм с помощью пробоотборников в предварительно охлажденных пробирках.
   3. Взвешивайте замороженные перфораторы в холодильной камере в маркированных, предварительно охлажденных экстракционных трубках объемом 2 мл, содержащих керамические шарики или стальные шарики. Используйте янтарные трубки для совместной экстракции eCB и EIC.
   4. Начните экстракцию (см. этапы 4.1.1, 4.1.3 или 4.1.5) или храните трубы при -80 °C для дальнейшей экстракции.
3. Выполните плазменную обработку.
   1. Поместите замороженные образцы плазмы на лед (4 °C) и дайте им оттаять (~20 мин).
   2. Убедитесь, что плазма полностью разморожена перед началом экстракции.
   3. Продолжите процедуру плазменной экстракции (см. шаги 4.1.2 или 4.1.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы плазмы должны оставаться при температуре -80 °C до экстракции. Избегайте циклов оттаивания и повторного замораживания.

4. Процедуры экстракции

1. Выполнение протоколов совместной экстракции липидов жидкостью и жидкостью (LLE).
   1. Выполняйте совместное извлечение eCB и EIC из кусочков мозга, пуншей или образцов порошка тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры требуется точное дозирование.
      1. Поместите на лед экстракционные трубки, содержащие образцы тканей и семь стальных шариков (4 °C). Добавить 600 мкл ледяного МТБЭ и 50 мкл ACN/_H2O (1:1; v/v), содержащие внутренние стандарты. Целевая концентрация внутренних эталонов в конечном объеме для анализа (50 мкл) выглядит следующим образом: 1 нг/мл AEA-d4, 125 нг/мл 2-AG-d5, 3 000 нг/мл AA-d8, 2 нг/мл OEA-d4; ПЭА-д4, 12,5 нг/мл 1-АГ-д5, 2,5 нг/мл PGF2α-d4 и 5 нг/мл для ПГД2-д4; ПГЕ2-д9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 и TXB2-d4 соответственно.
      2. Добавьте 400 мкл 0,1 М муравьиной кислоты и гомогенизируйте тканевым лизером (30 с-1 мин). Центрифугировать гомогенат в течение 15 мин при 5 000 х г при 4 °C. Оставьте заморозку водной нижней фазы в течение 10 мин при -80 °C, чтобы облегчить перенос верхней органической фазы.
      3. Перенос органической фазы в новые пробирки. Испаряют под мягким потоком _N2 при 37 °C и восстанавливают в 50 мкл ACN/_H2O (1:1; v/v) для дальнейшего анализа.
      4. Храните водную фазу при -20 °C или -80 °C для дальнейшего анализа содержания белка.
   2. Выполнение совместной экстракции eCB и EIC из образцов плазмы.
      1. Оттаивание плазменных аликвот при 4 °C. Добавить 800 мкл МТБЭ и 50 мкл ACN/_H2O (1:1; v/v), содержащие внутренние стандарты (аналогичные тем, которые используются для анализа тканей, см. шаг 5.1.1). Оптимизируйте внутреннюю стандартную концентрацию для спайков с использованием эталонных образцов плазмы.
      2. Добавляют 600 мкл 0,1 М муравьиной кислоты и вихревые образцы при 4 °C в течение 2 мин. Образцы центрифуги при 4 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
      3. Перенесите органическую фазу в новые трубки, испаритесь под мягким потоком _N2 при 37 °C и восстановите в 50 мкл ACN/_H2O (1:1; v/v) для анализа LC/MRM.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, избегайте хранения высушенных экстрактов EIC и немедленно приступайте к анализу LC/MRM. Если хранения не избежать, прибегают к кратковременному хранению только в течение 2−3 дней при 4°С с образцами в инъекционном растворителе LC.
   3. Выполните совместную экстракцию PL и eCB из областей мозга, ударов или других образцов порошка тканей.
      1. Поместите экстракционные трубки, содержащие образцы тканей и керамические шарики, на лед (4 °C). Добавьте 800 мкл МТБЭ/МеОГ (10:3; v/v) и 10 мкл MeOH, содержащего внутренние стандарты. Целевая концентрация внутренних эталонов в конечном объеме для анализа (100 мкл) выглядит следующим образом: 150 нг/мл для ПК 17:0/14:1, ПЭ 17:0/14:1, ПА 17:0/14:1, 100 нг/мл PG 17:0/14:1; ПС 17:0/14:1; ПИ 17:0/14:1; LPC 17:0; ЛПА 17:0; SM d18:1/12: 0,1 нг/мл AEA-d4, 60 нг/мл 2-AG-d5, 4 000 нг/мл AA-d8, 2 нг/мл OEA-d2 и 3 нг/мл PEA-d4 соответственно.
      2. Добавьте 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты, содержащей 25 мкМ тетрагидролипстатина/URB597 и 50 мкг/мл BHT. Гомогенизировать с помощью тканевого гомогенизатора (Таблица материалов) и центрифуги при 5000 х г и 4 °C в течение 15 мин.
      3. Восстанавливают верхнюю органическую фазу в новых трубках и испаряют под мягким потоком _N2 при 37 °C. Восстановите в 90 мкл MeOH и либо храните при -20 °C или -80 °C, либо переходите к следующему шагу.
      4. Добавьте 10% _H2O к аликвоте липидного экстракта (4.1.3.3) и введите 10 мкл в LC/MS для анализа PL. Для дальнейшего анализа eCB перейдите к этапу 4.3.5.
      5. Взять аликвоту экстракта (4.1.3.3), испарить до сухости и восстановить в ACN/_H2O (1:1; v/v). Используйте 20 мкл для инъекции LC/MS для анализа eCB.
   4. Выполнение совместной экстракции ПЛ и эХБ из образцов плазмы.
      1. Размораживают плазменные аликвоты при 4 °C, добавляют 1000 мкл МТБЭ/метанола (10:3; v/v) и 10 мкл MeOH, содержащих внутренние эталоны (аналог стадии 4.1.3) и вихревые при 4 °C в течение 1 мин.
      2. Добавьте 250 мкл _H2O и вихрь в течение 45 мин при 4 °C. Образцы центрифуг в течение 15 мин при 5 000 х г и 4 °C. Восстанавливают верхнюю органическую фазу, испаряют под мягким потоком _N2 при 37 °C и восстанавливают в 90 мкл метанола для дальнейшего анализа LC/MS. Хранить при температуре -20 °C или -80 °C или перейти к следующему шагу.
      3. Для анализа ПЛ добавьте 10% воды к аликвоте липидного экстракта (4.1.2.2).
      4. Для анализа eCB добавьте 10% воды к аликвоте липидного экстракта (см. пункт 4.1.4.3), испарите до сухости и восстановите в 50% ACN/_H2O (1:1; v/v).
   5. Выполните двойную экстракцию РНК и липидов (совместная экстракция PL и eCB) из образцов тканей.
      ВНИМАНИЕ: Обеспечьте работу в условиях, свободных от РНК, чтобы избежать деградации РНК.
      1. Разморозьте тканевые порошковые аликвоты или мозговые пучки (при 4 °C) и добавьте 600 мкл буфера RLT, содержащего 5 мкМ THL/URB597, 10 мкг/мл BHT и 1% β-меркаптоэтанола (для процентов конечного объема буфера гомогенизации см. этап 4.1) вместе с 200 мкл хлороформа в экстракционные трубки, содержащие замороженные мозговые пунши и керамические шарики.
      2. Шиповые образцы с 10 мкл внутренней стандартной смеси для совместной экстракции ПЛ и eCB (см. этап 4.1.3) и гомогенизация с помощью гомогенизатора тканей (высокая скорость, 20 с).
      3. Передавайте лизаты в новые центрифужные трубки и центрифугу в течение 5 мин на полной скорости и 4 °C, чтобы обеспечить разделение фаз.
      4. Восстановление и использование верхней фазы для экстракции РНК с использованием стандартных наборов процедур экстракции РНК (Таблица материалов). Элюированная РНК в общем объеме 50 мкл воды без РНКазы и хранится при -80 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Образец на этапе 4.1.5.4 поддается как секвенированию РНК, так и qPCR с использованием соответствующих методов и инструментов.
      5. Используйте нижнюю хлороформсодержащую фазу для экстракции липидов. Добавьте 800 мкл МТБЭ/метанола (10:3; v/v) и 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты и вихрь в течение 45 мин при 4 °C. Восстанавливают верхнюю органическую фазу и испаряют под мягким потоком _N2 при 37 °C.
      6. Восстанавливают в 90 мкл метанола для дальнейшего анализа ЛК/МС. Хранить при температуре -20 °C или -80 °C или перейти к шагу 5.
      7. Добавьте 10% _H2O к аликвоте липидного экстракта (см. выше этап 4.1.5.6) и введите 10 мкл в LC/MS для анализа ПЛ. Для дальнейшего анализа eCB перейдите к этапу 5.7.
      8. Взять аликвоту экстракта (см. выше этап 4.1.5.6) испарить до сухости и восстановить в ACN/_H2O (1:1; v/v). Используйте 20 мкл для инъекции LC/MS для анализа eCB (аналогично шагу 4.3.5).

5. Качественное и количественное профилирование LC/MRM

1. Подготовка систем растворителей LC, калибровочных растворов и образцов контроля качества.
   1. Для ПЛ готовят подвижную фазу А: метанол/воду (1:1; об/об), содержащую 7,5 мМ формиата аммония и 0,1% ЧАЯ. Получают подвижную фазу B: метанол/изопропанол (2:8; v/v), содержащий 7,5 мМ формиата аммония и 0,1% TEA. Храните растворители в бутылках LC.
   2. Для разделения eCB и eiC готовят следующие LC-растворители: 0,1% муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы A и 100% ACN, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, в качестве подвижной фазы B. Храните растворители в бутылках LC.
   3. Подготовка контроля качества с использованием калибровочных стандартов и внутренних стандартов (таблица 3) в эквимолярной или определяемой пользователем концентрации.
   4. Подготовьте калибровочные кривые с семью точками концентрации. Используйте одну и ту же внутреннюю стандартную партию для пикирования в растворе калибровочной кривой и в образцах, подлежащих анализу.
2. Используйте метод LC-MRM для качественного и количественного профилирования липидов.
   1. Откройте вкладку Build Acquisition Method (Метод сборки ) в коммерческом программном обеспечении (например, Analyst) и выберите режим LC/MRM с переключением полярности. Заданные в методе ионные переходы (как приведено в таблице 3) для количественного профилирования. Установите время успокоения равным 50 мс.
   2. Для профилирования ПЛ задайте следующие параметры источника ионов: газ завесы = 40 фунтов на кв. дюйм; температура нагревателя источника = 550 °C; напряжение ионного распыления = -4 500 В в режиме отрицательных ионов и = +5 200 В в режиме положительных ионов.
   3. Для совместного анализа эХБ и ЭИК задайте следующие параметры: газ завесы = 40 фунтов на кв. дюйм; температура нагревателя источника = 550 °C; напряжение ионного распыления = -4 500 В в режиме отрицательных ионов и = +4 500 В в режиме положительных ионов.
   4. Для анализа PL установите нагрев колонны на 45 °C и скорость потока на 200 мкл/мин и установите следующий градиент: min 0 = 40% B; мин 3 = 40% В; мин 42 = 90% В; мин 43 = 99% В; min 50 = 99% B, и min 52 = 40% B. Установите объем инъекции на уровне 10 мкл.
   5. Для анализа eCB и eCs установите температуру колонки при комнатной температуре и установите следующий градиент: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; мин 5 = 50% В, мин 12 = 50% В; мин 13 = 90% В, мин 17 = 90% В; мин 17,5 = 20% В; min 20 = 20% B. Установите объем впрыска на уровне 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия MRM могут варьироваться между инструментальными платформами, поэтому условия фрагментации и MRM должны быть экспериментально выведены, а параметры ионизации должны быть проверены и скорректированы, если это необходимо, чтобы получить максимальную чувствительность и селективность.
3. Выполните пакетный анализ.
   1. Откройте пакет Build Acquisition и заполните необходимые параметры для описания образца, расположения в стойке образцов автосамплера и метода сбора (задайте шаг 5.2).
   2. Всегда включайте контроль качества в начале и в конце анализа и в рамках партии. После каждых 25−30 образцов включают по меньшей мере три калибровочные кривые в партию и включают этап промывки с растворителем по выбору после каждого образца контроля качества, калибровочной кривой и в конце партии образца.
   3. Передавайте образцы, полученные на этапе 4, во флаконы LC/MS. Поместите образцы в загрузочные стойки автопробоотборника LC в соответствии с положением, определенным в партии, и загрузите стойку для образцов в автопробоотборник LC.
   4. Отправьте пакетный и начните анализ очереди.
4. Количественная оценка липидов
   1. Используйте коммерческое программное обеспечение (например, Analyst) и встроенный модуль количественной оценки для количественной оценки eCB и EIC, а также коммерческое программное обеспечение (например, Multiquant) для количественной оценки ПЛ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Второе программное обеспечение может также использоваться для eCB и EIC, особенно когда один внутренний стандарт используется для количественной оценки нескольких аналитов.
   2. Откройте метод построения количественной оценки и заполните параметры для аналитов, внутренних стандартов, переходов управления записями сообщений и припишите внутренние стандарты анализируемым аналитам (таблица 3). Установите минимальную пиковую высоту 500 cps.
   3. Использовать следующие критерии или их комбинацию для присвоения липидной идентичности и последующей количественной ^{оценки6}: сопоставление времени удержания липидных эндогенных аналитов с калибровочными стандартами и/или дейтерированными внутренними стандартами, если таковые имеются; согласование ионов фрагментов путем фрагментации положительного и отрицательного ионного режима для данного м/з липидных аналитов, для которых не предусмотрены стандарты; выведенное в литературе элюирующее поведение липидов в аналогично используемых условиях LC для рассечения изомерных и/или изобарических структур; и, при наличии, анализ LC/MS и MS/MS с масс-спектрометрией высокого разрешения с использованием условий LC, аналогичных условиям LC для целевого анализа (с использованием LC/MRM), для точной идентификации идентичности и элюционного поведения эндогенных липидов, представляющих ^{интерес18,19}.
   4. Для валидации пакетного анализа используют следующие критерии: точность количественной оценки ≤ ±20%; коэффициент регрессии ≥0,97 (в идеале ≥0,99).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям по разработке и валидации биоаналитических методов для обеспечения надежного, воспроизводимого анализа молекул-мишеней.

Результаты

Набор описанных протоколов может быть объединен на различных уровнях в соответствии с конкретными целями, такими как выбор модели животного происхождения, маршрут отбора проб, метод извлечения и профилирования (фиг.1).

Чтобы определить изменения уровня липидов в головном мозге и периферии в течение времени острого состояния эпилептического припадка и разгадать потенциальный противоэпилептический эфф...

Обсуждение

Нейролипидомная и транскриптомная методология, описанная здесь, является жизнеспособным средством для исследования любого заболевания или здорового развития при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферических органах. Благодаря оптимизированному отбору образцов плазмы и процедурам обработки, липидомный анализ плазмы также может проводиться у тех же животных, принесенных в жертву для тканевой липидомики и транскриптомики, что повышает надежность молекулярных коррелятов тканевой крови и обнаружения би...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100	Bioanalyzer Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Амплификатор ПЦР в реальном времени	Прикладные биосистемы		Контрольно-измерительные приборы/количественная ПЦР
Ацетонитрил LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Растворитель/LCMS
янтарные пробирки Эппендорфа	Eppendorf		Sample Prep.
Аналитик 1.6.2 Программное обеспечение	AB SCIEX, Дармштадт		Программное обеспечение
Аналитические весы	Mettler Toledo		Контрольно-измерительные приборы/подготовка образцов.
Арахидоновая кислота-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Бреда, Нидерланды)		Контрольно-измерительные приборы/подготовка образцов.
Bino	Zeiss		Microscopy
расщепленные антитела к каспазе 3	Cellsignaling	9661S	Микроскопия
Криостат, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Подготовка образцов.
Автосэмплер CTC HTC PAL	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Изогнутые щипцы Dumont Dumoxel #7	FST	11271-30	Хирургические инструменты
Щипцы Dumont Super Fine Tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Хирургические инструменты
EDTA 1000 A Rö hrchen	Kabe Labortechnik	078001	подготовка образцов.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Контрольно-измерительные приборы/подготовка образцов.
Тонкие щипцы Зеркальная отделка	FST	11412-11	Хирургические инструменты
Тонкие ножницы радужной оболочки глаза прямые острые	FST	14094-11	Хирургические инструменты
Тонкие ножницы Карбид вольфрама прямые	FST	14568-09	Хирургические инструменты
Шпатель радужной оболочки	FST	10094-13	Хирургические инструменты
Каиновая кислота	Abcam	ab120100	Эпилептическое лекарство
Программное обеспечение для просмотра липидов	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5&микро; m C18(2)- HAST 100A LC колонка	Phenomenex	00D-4446-B0	Контрольно-измерительные приборы/
Увеличительная лампа	Maul GmbH		Контрольно-измерительные приборы/Подготовка образцов.
Метанол LC-MS Chroma Solv 99,9%	Honeywell	9814920	Растворитель/LCMS
Motic Camara	Мотическая		микроскопия
MTBE	Honeywell	34875-1L	Растворитель/LCMS
MultiQuant 3.0 Программное обеспечение для количественного определения	SCIEX, Дармштадт		Программное обеспечение
NanoDrop 2000c Спектрофотометр	Thermo Scientific		Контрольно-измерительные приборы/кПЦР
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Липидный стандарт
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kü gelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Подготовка образцов.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Подготовка образцов.
Precellys-keramik-kit 1,4 мм	VWR	91-PCS-CK14	Подготовка образцов.
Простагландин D2	Biomol	Cay 12010	Липидный стандартный
простагландин D2-d4	Biomol	Cay 312010	Липидный стандартный
простагландин E2	Biomol	Cay10007211-1	Липидный
стандартный простагландин E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Липидный стандартный
PS 17:0-14:1	Аванис Поларис	LM-1304	Липидный стандартный
ловушка Q 5500 тройная квадрупольная линейная ионная ловушка MS	AB SCIEX		Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - набор РНКазы без ДНКазы (50)	Qiagen	79254	Подготовка образцов.
Защитная колонка	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Накладки Shandon	Thermo Fisher	72110017	микроскопия
Shandon Стеллаж и крышка для слайдов	Thermo Fisher	73310017	микроскопия
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Липидный стандарт
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Липидный стандарт
Стандартные щипцы прямые гладкие	FST	11016-17	Хирургические инструменты
Хирургические ножницы ToughCut Стандартный шаблон	FST	14130-17	Хирургические инструменты
T3000 Термоамплификатор	Biometra		Инструменты/qPCR
Тромбоксан B2	Biomol	Cay19030-5	Липидный стандартный
тромбоксан B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Липидный стандарт
Тканевый лизер II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Контрольно-измерительные приборы/Подготовка образцов.
Ткань Tek	Sakura Finetek	4583	Микроскопия
Toluidinblau	Roth	0300.2	Микроскопия
Vapotherm	Barkey	4004734	Контрольно-измерительные приборы/Подготовка образцов.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	растворитель/LCMS