Методическая статья

Анализ комбинаторной Мирна процедуры регулируют клеточный цикл и ангиогенез

DOI:

10.3791/59460

⸱

30 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мирна терапии имеют значительный потенциал в регулировании прогрессии рака. Продемонстрировали здесь аналитические подходы используются для идентификации деятельности комбинаторной Мирна лечения в прекращение клеточного цикла и ангиогенеза.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак легких (LC) является ведущая причина рак родственных смертей во всем мире. Другие раковые клетки, фундаментальной характеристикой LC клеток является Нерегулируемое распространение и деление клеток. Было показано, что ингибирование распространения путем прекращения клеточного цикла прогрессии быть перспективным подходом для лечения рака, в том числе LC.

Мирна терапии появились как важный post-transcriptional генов регуляторов и все чаще в настоящее время изучаются для использования в лечении рака. В недавней работе мы использовали два адаптивной, мир-143 и мир-506, регулировать клеточный цикл прогрессии. A549 легких немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) клетки были transfected, были проанализированы изменения выражения гена, и наконец была проанализирована apoptotic активности из-за лечения. Даунрегуляция циклин зависимых киназ (CDKs) были обнаружены (то есть, CDK1, CDK4 и CDK6), и клеточного цикла в G1 (Ы) и G2/М фазовых переходов. Путь анализ свидетельствует о потенциальной деятельности антиангиогенных лечения, который наделяет подход с многогранной деятельности. Описанные здесь методологии, используемые для идентификации Мирна деятельности относительно ингибированием клеточного цикла, индукции апоптоза и эффекты лечения на эндотелиальных клеток торможение ангиогенеза. Предполагается, что представленные здесь методы будут поддерживать будущие исследования Мирна терапии и соответствующей деятельности и что репрезентативных данных будет руководствоваться другие исследователи в ходе экспериментальных анализов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточный цикл представляет собой сочетание нескольких регулирования событий, которые позволяют дублирования ДНК и клеток распространения через mitotic процессов1. Циклин зависимых киназ (CDKs) регулирования и содействия клеточного цикла2. Среди них митотическая CDK (CDK1) и межфазных CDKs (CDK2, CDK4 и CDK6) имеют ключевую роль в клеточный цикл прогрессия3. Белка ретинобластомы (Rb) фосфорилированных, комплекс CDK4/CDK6 разрешить клеточного цикла прогрессии4, и CDK1 активация необходима для успешного клеточного деления5. Многочисленные CDK ингибиторы были разработаны и оценены в клинических испытаниях за последние несколько десятилетий, что свидетельствует о возможности таргетинга CDKs в лечении рака. В самом деле, три CDK ингибиторы были одобрены для лечения рака молочной железы недавно6,,78,9,10. Таким образом, CDKs, и в частности, CDK1 и CDK4/6, представляют большой интерес в регулировании прогрессии рака клеток.

небольшие, некодирующих РНК и post-transcriptional регуляторы экспрессии генов, регулирующих примерно 30% всех человеческих генов11интерферирующим (Мирс). Их деятельность основана на поступательной репрессий или деградации messenger РНК (мРНК)12. Характеризует их биологическое значение, были определены более чем 5000 адаптивной и один Мирна молекула может регулировать несколько генов11,13. Что еще более важно Мирна выражение был связан с различными заболеваниями и статусов болезней, включая рак13. В самом деле, адаптивной характеризовались как онкогенных или супрессоров, способного содействовать или подавлять опухоли и развитие14,15. Относительное выражение интерферирующим в пораженной ткани можно регулировать прогрессирования заболевания; Таким образом экзогенных доставки интерферирующим имеет терапевтический потенциал.

Рак легких является ведущая причина рак родственных смертей и более чем 60% всех злокачественных опухолей легких немелкоклеточного клетки легких Рак16,17, с 5-летняя выживаемость менее чем 20%18. Использование мир-143-3 p и мир-506-3 p недавно была проведена оценка для ориентации клетки циклов в легких рак клеток11. Мир-143 и мир-506, последовательности, взаимодополняемости, CDK1 и CDK4/CDK6, и были проанализированы последствия этих двух Мирс на A549 клетки. Экспериментальные данные представляются и обсуждаются в настоящем документе. Экспрессии генов, клеточный цикл прогрессии и апоптоз были оценены с использованием различных экспериментальных образцов и после transfection timepoints. Мы использовали реального времени количественные методы PCR (RT-ПЦР) наряду с microarray анализ для оценки экспрессии определенных генов, и следующего поколения РНК последовательности был использован для определения глобальных гена dysregulation11. Последний метод определяет относительное обилие транскрипт каждого гена с высокой чувствительностью и воспроизводимости результатов, в то время как тысячи генов могут быть проанализированы из одного экспериментального анализа. Кроме того анализ apoptotic вследствие обращения Мирна была выполнена и описан здесь. Биоинформатика дополнены путь анализа. Здесь представлены протоколы используются для анализа терапевтический потенциал комбинаторной мир-143 и мир-506.

Основная цель настоящего Протокола заключается в идентификации эффекты интерферирующим в клетках, с акцентом на клеточный цикл. Разнообразие методов представлены здесь диапазон из анализа выражения гена предварительный перевод (с помощью ПЦР) для разработки и новые методы для анализа гена на уровне белков, таких как microarray анализ. Остается надеяться, что этот доклад является полезным для исследователей, заинтересованных в работе с адаптивной. Кроме того представлена методология анализа потока гранулярных клеточного цикла и апоптоз клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. мир-143 и мир-506 Трансфекция

Предупреждение: Используйте латексные перчатки, защитные очки и пальто лаборатории при выполнении описанных экспериментов. При необходимости, используйте биобезопасности кабинет с корпусной Вентилятор, без блокирования дыхательных путей или нарушая ламинарного воздушного потока. Всегда устанавливайте защитные стекла на соответствующую высоту, как описано заводом-изготовителем.

  1. Семя НМРЛ A549 клетки в T25 см2 колбу/6/96 хорошо пластины в среде DMEM/F12K СМИ дополнена 10% FBS и 1% пенициллин стрептомицином (Культура СМИ) в культуре ткани капюшоном и инкубировать на ночь при 37 ° C с 5% CO2 в инкубатор культуры ткани.
  2. Приостановить мир-143 и/или мир-506 мимики, или карабкаться siRNA с transfecting агента (2,4 мкг мир были смешаны с 14 мкл transfecting агента; см. Таблицу материалы) в 500 мкл трансфекции СМИ и 1,5 мл сыворотки и антибиотик бесплатно DMEM/F12K СМИ Окончательный Мирна концентрации 100 Нм. Мирна сумма может потребоваться оптимизация на различных клеток и концентрации. Соответствующие подходы включают transfection клетки с увеличением концентрации микроРНК (т.е., 50-200 Нм) и оценки Даунрегуляция выражение генов интерес.
  3. Извлеките культуры из колбы/плиты и мыть раз с ПБС.
  4. Добавить Мирна/схватка transfecting агент комплексов и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 на 6 ч (фляга размер определяет объем добавлен инкубации).
  5. Замените 4 мл культуры средств массовой информации СМИ и инкубации клеток для 48 ч или 24 ч.
  6. Урожай transfected клеток trypsinization, добавляя 1 мл трипсина-ЭДТА в каждом T25 см2 фляги, Проинкубируйте 5-10 мин при 37 ° C и добавить 3 мл культуры средств массовой информации для сбора клеток. Поместите содержимое каждого колбу в отдельный, отмеченные 15 мл трубку. Работа в культуре ткани капюшоном.
  7. Центрифуга на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
    Примечание: Осторожность требуется во время удаления супернатанта, как возбуждение трубки может привести к потере клеток.
  8. Добавить 2 мл ПБС и центрифуги для 5 мин в 751 x g.
  9. Повторите шаги 7 и 8 раз, чтобы удалить все следы средств массовой информации и супернатант.
    Примечание: На данном этапе, пробоотборные трубки могут храниться при температуре-80 ° C или могут быть использованы немедленно.

2. РНК добыча

  1. Очистите рабочую область путем распыления с 70% изопропиловый спирт и РНКазы обеззараживания решения.
  2. Извлечение RNA должны производиться с использованием соответствующих РНК комплекта (см. Таблицу материалы).
  3. Удаление трубы от-80 ° C и позволяют им оттепель. Добавьте 300 мкл буфера lysis и пипетки вверх и вниз, чтобы разорвать клеточной мембраны.
  4. Добавление равным объемом 100% ультра-чистого этанола.
  5. Хорошо перемешайте и место в разделения столбцов.
  6. Центрифуга между 11 и 16 x g 30 s и удаление потока через.
  7. 400 мкл отмывающего буфера и центрифуги для удаления буфера.
  8. 5 мкл DNAse I с 75 мкл ДНК пищеварения буфер в каждом образце и Инкубируйте 15 мин.
  9. Вымойте образца с 400 мкл буфера приготовительный РНК.
  10. Вымойте 2 x с РНК мыть буфера.
  11. Добавьте нуклеиназы свободной воды в столбец, центрифуги, затем собирают РНК.
  12. Мера общая концентрация РНК с Спектрофотометр UV.

3. RT-ПЦР

  1. До RT-ПЦР синтеза cDNA. После количественного определения концентрации РНК место 1 мкг РНК в 20 мкл конечный объем реакции подготовить cDNA в ПЦР-пробирку. Всегда работает на чистой скамейке.
  2. Все другие необходимые ингредиенты включены в таблице 1.
ИнгредиентыКоличество (мкл) / sample (20 мкл)
5 X cDNA мастер смесь4
дНТФ2
Случайные hexamers1
RT-усилитель1
Verso фермент смесь1
DNase и РНКазы свободной водыТребуемый объем после добавления РНК сделать 20 мкл

Таблица 1: Материалы для синтеза cDNA от образцов РНК. Требуется количество соответствующих ингредиентов для подготовки мастер смесь одного образца для синтеза cDNA.

  1. Инкубировать в тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий температуры: 42 ° C в течение 30 мин; 95 ° C на 2 мин; 4 ° C до сбора образцов.
  2. Сразу использовать в обычных ПЦР или ПЦР, или хранение cDNA при-20 ° C.
  3. Подготовка решений прямого и обратного грунт с DNase/РНКазы бесплатно воды в концентрации 10 мкм от штока грунтовочный раствор.
  4. Подготовьте отдельный мастер смеси для каждого гена быть обнаруженным, согласно количество выборок. Для каждого образца cDNA (ПЦР хорошо) реакции количество готовится согласно таблице 2.
ИнгредиентыКоличество (мкл) / sample (20 мкл)
Главный микс SYBR10
Форвард грунт - 10 мкм2
Обратный грунт - 10 мкм2
DNase и РНКазы свободной воды3
Образец cDNA3

Таблица 2: материалы для количественной ПЦР в реальном времени от образцов cDNA. Требуется количество ингредиентов для подготовки мастер смесь одного образца для ПЦР.

  1. Место каждого образца в соответствующих скважин.
  2. Разработка макета образца для 96 хорошо ПЦР плиты. Для каждого образца и проанализированы гена, выполняют реакции в triplicates, или по крайней мере в дубликаты.
  3. Печать 96 также пластины с оптически ясно клей крышкой.
  4. Быстрый спин пластине позволяют реакционную смесь добраться до нижней части каждой скважины.
  5. Запустите RT-ПЦР согласно следующей тепловой градиент:
    1) 50 ° C на 2 мин
    2) 95 ° C на 2 мин
    3) 95 ° C 15 s
    4) принять чтения
    5) 60 ° C для 1.5 мин
    6) повторите шаг 3 для 39 раз
  6. Запустите следующие тепловой градиент в продолжение выше, чтобы определить кривую плавления, которая указывает на усиление одного продукта.
    7) 65 ° C для 0.31 мин
    8) +0.5 ° C/цикл
    9) плита читать
    10) повторите шаг 8 для 60 раз до достижения 95 ° C
    11) 72 ° C на 2 мин

4. геля агарозы для подтверждения одного амплификации генов

  1. Подготовьте гель агарозы 1% в 1 x TBE буфера.
  2. Добавить бромид ethidium (бромистый этидий) в геля теплой (~ 50 ° C) до достижения окончательного концентрации примерно 0,2-0,5 мкг/мл. Бромистый этидий связывается с ДНК и позволяет ему быть визуализированы под ультрафиолетовым светом в гель тепловизор.
  3. Залейте теплой гель в каппу, поставляется с коробкой электрофореза геля. Прикрепите предоставленный гребень плотно для единообразного скважин.
  4. Разрешить гель для отдыха и остыть до комнатной температуры (RT) ~ 30 мин.
  5. Когда гель затвердевает, место в поле гель гель и лоток.
  6. Заполните поле гель с 1 x TBE буфера до тех пор, пока гель полностью покрыты.
  7. Измерение концентрации ДНК от процесса амплификации PCR с помощью УФ спектрометр.
  8. Возьмите ~ 15 нг ДНК в небольшой ПЦР-пробирку, 5 мкл красителя и добавить необходимое количество воды, свободной от нуклеиназы, для достижения общего объема 15 мкл.
  9. Загрузите лестница ДНК и образцы в колодцы.
  10. Побегите гель на 100 V до тех пор, пока краска линия является примерно 75-80% вниз геля.
    Примечание: Убедитесь, что гель проходит от отрицательных к положительным зарядом.
  11. Удалить гелем и поместите его в гель томографа визуализировать ДНК.

5. клеточный цикл анализа

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в колбе2 см T25 и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч затем урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий в 15 мл стерильные пробирки и маркировать их должным образом.
  4. Центрифугуйте образцы на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  6. Повторите шаг Стиральная с ПБС для удаления остаточных средств массовой информации.
  7. Ресуспензируйте и разорвать гранулы путем добавления 200 мкл ледяной ПБС закупорить.
  8. Исправьте клетки путем добавления 2 мл 70% ледяной этанола прикапывают в трубу во время vortexing аккуратно.
  9. Инкубировать трубы для 30 мин на RT и трубы на 4 ° C на 1 час.
  10. Удаление трубы из 4 ° C и центрифуги на 751 x g за 5 мин.
  11. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  12. 500 мкл ПБС пропидий йодидом (50 мкг/мл) и рибонуклеазы (200 мкг/мл)
  13. Инкубируйте 30 мин на RT защищая образцы от света.
  14. Получение данных о проточный цитометр. Используйте вперед против стороны точечной (FSC против SSC), чтобы выбрать основное население клеток, исключая мусора в левом нижнем углу FSC против SSC плотность сюжет и клеток кластеров в верхней Топ-правой стороне участка плотность FSC против SSC.
  15. Анализ данных для выявления клеточных популяций на стадии клеточного цикла с соответствующим программным обеспечением.

6. апоптоз пробирного

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в колбе2 см T25 и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий в 15 мл стерильные пробирки и маркировать их должным образом.
  4. Центрифуга на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  6. Повторите шаг Стиральная с ПБС для удаления остаточных средств массовой информации.
  7. Разбавить 10 x буфер привязки Annexin V 1 x с ледяной dH2O.
  8. Добавьте 1 mL 1 x буфер Annexin V привязки для каждого образца трубки и нежно ресуспензируйте.
  9. Суспензию клеток из мкл 96 место в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  10. Добавьте 1 мкл конъюгата Annexin V-FITC и 12,5 мкл пропидий йодидом (PI) в пробирку, содержащую суспензию клеток.
  11. Инкубируйте суспензию клеток для 10 мин на льду в темноте.
  12. Добавьте 250 мкл ледяной 1 x Annexin V привязки буфера в каждую пробирку образца для разбавления.
  13. Анализ образцов с проточный цитометр немедленно.

7. белков по microarray антитела клеточного цикла

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в T25 см2 фляги и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий для 15 мл пробирок и маркировать их соответствующим образом.
  4. Центрифуга на 751 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Добавить 2 мл ледяной ПБС, вихрь и центрифуги на 751 x g 5 мин отбросить супернатант.
  6. Повторите шаг Стиральная с ПБС.
  7. 150 мкл буфера lysis дополнена ингибиторов протеазы. Накапайте вверх и вниз осторожно, чтобы нарушить клеточные мембраны.
  8. Для предотвращения любых помех буфера lysis, выполняют буфера обмена заменить маркировки буфера, используя производителя растворителей обмена столбцы буфера lysis.
  9. Количественное определение общего белка с BCA assay.
  10. Возьмите 70 мкг белка образца и добавление меток буфера для достижения окончательный объем 75 мкл.
  11. Добавьте 100 мкл диметилформамида (DMF) 1 мг, биотина реагента (биотина/DMF).
  12. 3 мкл ДМФ биотина для каждого белка образец (биотинилированным белка) и проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
  13. Мкл 35 стоп реагента и смешать с vortexing.
  14. Проинкубируйте образцы в РТ за 30 мин.
  15. Удалите microarray слайды из холодильника, так что они теплые РТ за 1 час перед использованием.
  16. Выполнить блокировку для неспецифической привязки инкубировать слайды с 3% молока и сухого раствора (в блокировки реагента, предоставленный производителем) в чашку Петри с непрерывной тряски по 45 мин на RT.
  17. Вымойте слайды с водой2O ddH (если не указано иное, стирки происходит с ddH2O).
  18. Повторите шаг Стиральная ~ 10 x полностью удалить блокирующий решение от поверхности слайда. Это имеет важное значение для достижения единообразного и низкой фон.
  19. Удалить излишки воды с поверхности слайда и переходите к следующему шагу, не давая слайды сухой.
  20. Готовят раствор муфта, растворяя 3% сухое молоко в муфта реагента.
  21. Добавьте 6 мл раствора сцепления и полное количество образец протеина ранее подготовленных биотинилированным из шага 7.12.
  22. Место один слайд в одной скважиной камеры сцепления, предоставляемыми поставщиком и добавить ~ 6 мл белка, муфты микс на него.
    Примечание: Убедитесь, что слайд полностью погружен в сцепления раствора смеси белков.
  23. Обложка камеры сцепления и проинкубируйте втечение 2 ч на RT с непрерывной агитации в орбитальный шейкер.
  24. Перенести слайды в чашку Петри и добавьте 30 мл 1 x отмывающего буфера. Место в орбитальный шейкер чашку Петри, трясти за 10 мин и отменить решение.
  25. Повторите шаг 7.24 2 x.
  26. Промойте слайды с водой2O ddH широко, как описано в шагах 7.17 и 7.18 и переходите к следующему шагу немедленно, чтобы избежать высыхания.
  27. 30 мкл Cy3-стрептавидина (0.5 мг/мл), 30 мл буфера обнаружения.
  28. Слайд в чашку Петри и добавьте 30 мл обнаружения буфер, содержащий Cy3-стрептавидина.
  29. Инкубируйте в орбитальный шейкер для 20 мин с непрерывной тряски защищенный от света.
    Примечание: Cy-3 является Люминесцентную краску. Накрыть алюминиевой фольгой или работают в темных условиях для поддержания интенсивности флуоресценции.
  30. Выполните шаги 7.24-7.26 и позволяют на слайд, чтобы высушить с помощью нежный поток воздуха или размещение слайд в 50 мл Конические трубки и центрифуги на 1300 x g 5-10 мин.
  31. Поместите слайд слайд владельца и накрыть алюминиевой фольгой.
  32. Сканирование слайдов в microarray сканер с соответствующей длины волны возбуждения и выбросов. В случае Cy3, пик волны возбуждения находится в ~ 550 Нм и выбросов пика ~ 570 Нм.
  33. Анализ данных (см. Таблицу материалы) для используемого программного обеспечения).

8. РНК последовательности

  1. Семена 5 x 105 клетки для каждого образца в T25 см2 фляги и выполнить трансфекции согласно протоколу, описанных в разделе 1, шаги 1-5.
  2. После 24 ч и 48 ч урожай клетки, trypsinization.
  3. Передача клеточных суспензий для 15 мл пробирок и маркировать их соответствующим образом.
  4. Извлечь РНК согласно разделу 2, шаги 1-6.
  5. Проверьте качество РНК, а также концентрации с bioanalyzer. Целостность РНК Оценка (Рин) выше восемь и соответствующих гистограммах необходимы для подтверждения качества РНК.
  6. От всего РНК используйте ~ 2 мкг образца для РНК последовательности (РНК от всего РНК)
  7. Последовательность с помощью следующего поколения секвенсор11.
  8. Запустите качество отделки и карта с геном ссылку из FASTQ файлов, созданных из РНК последовательности машина11.
  9. Загружать файлы FASTQ и сырые чтения данных игр в генных банков, следуя инструкциям из < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> веб-сайт.
    Примечание: См. присоединение SRP133420 для предыдущих результатов.

9. трубка формирования пробирного

  1. Оценить потенциал ангиогенных Мирна transfected человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) 36 ч после трансфекции, как описано в разделе 1, шаги 1-5, с использованием клеток HUVEC вместо A549 клетки.
  2. Голодать HUVECs с M199 голода СМИ за 4 ч при 37 ° C с 5% CO2.
  3. Удаление уменьшение фактора роста базальной мембраны матрица от-80 ° C и хранить при 4 ° C на ночь, позволяя постепенного таяния во избежание формирования пузыря и полимеризации.
  4. Тщательно и медленно пальто скважин 96 также пластины с 0,04 мл снижения фактора роста базальной мембраны матрицы, избегая формирования пузыря. Выполните всю процедуру под капотом ламинарного потока.
  5. Заполните соседних скважин 96 также пластины с 0,1 мл PBS для поддержания влажности и сохранения температуры.
  6. Инкубируйте 96 хорошо пластины при 37 ° C для по крайней мере 20 минут, чтобы достичь полимеризации экстракта базальной мембраны. Не инкубировать для более чем 1 час.
  7. Trypsinize transfected HUVECs от каждой группы и Ресуспензируйте в средних M199 в концентрации 1 х 105 кл/мл.
  8. Добавьте 0,1 мл каждого суспензию клеток к скважинам, содержащий полимеризованной базальной мембраны матрицы в 96 хорошо пластины.
  9. Инкубируйте 96 хорошо пластины при 37 ° C с 5% CO2 , в то время как подготовка факторов роста происходит. Подготовка факторов роста также происходит под капотом ламинарного потока.
  10. Воссоздания факторы роста (VEGF) в 2 x окончательного желаемой концентрации (4 нг/мл концентрация для 2 конечная концентрация нг/мл) и добавить 0,1 мл, содержащие фактор роста средних голода M199 поверх 0,1 мл M199 голода среды с клетками. Для не лечение VEGF скважин добавьте 0,1 мл среды голода M199 поверх 0,1 мл M199 голода среды с клетками.
  11. Инкубируйте 96 хорошо пластина для 6 ч при 37 ° C с 5% CO2.
  12. В конце инкубационного периода получите изображения каждой скважины с 4 крат, используя микроскоп brightfield, связанных с цифровой камерой.
  13. Обработка изображений с программным обеспечением, оснащенных подключаемого модуля «Анализатор ангиогенеза»19. Используйте три параметра, количество узлов, количество узлов и Длина общая Росток, чтобы сравнить эффекты обращения Мирна по ангиогенез.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ выражения гена с помощью RT-ПЦР и гель-электрофорез

Дифференциальный гена анализ выражения с помощью RT-ПЦР продемонстрировал значительные Даунрегуляция целевых генов, CDK1, CDK4 и CDK6. CDK1 и CDK4/6 было показано для G2/M и переходы G1/S, соответственно. Проведенный анализ позволил прямое сравнение между отдельными Мирс и комбинаторные мир деятельности. Использование малых интерферирующих РНК схватка с ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

интерферирующим могут действовать в качестве целевой терапии для лечения рака, признавая dysregulation уровни выражения в больной против нормальных тканей. Это исследование стремились определить адаптивной, что потенциально остановить прогрессирование клеточного цикла в течение нескольких этапов. Было определено, что мир-143 и мир-506 остановить клеточный цикл раковых клеток, и представленных протоколов, направленных понять деятельность этого лечения комбинаторной Мирна.

Описаны методики обесп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы признать Джон Caskey государственного университета Луизианы за его помощь на пути анализа данных последовательности РНК, и университета Техаса Юго-медицинский центр, МакДермотт центр следующего поколения Core последовательности для выполнение анализа данных и последовательности РНК. Это исследование было поддержано фармацевтический колледж, Университет штата Луизиана Монро начальное финансирование и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) через Национальный институт общей медицинской науки грантов 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 P20-15S1.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие конфликта интересов объявляются.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
-80 °°°; C Морозильная камераVWRVWR40086A
96 лунок пластинаCELLTREAT Scientific 50-607-511
96-луночные микролуночные планшеты   Thermo Scientific12-556-008
A549 Клетки немелкоклеточного рака легкихATCCATCC  CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2938c
Ambion Silencer Отрицательный контроль No1 миРНКAmbionAM4611
Антибиотик-антимикотический раствор (100x)Gibco15240-062   
Набор для анализа матрицы антител, 2 реакцииFull Moon BioKAS02
Bright field microscope   Микрооптика IV-900
Светлопольный микроскоп   New Star Environment LLC
Матрица антител к клеточному циклу, 2 слайдаFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceШаги 5.14; 6.13: Используется для расчета распределения популяции в соответствии с фазой клеточного цикла и для расчета распределения популяции для анализа Апоптоз 
CFX96 Система реального времениBioRadCFX96 Оптический модуль
Chemidoc Сенсорная система визуализацииBioRadChemidoc Сенсорная система
CO2Инкубатор CO2 Thermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Матрица базальной мембраныTrevigen3433-010-01
Цифровая камераAmScope FMA050
DMEM 4,5 г/л глюкозы, без пирувата натрия, с L-глутаминомVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
Добавка для роста эндотелиальных клеток (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Пипетка Pick-A-Pack НаборыEppendrof05-403-152
Этанол, абсолютный (200 proof), молекулярный Класс биологии, Биореагенты FisherBP2818500
бромид этидияAlfa acarL07462
F-12K Питательная смесь (Kaighn's Mod.) с L-глутамином, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Фетальная бычья сыворотка - премиумAntlanta BiologicalsS11150
Fetal Бычья сыворотка (FBS)Fisher Scientific10438026
Fisherbrand Basix Микроцентрифужные пробирки со стандартными защелкивающимися крышкамиFisherbrand Basix02-682-002
Forma Series II водяная рубашка CO2-инкубаторThermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Система горисонтального электрофорезаНастольная лабораторная системаBT102
has-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
has-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
человеческим рекомбинантным фактором роста эндотелия сосудов (VEGF)Thermo ScientificPHC9394   
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC)Индивидуальные донорыIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Salt (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenРезультаты: Используется для биоинформатического анализа
Invitrogen UltraPure DNase/РНКаза Дистиллированная вода без РНКазыInvitrogen10-977-015
Липофектамин 2000 Invitrogen11-668-027
Loading dye 10Xward's science+470024-814
Medium M199 (with Earle′ Sigma AldrichM4530
Microscope Digital CameraAmScope MU130
Modfit LTVerity SoftwareStep 5.15: Альтернативное программное обеспечение для анализа распределения
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
Пенициллин-стрептомицин 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UP sybr green master mixAppliedBiosystems A25780
Propidium IodideMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Microarray scannerPerkin elmerASCNPHRG. Мы использовали возбуждающий лазер с длиной волны 543 нм.
q Оптическая адгезивная крышка для ПЦРApplied Biosystems4360954
Наборы для быстрой РНКZymo ResearchR1055
Рибонуклеаза А из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerШаг 7.33: программное обеспечение для
ШейкерThermo Scientific2314
Термоамплификатор SimpliAmpПрименяемые биосистемы
Центрифуга Пробирки SpectraTube Центрифуга 15млVWR470224-998
Центрифуга SpectraTube 50млVWR470225-004
TBS Буфер, 20x жидкийVWR10791-796
Регулируемая температура
Микроцентрифуга с регулируемой температурой матчинEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite Обработанные колбы с клеточными культурамиThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-луночные полноразмерные пластиныThermo ScientificAB0800WL
Набор для синтеза кДНК Thermo Scientific Verso (100 запусков)Thermo ScientificAB1453B
Лестница для ДНК сверхнизкого диапазонаInvitrogen10597012
VWR стандартный лабораторный холодильник со сплошной дверьюVWR
визуализациипутипопуляций клетоканализа микрочипов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Теги

Похожие статьи