Комплексная программа вскрытия для лиц с рассеянным склерозом

Summary

Рассеянный склероз является воспалительным демиелинизирующее заболевание без лечения. Анализ тканей мозга дает важные подсказки для понимания патогенеза болезни. Здесь мы обсуждаем методологию и вниз по течению анализ ms мозговой ткани, собранные через уникальную программу быстрого вскрытия в эксплуатации в клинике Кливленда.

Abstract

Мы описываем программу быстрого донорства тканей для людей с рассеянным склерозом (MS), которая требует, чтобы ученые и техники были по вызову 24/7, 365 дней в году. Участники соглашаются пожертвовать свой мозг и спинной мозг. Большинство пациентов последовали неврологи в Кливлендской клинике Меллен центр лечения и исследования MS. Их клинические курсы и неврологические нарушения хорошо характеризуются. Вскоре после смерти, тело транспортируется в ЦЕНТР MS Imaging, где мозг сканируется на месте 3 T магнитно-резонансной томографии (МРТ). Затем тело переносится в отделение для вскрытия, где удаляются мозг и спинной мозг. Мозг разделен на два полушария. Одно полушарие сразу же помещается в нарезку и альтернативные ломтики толщиной 1 см либо фиксируются в 4% параформальдегида в течение двух дней или быстро заморожены в сухом льду и 2-метилбутана. Короткие фиксированные ломтики мозга хранятся в растворе криоконсервации и используются для гистологического анализа и иммуноцитохимического обнаружения чувствительных антигенов. Замороженные ломтики хранятся при -80 градусах Цельсия и используются для молекулярных, иммуноцитохимических и на месте гибридизации/РНК-областей исследований. Другое полушарие помещается в 4% параформальдегида в течение нескольких месяцев, помещается в нарезку коробки, повторно сканируется в 3 T магнитно-резонансного (Mr) сканер и нарезанный на сантиметровые ломтики. Посмертные изображения МР-изображения (МРТ) регистрируются с 1 см толщиной ломтиков мозга для облегчения корреляции МРТ-патологии. Все ломтики мозга фотографируются и мозг белых поражений определены. Спинной мозг разрезается на 2 см сегментов. Альтернативные сегменты фиксируются в 4% параформальдегида или быстро замораживаются. Быстрая закупка посмертных тканей MS позволяет патологических и молекулярных анализов мозга ms и спинного мозга и патологических корреляций аномалий МРТ головного мозга. Качество этих быстро обработанных посмертных тканей (обычно в пределах 6 ч смерти) имеет большое значение для исследований MS и привело к многим высокоэффективных открытий.

Introduction

Один из лучших способов изучения болезни является изучение самой больной ткани. Это создает проблемы для тех, кто изучает заболевания центральной нервной системы (ЦНС). Биопсия больного головного и спинного мозга крайне редки и обычно связаны с нетипичными случаями. Показатели вскрытия лиц с заболеваниями ЦНС резко снизились в последние годы, и при выполнении, они часто не обеспечивают быструю закупку тканей. Эти проблемы привели к созданию заболеваний в центре банков мозга, в том числе несколько сосредоточены на сборе тканей от людей с рассеянным склерозом (MS). MS является воспалительным опосредованным заболеванием ЦНС, которое разрушает миелин, олигодендроциты (миелин формирования клеток), нейронов и аксонов. Большинство пациентов с рассеянным склерозом имеют двух-phasic курс заболевания, который начинается с приступов неврологической инвалидности с переменной восстановления, что в конечном итоге превращается в постепенно прогрессирующее заболевание, которое, вероятно, нейродегенеративных в природе¹. Для большинства пожертвованных мозгов MS, посмертные интервалы (PMI) между смертью и обработкой тканей превышают 24 ч. Хотя эти ткани предоставили ценную информацию о патологических изменениях в мозге MS, они не подходят для более продвинутых молекулярных исследований, которые могут обеспечить мощное понимание патофизиологии болезни. Это особенно относится к исследованиям генного профилирования, которые требуют нетронутой РНК.

Чтобы преодолеть ограничения, о которых говорилось выше, мы разработали программу быстрого донорства тканей, которая позволяет проводить МРТ/патологические корреляции. Этот протокол обеспечивает хорошо сохранившиеся ткани, пригодные для современных молекулярных исследований, и позволяет прямое сравнение патологии мозга и аномалий МРТ в мозге MS. Кливлендская клиника Рассеянный склероз Ткань Пожертвование Программа существует уже более 20 лет. Эта программа быстрого донорства тканей закупает мозги и спинной мозг у людей с MS и другими связанными аутоиммунными неврологическими заболеваниями. Программа направлена на получение на месте МРТ в течение 6 ч от смерти, а затем удаление головного и спинного мозга для обработки тканей.

Набора
Пожертвования добываются либо через домортное согласие, полученное непосредственно от пациентов (предварительно согласованных), либо от ближайших родственников после смерти. Предварительно согласованных пациентов, как правило, определены из клинической популяции в Меллен Центр лечения рассеянного склероза и исследований в Кливленде, штат Огайо. Хотя предпочтение в наборе в программе быстрого донорства тканей отдается пациентам, которые были соблюдены в продольных исследованиях, она открыта для всех пациентов, замеченных в центре. Участникам, которые зачисляются до смерти, даются инструкции для членов семьи или медицинских работников связаться с исследовательской группой, либо во время смерти, либо когда смерть считается неизбежной. Второй метод для людей, чтобы войти в программу донорства тканей в момент смерти через согласие ближайших родственников. Штат Огайо требует, чтобы смерть была передана в федеральную организацию по закупкам органов под названием LifeBanc, которая действует в 20 округах северо-восточного Штата Огайо. LifeBanc экраны всех смертей для диагностики MS, который является исключением для донорства органов. Были приняты меры для LifeBanc уведомить следователей из программы пожертвования ms ткани для всех смертей с соответствующим диагнозом MS, происходящих в радиусе 75 миль от клиники Кливленда. Ближайшие родственники и персонал больницы затем связаться с Ткань Пожертвование Программа персонала и согласие получено для донорства тканей головного и спинного мозга. Эти два метода вербовки анте-мортам и посмертно через LifeBanc приводят примерно к 10-12 донорам мозга в год. Корректировки вносятся в верхний возрастной предел смерти для управления числом рефералов, полученных от LifeBanc.

Закупка пожертвований
Программа требует 24 ч охвата, 365 дней в году членами программы донорства тканей для закупок тканей. Централизованная система уведомления о пожертвовании тканей/пейджер/мобильное устройство используется клинической командой, занимающейся пожертвованиями тканей. LifeBanc предоставляется номера для контакта дежурного персонала для программы донорства тканей. Члены Церкви уведомляются о смерти от поставщиков медицинских услуг/ближайших родственников (предварительно согласованных) или LifeBanc и других справочных источников. Во-первых, определение времени смерти и осуществимость донорства тканей производится. Смерти затем проверяются на состояние, которое потенциально приводит к некачественной ткани, включая длительную предсмертную гипоксию, массивную разрушительную ткань мозга (например, большое внутричерепное кровоизлияние, обширные би-полушарические инсульты, обширную опухоль бремя), длительная поддержка аппарата искусственной вентиляции легких (Зтт;3 дня) и длительное применение вазоактивных средств (Зтт;3 дня) до смерти. Когда медицинский эксперт участвует в смерти, исследование невролог может поговорить с медицинским экспертом, чтобы изучить способ получения своевременной ткани без ущерба для ответственности медицинского эксперта. Если жизнеспособная ткань считается присутствующая, то получается письменное согласие (если не получено досмерти) и готовятся к транспортировке тела. Ранее контракт умерших транспортных услуг, то связался для транспортировки на Объекты МРТ в клинике Кливленда. Меры по обеспечению того, чтобы тело оставалось при комнатной температуре и не помещалось в холодильные, так как более низкие температуры тела связаны с изменениями характеристик Сигнала МРТ.

Клиническая история
Клиническая история включает в себя подробную информацию о диагностике РАССЕЯНного см, нашествии симптомов, используемых методах лечения, результатах клинических и параклинических испытаний (вызванные потенциалы, результаты спинномозговой жидкости, оптическая компореная томография), функциональный композит рассеянного склероза , и расширенная шкала статуса инвалидности (EDSS; фактические или оценкам), которые собираются из медицинской документации (там, где это возможно), и прямое интервью ближайших родственников. Также собираются домортизмМ.

Protocol

Этот протокол был одобрен Кливлендской клиникой Институциональный обзор совета и следует руководящим принципам Кливлендской клиники человеческих исследований этики комитета.

1. На Ситу МРТ

1. Возьмите донорский орган в набор МРТ и провести 2 ч МРТ протокол изображения на MS Imaging фонда. Проведите МРТ на 3 T или 7 T-изображении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приоритет отдается 3T, так как большинство устаревших данных было выполнено на 3 T, но когда нет, визуализация проводится с 7T. Обозначенные основные последовательности выполняются для всех случаев(таблица1) и дополнительные последовательности, которые зависят от текущих научных интересов выполняются, если позволяет время (ограничено достижением фиксации ткани менее 12 ч после смерти). В таблице 1 описаны основные последовательности.

2. Вскрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: После МРТ на месте, тело транспортируется в морг для извлечения мозга и спинного мозга путем динера и обработки тканей членами лаборатории.

1. Выполните следующие шаги до прибытия тела в морг. За два часа до этого подготовьте 3 л параформальдегида (PFA) и пометьте контейнеры и мешки для хранения тканей. Подготовка 3 L 8% PFA и разбавить 1,5 л 8% PFA до 4% PFA. Поместите оставшиеся 8% PFA в 4 кк с в течение дня 2.
2. Перед поездкой в морг, заполнить 2 путешествия охладители до 50% мощности с сухим льдом (большие блоки сломанной подходят и небольшие гранулы).
3. В морге, заполнить нержавеющей стали контейнер на полпути с 2-метилбутан и сухой лед и накрыть крышкой в рамках подготовки к оснастки замораживания ткани.
4. Взвешивание и сфотографировать мозг раз удалены diener.
5. Поместите любую прикреплёную дуру в контейнер, наполненный PFA.
6. Отделите мозжечок и ствол мозга от головного мозга и сфотографируйте головной мозг.
7. Определите зрительные нервы, хиазмы и тракты и отделите с помощью зонда и пинцета. Рассекать структуру скальпелем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дистальный сегмент одной стороны зрительного нерва отмечен с помощью чернил Хиггинса для идентификации.
8. Разделите полушария головного мозга продольно и сфотографируйте каждое полушарие по отдельности.
9. Чернила первичной моторной коры (PMC) для левого полушария, повторно сфотографировать его, и поместить его в 3,3 л контейнер для длительной фиксации. Документируйте время начала фиксации мозга.
10. PMC для правого полушария могут быть чернилами или вырезаны.
    1. При удалении сначала удалите покрывающие обезвражемые.
    2. Перефотографировать чернилами или вырезанные PMC.
    3. Если PMC вырезан, нарезать 6 одинаково гостевых секций.
    4. Чернила ростральный аспект каждого раздела.
    5. Поместите нечетные разделы в заполненные PFA контейнеры для короткой фиксации.
    6. Привязать-заморозить ровные секции и место в запечатанных морозильной камере мешки в кулер #1.
11. Разрежьте переднее правое полушарие на задний понизить на корональные секции толщиной 1 см.
    1. Документ ные грубые аномалии (например, резки артефакт, кровоизлияние, и поражения).
    2. Поместите нечетные секции в контейнеры, заполненные PFA для короткой фиксации.
    3. Привязать-заморозить ровные секции и место в запечатанных морозильной камере мешки.
    4. Документ конец времени фиксации мозга.
12. Отделить ствол мозга от мозжечка и поместить в заполненный PFA контейнер для короткой фиксации.
    1. Отдельные мозжечковые полушария продольно.
    2. Разрежьте каждое полушарие на 4 одинаково толстых сагитальных секций.
    3. Фотография медиальных и боковых представлений.
    4. Поместите левые мозжечковые ломтики полушария в контейнер, наполненный PFA для короткой фиксации.
    5. Привязать-заморозить право мозжечковой полушария ломтиками и место в запечатанных морозильной камере мешки в кулер #1.
13. Получить спинной мозг с нервными корнями от diener.
    1. Удалить спинного мозга dura матер и хранить дюра в контейнере с PFA.
    2. Отдельные левые и правые передние и задние нервные корни. Вырезать левый передний и задние нервные корни вырезать из спинного мозга и поместить в PFA заполнены контейнер для короткой фиксации.
    3. Вырезать правый передний и задние нервные корни из спинного мозга, оснастки заморозить, место в запечатанных морозильной камере мешки, а затем поместить в более прохладном #2.
    4. Фотография каудал-большинство 20 см спинного мозга. Задокументируйте расположение поясничного расширения.
    5. Вырезать 2 см поперечные секции шнура, переходя от каудаля до ростральной.
    6. Чернила ростральный аспект каждого разреза разделе.
    7. Поместите нечетные секции в контейнеры, заполненные PFA для короткой фиксации.
    8. Привязать-заморозить ровные участки, место в запечатанных морозильной камере мешки, а затем поместить в холодильник #2.
    9. Документ время начала для фиксации спинного мозга и любые грубые аномалии.
    10. Фотография оставшейся ростральной части спинного мозга.
    11. Задокументируйте положение увеличения шейки матки. Выполните шаги 2.13.5-2.13.8 для оставшегося спинного мозга.
14. После морга поместите замороженные ткани в маркированные коробки в морозильные дробилки -80 градусов по Цельсию. Храните фиксированную ткань при 4 градусах Цельсия.
15. На 24 ч после вскрытия (день 2) разбавить оставшиеся 8% PFA до 4%.
16. Замените 4% PFA в контейнерах для фиксации на свежеразбавленные 4% PFA.
17. На 60 ч после вскрытия подготовить решения 2,5% глутаральдегида в 4% PFA от глутаральдегида, PFA, dH₂O и буфер Аоренсон (подготовлен ы смешивания в последовательности: 0,2 M фосфат буфера pH 7,4, поливинилпирролидоне 1% ж / V, сахарроуз 30% ву/в, и ethylcolene gyl 30% v/v).
18. Удалите использованные 4% PFA из контейнеров с короткой фиксацией.
19. Промыть ткани в буфере Соренсона и поместить его в криопротекционистское раствор (глицерол 20%, 0,4 М буфер Аренсона 20%, и 0,02% азида натрия в dH₂O).
20. Фотография коротких фиксированных ломтиков мозга, мозжечка, ствола мозга и моторной коры (если это применимо).
21. С помощью скальпеля лезвие вырезать 2 мм толщиной поперечные секции от каждого 2 см короткой фиксированной секции спинного мозга.
22. Поместите секции в 2 мл сцинтилляционных флаконов и заполните раствором 2,5% глютаральдегида в 4% PFA.
23. Верните оставшуюся секцию в оригинальный флакон 20 мл сцинтилляции. Раздел промыть буфером Соренсона и заменить криопротекционным раствором.

3. Патология

ПРИМЕЧАНИЕ: Короткие фиксированные ломтики правого полушария, а также длиннофиксированное левое полушарие (размещенное в 4% ПФА в течение нескольких месяцев) либо разрезаются на 30 мкм разделов (именуемых как свободно плавающие) или встроены в парафин и разрезаются в виде 12-14 мкм (именуемых как парафин-встроенный). Эти разделы обрабатываются обычно с протеолипидным белком (PLP) для обнаружения демиелинизирующих поражений и основных комплексов гистосовместимости II (MHC-II) для иммунной активности с использованием метода диаминобензидина (DAB). Эти протоколы были стандартизированы и использованы в нескольких публикациях^{2,3,4,5,6,7,8 , 10} Лет ^{, 11 Год , 12}.

1. Свободно плавающий (30 мкм) DAB-Avidin-Biotin Комплекс (ABC) Ткань окрашивания
   1. Удалите секции из раствора криохранилища, перенесите секции в шестикомнатную пластину и промойте их по 3х 5 минут каждый в 2 мл 1x фосфата буферизированного соленя pH 7.0 (PBS). При переходе на следующий колодец в шестиколодцную пластину используйте уход, чтобы не рвать ткани. Во время каждого шага мытья и инкубации, поместите шесть колодцев пластины на шейкер и позволяют ткани мягко встряхнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань разделы инкубируются в меньших объемах и в больших пластин (т.е., 12- и 24-колотые пластины), как правило, обладают поверхностью и края разрыва.
   2. Выполните извлечение антигена с помощью микроволновых секций в стеклянном стакане, содержащем примерно 30 мл 10 мМ цитратбуфера (pH 6.0). Убедитесь, что ткани не складываются, манипулируя с помощью кисти и микроволновых секций в течение 2-3 мин или до тех пор, пока цитрат буфер приходит кипеть. Дайте секциям остыть до комнатной температуры (20 мин).
   3. Передача разделов обратно в шесть колодцев пластины и мыть разделы 3x на 5 минут каждый в 2 мл PBS/0,3% Тритон X-100. Блок эндогенных пероксидаза путем инкубации разделов в 2 мл 3% H₂O₂/0,3% Тритон X-100/PBS в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
   4. Вымойте разделы 3x на 5 мин каждый в 2 мл PBS/0,3% Тритон X-100. Блок разделов в 2 мл 3% нормальной сыворотки козы / 0,3% Тритон X-100/1x PBS для 1 ч на RT.
   5. Инкубировать разделы на ночь до 5 дней (в зависимости от антитела) в первичных антител, направленных против микроглии и миелина эпитопы для обнаружения воспаления (MHCII) и демиелинизации (PLP) (см. Таблица материалов) при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разделы не складываются при инкубации в этом этапе или последующих шагах, поскольку это приведет к тому, что области внутри секций будут лишены пятен.
   6. Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в 2 мл 1x PBS. Затем инкубировать разделы во вторичных биотининатированных антител (см. Таблица материалов) на 1 ч на RT. Подготовьте Avidin-Biotin Complex (ABC) раствор во время инкубации примерно за 45 минут до следующего шага мытья, чтобы позволить ABC комплексов сформировать.
   7. Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в 2 мл 1x PBS. Затем инкубировать разделы в ABC для 1 ч на RT.
   8. Вымойте разделы в 2 мл 1x PBS три раза в течение 5 минут каждый. Инкубировать разделы в фильтрованных DAB (2 мл/ хорошо/секция), содержащие H₂O₂ (1:500 разбавления 30% H₂O₂ в DAB) до тех пор, пока цвет развивается адекватно (No 3-8 мин).
   9. Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в 2 мл 1x PBS. Для усиления сигнала (необязательно), osmicate с помощью 0.04% OsO₄ (30 с).
   10. Вымойте разделы три раза в течение 5 минут каждый в 1x PBS. Индивидуально, перенести каждый раздел из шести колодцев пластины в небольшой контейнер, полный 1x PBS и положение ткани разделе на стеклянной слайд как можно более плоским.
   11. Аккуратно поднимите слайд из PBS, обеспечивая при этом раздел ткани как можно более плоским. Используя две кисти краски, аккуратно сгладить и растянуть ткани на слайде и мазок от лишнего воды с бумажным полотенцем. Смонтируйте секции тканей глицеролом (или эквивалентным монтажным носителем) и запечатайте крышку прозрачным лаком для ногтей.

4. Парафин-встроенных полушария разделы: DAB окрашивания

1. Растопите параффин с горок в духовке 60 градусов по Цельсию в течение 5-10 мин.
2. Де-парафинизировать разделы путем инкубации в ксилена 3x в течение 5 минут каждый.
3. Регидратная ткань в градуированный этанол на 100% (2x на 5 мин каждый), 95% (2x на 5 мин), 70% (2x на 5 мин каждый), и 50% (1x на 5 мин каждый). Обложка слайдов в PBS.
4. Выздоравливание антигена микроволновой печи слайдов в стакане 10 мМ цитрат буфера (pH 6.0).
5. Вымойте слайды в 1x PBS (3x на 5 мин каждый) один раз охлаждается до комнатной температуры. Блок эндогенных пероксидаза путем инкубации ткани в 3% H₂O₂/1% Тритон-X 100/PBS в течение 30 мин.
6. Вымойте ткань в 1x PBS три раза в течение 5 мин каждый. Блок ткани с 6% нормальной козьей сыворотки в PBS в течение 1 ч.
7. Инкубировать разделы в первичных антителах (см. таблицу материалов) в PBS при комнатной температуре (RT) на ночь (максимум 20 ч).
8. Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в 1x PBS. Затем инкубировать разделы в соответствующих вторичных антител (см. таблицу материалов) в PBS для 1 ч на RT.
9. Подготовьте раствор ABC примерно за 45 минут до следующего шага по стирке во время инкубации.
10. Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в 1x PBS, а затем инкубировать в ABC в течение 1 ч на RT.
11. Вымойте раздел 3x для 5 мин каждый в 1x PBS.
12. Инкубировать разделы в фильтруется (0,45 мкм фильтр поры размер) DAB, содержащий H₂O₂ (1:500 разбавления 30% H₂O₂ в DAB) до тех пор, пока цвет развивается адекватно (3-8 мин).
13. Вымойте разделы (3x 5 мин) в 1x PBS. Для усиления сигнала, osmicate с помощью 0,04% тетроксида осмия (OsO₄; примерно 30 с).
14. Вымойте разделы (3x 5min) в 1x PBS.
15. Обезвоживание ткани в градуированных серии этанола 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 мин), и 100% ксилена (1x 5min). Разрешить ксиленам испаряться.
16. Маунт разделы с толуол-основе быстрого сухого монтажа средств массовой информации. Формулы, содержащие антиоксиданты, рекомендуются для предотвращения отбеливания пятен. Удалите избыток монтажных носителей с краев слайдов бритвой для последующего хранения.

5. МРТ/патологические корреляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сопоставления МРТ с патологией, мы сначала выполняем ex vivo МРТ давно фиксированного нетронутыми полушария мозга (шаг 2,9 выше) в регулируемой коробке с МРТ-видимых маркеров, указывающих на нарезку слотов. Затем мы нарезаем мозг и фотографируем 1 см ломтики, чтобы обеспечить совместное регистрацию МРТ на месте на отдельные ломтики мозга. Затем мы можем проводить МРТ-анализ, где области, представляющие интерес (ROIs) определяются на МРТ для прямого анализа тканей. Мы также можем выполнять гистопатологические анализы, где ROIs идентифицируются на ткани (например, поражения белого вещества, белое вещество без демиелинизации и т.д.), а затем характеризуется совместно локализованных мер МРТ (Таблица 1).

1. Идентификация рентабельности инвестиций на основе МРТ
   ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих исследованиях, мы определили ROIs в белом веществе^{11,12,13,14,15} и серое вещество^{16,17, 18}. Приведенный ниже пример предназначен для анализа белой материи.
   1. Сегмент T2 гиперинтенсивных поражений на in situ МРТ (от шага 1.1), сначала обрабатывается автоматическим алгоритмом, а затем исправлены вручную опытными пользователями.
   2. Сегмент T1 гипоинтенсивных поражений в T2 поражения, как voxels с интенсивностью сигнала меньше или равна 80% от интенсивности сигнала окружающих нормально-появляющейся ткани мозга.
   3. Сегмент гипоинтенсивных областей в коэффициенте переноса намагниченности (MTR) карт с порогом 80%.
   4. Создайте три классификации с использованием вышеуказанных сегментаций: а) T2-только поражения, которые являются ненормальными на T2-взвешенных / FLAIR сканирования, но нормально на T1-взвешенных или MTR сканирования, (b) T2T1MTR поражений, которые являются ненормальными на всех T2-взвешенных / FLAIR, T1-взвешенный, и MTR сканирования; и с) нормально появляющееся белое вещество (NAWM), которое является нормальным на всех T2-взвешенных / FLAIR, T1-взвешенных и MTR сканирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наш выбор ломтиков основан на существовании всех трех типов интересов (T2-только, T2T1MTR и NAWM) на одних и тех же срезах.
   5. Рассчитайте нормализованную интенсивность для каждой рентабельности инвестиций, чтобы свести к минимуму изменчивость, возникающую из разных мозгов и различных местоположений мозга.
2. Со-регистрация на месте МРТ на кусочки мозга
   1. Сканирование фиксированного полушария мозга в пользовательской нарезки поле с четырьмя рядами МРТ чувствительных маркеров локализации слотов, где нож может быть вставлен, чтобы нарезать мозг. Выполните T1-взвешенный 3D MPRAGE приобретение с 1 мм изотропного разрешения, охватывающих фиксированный мозг и все маркеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это называется послефиксации МРТ и используется только в качестве промежуточного шага для совместной регистрации in situ МРТ на кусочки мозга.
   2. Сразу же после сканирования, нарезать полушарие мозга в слоты расположены 1 см друг от друга, в результате чего около 15 ломтиков.
   3. Фотография мозг ломтиками как на передней, так и на задней стороны.
   4. Со-регистрация мРТ на месте и фотографии ломтиков мозга со следующими шагами.
      1. Для сегментации пост-фиксации и на месте MPRAGE, предварительно обработать как пост-фиксации и на месте МРТЗ для интенсивности неравномерности¹⁹.
         1. Сегмент мозга и четыре ряда маркеров из предварительно обработанных постфиксации MPRAGE.
         2. Сегмент полушария, соответствующие послефиксации МРТ^20,21 от предварительно обработанных на месте MPRAGE.
      2. Со-регистрация мозга извлеченных на месте и после фиксации МРТ через ряд линейных процессов регистрации до 12 градусов свободы (аффект регистрации) с помощью FSL FLIRT²². Компоненты масштабирования и стрижки объясняют эффект усадки фиксации.
      3. Найдите нормальное направление нарезки плоскости, сводя к минимуму сумму максимально йенспроцированной интенсивности с помощью сегментированных маркеров. Эти углы переориентации включены в матрицу преобразования, полученную от предыдущего шага.
      4. Визуально сопоставить МРТ изображения к фотографиям фиксированных задних ломтиков мозга с помощью в доме просмотра изображения, что позволяет изменить глубину и ориентацию нормальных векторов. Небольшие изменения необходимы, потому что нарезка мозга несовершенна.
      5. Примените преобразование изображения AFFINE¹³ для каждого среза, чтобы преобразовать МРТ на месте нарезки в те же места, что и фотографии срезов мозга.

Results

Как уже упоминалось выше, почти половина полушария головного мозга заморожена и доступна для молекулярных исследований с использованием ДНК, РНК или белка. Исторически сложилось так, что исследования с использованием посмертных тканей мозга, как было показано, влияют на предсмертные условия, возраст, пол, рН ткани, целостность мРНК (RIN), посмертный интервал (PMI), диагностическая определенность, использование сопутствующих веществ, а также предварительное лечение лекарства статус²³. На основе исследований с использованием тканей мозга, ДНК и белок, как представляется, зависит от меньшей степени по сравнению с РНК. Основываясь на нашем опыте, РНК изоляции и вниз по течению анализа, однако, было установлено, что в наибольшей степени страдают от предсмертных условиях и посмертного интервала ткани мозга. Поэтому мы обсуждаем некоторые условия, которым следует следовать для проведения анализа на основе РНК с использованием посмертных тканей MS.

Для всех наших исследований, после того, как мозг собирается при вскрытии, он нарезается (1 см толщиной), а затем либо фиксируется в 4% параформальдегида для морфологических исследований или быстро заморожены для биохимического анализа. Все блоки ткани охарактеризованы для демиелинизмирования иммуноспоминаемством используя PLP как описано выше. Схема репрезентативного анализа показана на рисунке 1. Ткань разделы рассматриваются на наличие белого вещества поражений(рисунок 1A). Выбранные области окрашены для иммунной активности(рисунок 1B) и демиелинизм (рисунок1C). Замороженная ткань устанавливается на криостат(рисунок 1D)и замороженные 30 мкм разделы вырезать. За этим следует сбор 3-4 последующих разделов, отделение от прилегающих тканей и хранение для ДНК, РНК или белковой изоляции. Используя этот протокол, мы успешно изолировали ДНК^24,25,РНК^5,6,7,8,9, а также белки^26. Хотя основные выводы из некоторых исследований, анализирующих РНК из мозга MS обсуждаются, вот некоторые из вопросов, связанных с анализом РНК посмертного мозга MS.

Рисунок 1: Сбор образцов для анализа мРНК. (A) Ткань вскрытия выбрана для анализа. Выбираются участки ткани и иссена часть ткани. Все разделы окрашены (B) MHC-II (Основной комплекс гистосовместимости (MHC) класса II HLA-DR CR3/43) антитела для обнаружения воспалительной активности и с (C) протеолипидбелка (PLP) для определения состояния миелина с помощью опубликованных протоколов. Исходя из состояния миелина, блок забиваетсяскальпелем (D ). Разделы (60 мкм)вырезаются (E) и области, которые были ранее забил удаляются, разделены в трубках, и помечены (F). ПЛП и MHC-II пятна повторяются после каждых 5 разделов для обеспечения надлежащего сбора тканей. Отмечается нормальное появление белого вещества (NAWM), а поражения белого вещества (WML) очерчены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Аксональная трансекция при поражениях MS¹⁰. Первоначальная научная направленность этой программы была посвящена характеристике клеточных компонентов демиелинизированных поражений белой материи. Среди локализованных антигенов были нефосфорилированные нейрофиламенты (NFs). Большинство NFs фосфорилированы в миелинированных аксонов. При демиелинации аксоны дефосфорилируются. Мы обнаружили ожидаемое выражение нефосфорилированных NFs в демиелинизированных аксонах. В острых поражений MS, многие из этих демиелинированных аксонов закончился как аксональные лампы опрокидкления (Рисунок 2A), которые отражают проксимальные концы трансэктированных аксонов. Трансцектонные аксоны превышают 11000 мм³ в острых поражений по сравнению с соседними нормальными регионами¹⁰. Эти наблюдения помогли катализировать сдвиг парадигмы в исследованиях MS, которые переехали области к характеристике нейродегенерации в качестве основной причины постоянной неврологической инвалидности у людей с MS.

Рисунок 2: Аксональная транесекция во время воспалительной демиелинации. Аксональная трансекция возникаетво время воспалительной демиелинации (A, наконечники стрел) и индуцирует образование терминальных аксональных (А, стрел). При количественной оценке (B), трансected аксоны в изобилии в MS поражений и, как представляется, коррелируют с воспалительной активностью поражения. Панель A воспроизведена из Trapp et al.¹⁰ с разрешения. Красный: протеолипный белок, зеленый: Антинефосфорилированный нейрофиламент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Ремиелинизм в хронических мозгах MS³. Ремиелинизм может быть надежным на ранних стадиях MS. Многие хронические поражения MS, однако, не remyelinated. Мы исследовали ли наличие клеток-прародителей олигодендроцитов (ОПК) или генерации новых олигодендроцитов ограничивает ремиелинизацию хронически демиелинизированных поражений белой материи. Хотя плотность OPC часто снижалась, они присутствовали во всех хронически-демиелинизированных поражениях^3. Новоисжинные олигодендроциты также присутствовали во многих хронических поражениях РАССЕЯНного синдрома. Олигодендроцитные процессы, связанные с, но не миелинат демиелинированных аксонов(рисунок 3). Эти исследования показывают, что ОЗК и их способность производить новые олигодендроциты не ограничивают ремиелинизм хронических поражений белой материи. Мы предположили, что хронически демиелинизированные аксоны, которые часто казались дистрофическими, не были восприимчивы к ремиелинации вновь произведенными олигодендроцитами.

Рисунок 3: Процессы предварительноми миелинизирующих олигодендроцитов, связанных с аксоном. Показаны конфокальные микрографы поражений MS, окрашенные антителами PLP (красные в группах A, B)и антителами нейрофиламента (зеленые в группах A, B). Предварительно миелинизирующая олигодендроцит (красный цвет в панели А) в субвентрикулярной зоне (СВЗ) расширенные процессы в область демиелинизированных аксонов (зеленый в панели А) при хроническом поражении рассеянного склерозом. Многие из этих процессов (стрелки в панели А) вращались вокруг аксонов, как показано при более высоком увеличении (Панель B). Шкала баров представляют 20 мкм (A) и 5 мкм (B). Воспроизводится из Чанг и др.³ с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Митохондриальная дисфункция у MS⁶. Мы провели объективный поиск нейрональных изменений генов в быстро замороженной моторной коре, полученной от хронических пациентов с рассеянным склерозом(рисунок 4A). Непредвзятый поиск этого набора данных выявил значительное сокращение в 23 ядерных кодированных митохондриальных мРНК в MS(рисунок 4B). Credentialing исследования с использованием иммуноцитохимии и на месте гибридизации показали, что эти гены были высоко обогащены в корковых нейронов проекции(Рисунок 4C) и что митохондрии изолированы от проекции аксонов дисплей снижение гликолиза ( Рисунок 4D). Эта статья катализировала акцент на митохондриальной дисфункции и сокращение производства АТС в качестве основного вклада в аксональной дегенерации в MS.

Рисунок 4: Данные Microarray и методы проверки ниже по течению, выполняемые в моторной коре MS. (A) Иерархическая кластеризация значительно измененных транскриптов из контрольного (C1-C6) и SPMS (MS1-MS6) образцов моторной коры, отдельно поддерживающих связанные с болезнью модели экспрессии генов. Среди уменьшенных транскриптов в коре двигателя MS, 26 принадлежали к цепи перехода электрона (B). Митохондриальный комплекс I (NDUFA6) мРНК был уменьшен в нейронах (n No 55-130) в мышечной коре(CII) по сравнению с контролем (CI ), в то время как плотность PLP mRNA были похожи между контролем (CIII ) и MS(CIV ) коры головного мозга. Активность электронных транспортных комплексов I и III была снижена в митохондриальных обогащенныхфракциях из моторной коры пациентов с рассеянным склетом (n No 3) (D). Перепечатано из Dutta et al.⁶ с разрешения. Бары ошибок представляют SEM; Шкала бар в CI-IV являются 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Патогенез когнитивной дисфункции в MS⁸. Сорок до 60% пациентов с рассеянным склепом имеют когнитивное снижение и снижение исполнительной функции. Мы определили гиппокамп, который является функциональным сайтом памяти / обучения, как общий сайт для демиелинации в MS. Затем мы сравнили экспрессию нейронов генов в миелинизированных и демиелинизированных гиппокампах и обнаружили значительное снижение нейронных мРНК, кодирующих белки, участвующие в памяти/обучении. Мы расширили эти данные, продемонстрировав, что некоторые микроРНК увеличиваются в демиелинизированном гиппокампе и что эти микроРНК могут уменьшить экспрессию глутамата рецепторов. Мы воспроизвели и расширили эти наблюдения в моделях грызунов. Затем мы сравнили экспрессию нейронов генов в миелинизированных и демиелинизированных гиппокампах и обнаружили значительное сокращение нейрональных белков, кодирующих мРНК, участвующих в памяти/обучении.

Рисунок 5: Сбор тканей, гистологический анализ и исследования экспрессии генов в ГИПпокампе MS. Мозг ломтики, содержащие гиппокампа выбираются во время вскрытия (A) и гиппокампа и прилегающих области удаляется (красная коробка) для дальнейшего анализа. Иммуносохранение для PLP показали сохранение миелина во всех контроля (B) и 40% MS гиппокампа (C). Обширная демиелинизнация была обнаружена в 60%ms гиппокампа (D ). По сравнению с контролем гиппокампа (E, G, I), значительные потери нейронов не было обнаружено в CA1, CA3, или CA4 регионах демиелинизированных MS гиппокампа (F, H, J), как показано на иммуногистохимии HuR. Двойная маркировка иммунофлуоресценции для миелина (миелин основной белок (MBP), зеленый) и аксоны (SMI32, красный) показали потерю миелина (L) с относительной сохранением аксонов (N) в MS демиелинированный гиппокамп по сравнению с контролем гиппокампа ( MBP, K; SMI32, M). Двойная кластеризация уровней экспрессии мРНК организовала образцы в дискретные кластеры на основе статуса миелина (миелинированный и демиелинированный) и местоположения (гиппокамп против моторной коры) (O). Высокие уровни мРНК обозначены красным и синим цветами, что означает низкий уровень экспрессии. Панели C-O адаптированы из Dutta и др.⁸ с разрешения. B-D: 2 мм, E-J: 100 мкм, K-N: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Патологические корреляты МРТ изменяются^12. Хотя МРТ является ценным показателем диагностики MS и ответ на лечение, а также предиктором прогрессирования болезни MS, патологические корреляты изменений МРТ плохо изучены. Наши посмертные МРТ-исследования были сосредоточены на двух МРТ-роуис. Церебральная белая материя ROIs, которые были только T2 гиперинтенсивных (T2 только) и ROIs, которые имели сочетание T1 гипоинтенсивность, T2 гиперинтенсивность, и снижение коэффициента передачи намагничиваемкости (MTR) (T2T1MTR). Приблизительно 45% церебрального белого вещества T2 только ROIs были миелинированы, подтверждающие их неспецифический характер. В отличие от этого, 83% T2T1MTR ROIs были хронически демиелинированы и появились как черные дыры. Значения T1 и MTR являются полуколичественными, и их значения сильно различаются в ROIs T2T1MTR. Если потеря миелина является единственным фактором, способствующим этим изменениям МРТ, то значения должны быть постоянными. Опухшие демиелинированные аксоны коррелируют со значениями T1 и MTR.

Рисунок 6: Коэффициенты переноса намагничивания (MTR) и коэффициентыконтрастности T1 линейно коррелируют с процентом Na q /K^, аксонов ATPase-положительных при хронических поражениях MS. Хронически-демиелинированные поражения, окрашенные для Na^q/K^, АТПас (зеленый) варьировались от почти 100% (A) до нуля (B) в нейрофиламенте (красный). Многие аксоны без Na^q/K^q ATPase имели увеличенные диаметры (B). Сравнение процентного соотношения na^q/K^- ATPase-положительных аксонов в хронически-демиелинизированных поражениях MS, коррелированных с количественными посмертными MTR (p qlt; 0.0001, C) и T1 контрастными коэффициентами (p q lt; 0.0006, D). Каждая точка данных происходит от одного поражения, и каждая уникальная цветово-символьная комбинация обозначает один из изученных мозгов. Весы баров 5 мкм. Воспроизводится из молодых и др.¹² с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Нейродегенерация не зависит от демиелинации¹¹. Исторически, нейродегенерации в MS было полагают, в результате демиелинации. Исследования изображений мозга, однако, подняли возможность того, что нейродегенерации и демиелинации могут быть независимыми событиями. Недавно мы определили субпопуляцию пациентов с рассеянным склеистой инфекцией, которые имеют демиелинизацию спинного мозга и коры головного мозга, но не из белого вещества головного мозга. Мы придумали этот подтип MS как миелокортикальный MS (MCMS). Случаи MCMS предоставили платформу для исследования взаимосвязи между церебральным белым веществом демиелинации и корковой потери нейронов. По сравнению с контролем кортиков, корковые потери нейронов был значительно больше в КОРТики MCMS, чем в типичных кортиков MS. Контрольная ткань мозга была получена из патологического отделения клиники Кливленда. Это исследование предоставляет первые патологические доказательства нейродегенерации при отсутствии демиелинации.

Рисунок 7: Потеря нейронов при отсутствии демиелинации белого вещества. Кресил фиолетовый-окрашенные корональной полушарии раздел от отдельных классифицируется как имеющие типичные MS (A). Плотность нейронов сравнивалась в корковых слоях III, V и VI в каждой из пяти обозначенных областей. Нейроны с площадью более 60 мкм² (желтый) показаны на репрезентативном изображении из верхней височной коры (B ). Маркировка для PLP и распределение демиелинизированных поражений (бело-материальная демиелинизнация выделена синим цветом; субпиальная демиелинизнациявыделена розовым цветом) в секциях полушария от лиц с типичным MS ( C) и миелокоркическим MS (D ) показаны. Значительная корреляция между снижением плотности корковых нейронов и увеличение мегенного белого вещества поражения был обнаружен в типичных MS, но не в миелокортикных MS (E); разбитые линии указывают 95% доверительный интервал (CI). IFG - нижняя лобная извилина. STG - превосходная височная извилина. ИНИ и низшие инсула. ИНН и превосходная инсула. CG и cingulate извилина. Воспроизведено из Траппа и др.¹¹ с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Продолжительность последовательности	Описание последовательности	Использование последовательности
0:09	Локализатор	Локализация для последующих последовательностей
9:14	3D-намагнижение подготовило быстрое градиентное эхо (MPRAGE)	Структурная томная оценка структуры мозга
5:14	3D-жидкость сослабленной инверсии восстановления (FLAIR)	Оценка резионного сегмента резконизации резкона резкона
2:35 2035	2D T2 взвешенный	Оценка резионного сегмента резконизации резкона резкона
5:12 17.04.2018	3D градиент-напомнил эхо с намагничиваемой передачи предварительного импульса , (MT-ON)	Предполагаемая мера содержания миелина в нормальном появлении и поражении тканей
5:12 17.04.2018	3D градиент-напомнил эхо без намагничиваемого передачи передачи предварительного импульса , (MT-OFF)
0:27	Диффузионное тензорное изображение (DTI) полекартирование	Измерение диффузии воды в тканях мозга, как считается, отражает целостность тканей мозга.
10:27 20.04.2017 Источник:	Диффузионная тензорная визуализация (DTI) мультиоболочка
13:18	Диффузионная тензорная визуализация (DTI) мультиоболочка
39:48:00	СУБTOTAL: ЯДРО

Таблица 1: Протокол посмертной визуализации.

Discussion

Мы описываем протокол, который был использован для быстрого закупки и обработки тканей из более чем 150 человек с MS. Важной особенностью этого протокола является то, что ученые, которые используют ткани также отвечает за создание протокола и выполнения сбора тканей. Это обеспечивает гибкость в удовлетворении научных потребностей отдельных исследовательских проектов. Некоторые аспекты этого протокола повышают его полезность. Пациенты, как правило, хорошо характеризуются до смерти, так как многие из них были следуют неврологи в нашем центре. Важным шагом является обработка тканей пожертвования вскоре после смерти, что повышает качество замороженных тканей по сравнению с некоторыми другими банками мозга. Это позволяет молекулярные исследования, которые имеют большое значение в описании изменений в транскрипционных и трансляционных генных продуктов, которые имеют важное значение для обоснования гистологических и иммуноцитохимических наблюдений. Использование морфологических/иммуноцитохимических и молекулярных данных в нескольких случаях повышает надежность выводов. Это лучше всего иллюстрируется нашим описанием изменений митохондриального гена в коре головного мозга и нейрональных изменений генов в демиелинизированных гиппокампах. Новые протоколы профилирования генов разрабатываются быстрыми темпами, и замороженные ткани в нашем банке должны обеспечить высококачественную РНК для анализа тканей и одноклеточных клеток.

Другим ценным аспектом нашего протокола является короткий фиксированный мозг ломтиками. Эти ткани разрезаются на 30 мкм толщиной, свободно плавающие секции. Эти разделы идеально подходят для использования конфокальной микроскопии для анализа двух или более антигенов в трех измерениях. Хорошими примерами являются взаимодействие домиелинирующих процессов олигодендроцитов с дистрофическими аксонами при хронических поражениях РАССЕЯНного склерозом, а также выявление одноаксональных соединений с трансектированными аксонаальными лампами опрокидки. Это в отличие от обычного использования 7 мкм толщиной парафина разделов, где 3D-изображения не представляется возможным. Парафин-встроенные ткани имеют большое значение для некоторых вопросов, особенно количественной нейронной плотности в полушарии 7 мкм толщиной разделов. Поэтому наши протоколы обработки тканей разнообразны и обеспечивают гибкость для обеспечения фиксированных и быстро замороженных тканей.

Еще одной уникальной особенностью нашего протокола является посмертная МРТ головного мозга на месте. МРТ мозга являются незаменимым биомаркером болезни MS. Поэтому необходимо установить патологические корреляты аномальных сигналов МРТ. Наши исследования показали, что как T2 только и T2T1MTR ROIs часто миелинизированы. Этот вывод поддерживает необходимость более конкретных методов визуализации, которые надежно различать миелинированных и демиелинизированных мозгового белого вещества. МРТ, как представляется, чувствительны для обнаружения миелина, но наши исследования показывают, что даже сочетание T1/T2/MTR не является специфическим для выявления миелинации. Наш посмертный протокол обеспечивает идеальную платформу для тестирования способности новых методов визуализации различать миелинизированное и демиелинизированное церебристое белое вещество. МРТ также является идеальным средством для перевода результатов фундаментальной науки в клиническую практику, учитывая использование МРТ в наших трансляционных исследованиях и ее широкое клиническое применение у живых пациентов.

В то время как резки короткие и длинные фиксированные, а также замороженные ломтики предлагает преимущество для обработки тканей в нескольких режимах для различных исследований, Есть некоторые ограничения с этим методом. Оценка всей структуры может быть ограничена, поскольку ее части могут быть обработаны по-разному на смежных срезах. Большой объем ткани банка, однако, предлагает возможность исследовать структуру интереса в нескольких предметах для улучшения выборки. Еще одно общее ограничение исследований с использованием посмертных тканей заключается в том, что они являются поперечными. Выводы, касающиеся сроков и хода изменений, должны толковаться в этом контексте. Там может быть выбор смещения для пациентов, которые жертвуют свои ткани, которые могут ограничить обобщение данных для всех пациентов с MS. Поскольку большинство доноров умирают от осложнений передовых MS, это не может быть целесообразным экстраполировать выводы из этих пациентов на более ранних стадиях MS. Тем не менее, мы получили ткани от молодых пациентов, которые умерли от не связанных с МС условиях (т.е. острый инфаркт миокарда, передозировка наркотиков, самоубийство). Сфера действия нашего протокола не включает выборку других органов (например, желудочно-кишечного тракта и костного мозга), которые были вовлечены в РАССЕЯНный склепом. Мы считаем, что сильные стороны программы значительно перевешивают ее ограничения.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антитела
биотинилированные козьи антимышиные IgG	Vector Laboratories	BA-9200	1:500 для полушария; 1:1,000 для 30&микро; m free-floating. RRID: AB_2336171
Биотинилированный козий антикролик IgG	Vector Laboratories	BA-1000	разведение 1:500.
Биотинилированный козий антикрысиный IgG	Vector Laboratories	BA-9400	разведение 1:500 для полушария; 1:1,000 для 30&микро; m free-floating. RRID: AB_2336208
Глиальный белок фибриллярной кислоты (GFAP)	Dako	Z0334	1:700 разведение для полушарий. RRID: AB_10013382
HuR, мышиный IgG, клон 3A2 Santa	Cruz	SC-5261	1:500 для 30&микро; m свободно плавающий. RRID: AB_627770
Главный комплекс гистосовместимости (MHC) класса II HLA-DR CR3/43	Dako	Mo746	1:250 разведение для полушария; 1:500 для 30 &микро; m свободно плавающий. RRID: AB_2313661
Нефосфорилированная нейрофиламент (SMI32)	Biolegend	801701	разведение 1:5,000 для полушарий; 1:2,500 для 30 &; m свободноплавающий. RRID: AB_2564642
фосфорилированный нейрофиламент (SMI31)	Biolegend	801601	разведение 1:5,000 для полушарий; 1:2,500 для 30 &микро; m free-floating. RRID: AB_2564641
Протеолипидный белок (PLP)	Подарок от Венди Маклин		1:250 разведение для ИГХ; альтернативные антитела против PLP коммерчески доступны.
Reagents
125 мм фильтровальная бумага	Ватман	1452-125	Для фильтрации PFA.
50% глутаральдегид	Электронная микроскопия Наука	16320	Степень электронной микроскопии.
Cytoseal	ThermoScientific	8310-16
Этиленгликоль	Fisher Chemical	BP230-4
Глицерин	Sigma-Aldrich	G7893	400 мл/2 л Криопротекционный раствор.
Millex-HV Шприцевой фильтрующий блок, 0,45 и микро; m, PVDF, 33 мм, гамма-стерилизованный	Millipore-Sigma	SLHV033RB
Параформальдегидная	электронная микроскопия Sciences	19200	Форма Приллов.
Поливинилпиролидон (PVP-40)	Fisher Chemical	BP220-212
Азид натрия	Fisher Chemical	S227I	2 г/2 л Буфер Соренсона.
Натрия фосфат двухосновной	Sigma-Aldrich	S0876	98,8 г/2 л буфер Соренсона.
Натрия фосфат моноосновной моногидрат	Sigma-Aldrich	S9638	14,352 г/2 л буфер Соренсона.
Сахароза	Sigma-Aldrich	PVP40-500G
VectaStain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100	1:1,000 разведение А и В. RRID: AB_2336819
Водостойкий рисунок черными чернилами	Higgins	44201
Xylene	Fisher Chemical	X3S	Гистологический сорт.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma	Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS	Siemens Healthineers