Методическая статья

Золото наночастицы модифицированных углеродного волокна микроэлектродов для расширенного нейрохимического обнаружения

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59552

⸱

13 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы модифицировать углеродно-волокнисты с золотыми наночастицами для повышения чувствительности обнаружения нейромедиатора.

Аннотация

На протяжении более 30 лет микроэлектроды углеродного волокна (CFMEs) были стандартом для обнаружения нейромедиатора. Как правило, углеродные волокна аспирируются в стеклянные капилляры, вытащил на тонкой конус, а затем запечатаны с помощью эпоксидной для создания электродных материалов, которые используются для быстрого сканирования циклического вольтамметрии тестирования. Использование голых CFMEs имеет ряд ограничений, однако. Прежде всего, углеродное волокно содержит в основном базальный углерод плоскости, который имеет относительно низкую площадь поверхности и дает более низкую чувствительность, чем другие наноматериалы. Кроме того, графитический углерод ограничен своим временным разрешением и относительно низкой проводимостью. Наконец, нейрохимические и макромолекулы, как известно, фол на поверхности углеродных электродов, где они образуют непроводящие полимеры, которые блокируют дальнейшее адсорбции нейромедиатора. Для этого исследования мы модифицируем CFMс с золотыми наночастицами для повышения нейрохимического тестирования с быстрой циклической вольтэмметрией. Au3 "был электродепозитили или окунулся из коллоидного раствора на поверхность CFMEs. Поскольку золото является стабильным и относительно инертным металлом, оно является идеальным электродным материалом для аналитических измерений нейрохимических веществ. Золото наночастицы модифицированные (AuNP-CFMEs) имели стабильность допамина ответ на протяжении более 4 ч. Кроме того, AuNP-CFMEs обладают повышенной чувствительностью (более высокий пик окислительного тока циклических вольтаммограмм) и более быстрыми кинетиками передачи электронов (нижнийEP или пиковое разделение), чем голые неизмененные CFMEs. Разработка AuNP-CFMEs предусматривает создание новых электрохимических датчиков для обнаружения быстрых изменений концентрации допамина и других нейрохимических веществ при более низких пределах обнаружения. Эта работа имеет огромное применение для повышения нейрохимических измерений. Поколение золотых наночастиц модифицированных CFMEs будет жизненно важное значение для разработки новых датчиков электродов для обнаружения нейротрансмиттеров in vivo у грызунов и других моделей для изучения нейрохимических эффектов злоупотребления наркотиками, депрессии, инсульта, ишемии, и других поведенческих и болезней государств.

Введение

Углеродно-волокнисты хреноводов (CFMEs)1 лучше всего использовать в качестве биосенсоров для обнаружения окисления нескольких важнейших нейротрансмиттеров2, в том числе допамина3, норадреналина, серотонин5, аденозин6, гистамин7, и другие8. Биосовместимость и размер углеродных волокон делают их оптимальными для имплантации, так как по сравнению с более крупными стандартными электродами можно смягчить повреждения тканей. 9 CFMEs, как известно, обладают полезными электрохимическими свойствами и способны сделать быстрые измерения при использовании с быстрыми электрохимическими методами, чаще всего быстро сканировать циклическую вольтамметрию (FSCV)10,11. FSCV это метод, который сканирует прикладной потенциал быстро и обеспечивает конкретные циклические вольтаммограммы для конкретных анализов12,13. Большой зарядный ток, производимый при быстром сканировании, стабилен на углеродных волокнах и может быть вычитан фоном для получения специфических циклических вольтаммограмм.

Благодаря своей оптимальной электрохимии и нейробиологической важности, допамин был широко изучен. Катехоламин допамина является важным химическим посланником, который играет ключевую роль в контроле движения, памяти, познания и эмоций в нервной системе. Избыток или дефицит допамина может вызвать многочисленные неврологические и психологические вмешательства; среди них болезнь Паркинсона, шизофрения и аддиктивное поведение. Сегодня болезнь Паркинсона продолжает быть распространенным расстройством из-за дегенерации нейронов среднего мозга, участвующих в синтезе допамина14. Симптомы болезни Паркинсона включают тремор, медлительность движения, жесткость, и проблемы в поддержании баланса. С другой стороны, стимуляторы, такие как кокаин15 и амфетамин16,17 способствовать переполнению допамина. Злоупотребление наркотиками в конечном итоге заменяет регулярный поток допамина и условия мозга требуют избытка допамина, что в конечном итоге приводит к привыканию поведения.

В последние годы, был акцент на улучшение функциональности электрода в нейромедиатор обнаружения18. Наиболее распространенным методом повышения чувствительности электродов является покрытие поверхности волокна. Удивительно, но было проведено ограниченное исследование, сделанное по электродепозиции металлических наночастиц на углеродные волокна19. Благородные металлические наночастицы, такие как золото, могут быть электродепозитированы на поверхность волокна с другими функциональными материалами20. Например, увеличение области электроактивной поверхности для нейромедиатора адсорбции произойти. Электродепозитные металлические наночастицы образуются быстро, могут быть очищены, и придерживаться углеродного волокна. Электрохимия по-прежнему имеет важное значение как для осаждения благородных металлических наночастиц, так и для улучшения поверхности углеродных волокон, так как позволяет контролировать нуклеацию и рост этих наночастиц. Наконец, увеличение каталитических и проводящих характеристик, а также улучшение общественного транспорта являются одними из других преимуществ использования металлических наночастиц для электроанализа.

Продвинутый лабораторный курс последовательности Американского университета (Experimental Biological Chemistry I и II CHEM 471/671-472/672) представляет собой сочетание аналитических, физических и биохимических лабораторий. Первый семестр представляет собой обзор лабораторных методов. Второй семестр является студентом инициативе и привело исследовательский проект21. Для этих проектов студенты ранее изучили механизм биомолекулы, белка, пептида и аминокислотного синтеза золотых наночастиц22,23. В последнее время основное внимание уделялось формированию производства золотых наночастиц (AuNP) на поверхностях электродов и оценке влияния AuNPs на способность CFMEs обнаруживать нейротрансмиттеры. В настоящей работе, лаборатория применила этот метод, чтобы продемонстрировать, что чувствительность CFMEs в обнаружении допамина окисления повышается за счет электродепозиции AuNP на поверхность волокна. Каждый голый CFME характеризуется различной скоростью сканирования, стабильностью и концентрацией допамина при обнаружении допамина-оксидативных токов для измерения окисления допамина на поверхности CFME. Ау-3был затем электросточен до Au0 и одновременно электродепозитов на поверхность волокна, как наночастицы, а затем ряд экспериментов по характеристике. После прямого сравнения было установлено, что АУНП-CFMEs обладают более высокой чувствительностью к обнаружению допамина. Равномерное покрытие AuNP на поверхность волокна через электродепозицию делает более высокую электроактивную область поверхности; таким образом, увеличивая адсорбцию допамина на модифицированную поверхность электрода. Это привело к более высоким допамина окислительных токов. Потенциальное разделение дофаминового окисления и пиковсокращения (Е п) АУНП-CFMEs также было меньше, что свидетельствует о более быстром кинетике передачи электронов. Будущие работы этого исследования включает в себя in vivo тестирования как голые и AuNP-CFMEs для обнаружения допамина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Строительство микроэлектродов из углеродного волокна

  1. Подготовка углеродных волокон
    1. Для создания микроэлектродов из углеродного волокна сначала отделяют углеродные волокна (углеродное волокно, 7 мм в диаметре) один за другим, используя руки, перчатки и шпатель.
    2. Вытяните или дерните одно волокно из витой пряжи.
    3. Приспособите изолированное углеродное волокно в стеклянный капилляр (одноствольный боросиликатка капиллярного стекла без микрофильтра, 1,2 мм внешнего диаметра, 0,68 мм внутреннего диаметра).
    4. Создайте держатель электрода для электродов, разрезав кусок картона длиной около 10 см на 25 см в ширину.
  2. Потяните электроды с помощью вертикального капиллярного шкива.
  3. Откройте раздвижную дверь вертикального капиллярного шкива.
  4. Освободите и удалите металлический стержень держателя, вращая дрель-чак против часовой стрелки с достаточным пространством для вставки стеклянного капилляра.
  5. Вставьте стеклянный капилляр в держатель электрода. Поднимите стеклянный капилляр до верхней части вертикального капилляра вручную вручную.
  6. Затяните стеклянный капилляр с дрель-патроны по часовой стрелке, не нарушая или разрушая стеклянные капилляры.
  7. Отрегулируйте настройки Heater 1, Heater 2, а магнитные настройки производителю предложили уровни, чтобы вытащить стеклянные капилляры до тонкого конуса для электродных материалов.
  8. Нажмите красную кнопку старта, чтобы нагреть скручиваемую катушки, чтобы вытащить электроды с помощью давления, тяжести и нагрева.
  9. Пусть скручиваемые катушки остыть от его красного горячего состояния. Вырезать углеродное волокно с ножницами подключения двух вытащил электродов сверху вниз. Используйте метод сверла-патрона, чтобы удалить стеклянный капилляр из вертикального капиллярного шкива, скручивая в против часовой стрелке направлении.

2. Подготовка микроэлектрода из углерода и волокна

  1. Под стереоскопом или микроскопом вырежьте углеродное волокно, выступающее с поверхности стеклянного капилляра хирургическими ножницами или острым лезвием бритвы, примерно до 100-150 мкм в длину.
  2. Приготовьте раствор эпоксидной смолы, смешивая 10 г эпоксидной смолы с 0,2 мл затвердевшей в флаконе 25 мл с помощью ватного тампона.
  3. Опустите только кончик каждого электрода в эпоксидную и затвердевательную раствор примерно на 15 с.
  4. Dip вышеупомянутой верхней части микроэлектрода углеродного волокна в ацетон примерно на 3 с, чтобы смыть излишки эпоксидной смолы из ствола микроэлектрода углеродного волокна.

3. Электродепозиция

  1. Поместите рабочий электрод (микроэлектрод из углеродного волокна) в раствор 0,5 мМ HAuCl4 в дополнение к эталону электрода, серебряно-серебряного хлорида (Ag/AgCl) с помощью микроманипулятора.
  2. Соедините рабочий электрод и эталонный электрод к потентиостату и хедстейру.
  3. Откройте программное обеспечение КООН HDCV. Измените настройки программного обеспечения для применения формы волны. Введите следующую форму волны в настройках компьютера: сканирование от 0,2 В до 1,0 V в 0,1 M KCl раствор, содержащий 0,5 мМ HAuCl4 при скорости сканирования 50 мВ/с в течение 10 циклов. Нажмите на зеленую стрелку, чтобы применить форму волны. Затем нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать запись измерений.

4. Сканирование электронной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение голые и золотые наночастицы модифицированных микроэлектродов углеродного волокна с помощью инструмента сканирования электронной микроскопии (SEM). Загрузите образец на черную проводящих ленту и следуя инструкциям производителя.

  1. Включение инструмента
    1. Поверните ключ к СНВ и отпустите.
    2. Откройте программное обеспечение InTouchScope, дважды нажав на него.
    3. Отпустите ключ. Он должен приземлиться на символ I сам по себе.
    4. Подождите, пока кнопка EVAC перестанет мигать.
    5. Как только кнопка EVAC перестанет мигать, нажмите кнопку VENT.
    6. Подождите, пока кнопка VENT перестанет мигать.
    7. Убедитесь, что рабочая дистанция (WD) находится на уровне 20 мм - 30 мм.
    8. Во время ожидания подготовьте образец (ы).
  2. Сканирования
    1. Как только кнопка VENT перестает мигать, загрузите образец (ы) в инструмент.
    2. Убедитесь, что изогнутая часть держателя образца указывается на инструмент при загрузке образца (ы).
    3. Нажмите кнопку EVAC после загрузки образца(ы).
    4. Отрегулируйте рабочее расстояние до 10 мм.
    5. Как только кнопка EVAC перестанет мигать, включите компьютер.
    6. Нажмите на программное обеспечение In Touch Scope, расположенное на рабочем столе. Есть два в Touch Scope программного обеспечения, нажмите на один без зеленого и желтого круга.
    7. Как только программное обеспечение открывается, нажмите на OBSERVE (вверху справа от экрана), чтобы включить луч. Убедитесь, что кнопка EVAC перестала мигать перед нажатием на OBSERVE.
    8. Начните анализ образца (ы).
    9. Убедитесь, что настройки напряжения, рабочего расстояния (WD) и зонда (PC) являются приемлемыми.
    10. Увеличьте масштаб (50 X) для более высокой настройки и увеличиваем для более низкой настройки.
    11. Установите рабочую дистанцию в 10 мм.
    12. Прежде чем сфотографировать образец (ы), убедитесь, что изображение будет сохранено в папку желаемого назначения.
    13. Чтобы выбрать нужную папку, нажмите на настройки (вверху слева от экрана).
    14. Экспорт фотографий с компьютера с помощью флэш-накопителя.
  3. Отключение
    1. Нажмите на OBSERVE, чтобы выключить луч.
    2. Нажмите кнопку VENT и подождите, пока она перестанет мигать.
    3. В ожидании кнопки VENT, чтобы остановить мигает, настроить рабочее расстояние обратно до 20 мм - 30 мм.
    4. Как только кнопка VENT перестает мигать, выгрузите образец (ы) с инструмента.
    5. Нажмите кнопку EVAC и подождите, пока она перестанет мигать.
    6. Как только кнопка EVAC перестает мигать, выйдите из программного обеспечения и выключите компьютер.
    7. Поверните ключ к символу O, чтобы полностью выключить инструмент.

5. Быстрое сканирование циклического тестирования вольтамметрии

  1. Соедините микроэлектрод из углеродного волокна к потентиостату и хедстейру вместе с эталонным электродом Ag/AgCl.
  2. Используя микроманипулятор, опустите микроэлектрод углеродного волокна в ячейку потока, вручную регулируя ручки измерения X, Y и No.
  3. Подготовка буферного раствора в воде DI (131,5 мм NaCl, 3,25 мм KCl, 1,2 мм CaCl2, 1,25 мм2PO4, 1,2 мм MgCl2, и 2,0 мм Na2SO4 с pH скорректированы до 7,4).
  4. Заполните ячейку потока фосфатным буфером сольников (PBS) (pH 7.4).
  5. Используя заполненный 60 мл буферного шприца, введите буфер PBS в ячейку потока примерно на 1 мл/мин.
  6. Поместите электрод в ячейку потока и нанесите форму волны, нажав зеленую кнопку. Наблюдайте за осциллоскопом и либо режьте электрод, либо отрегулируйте выигрыш, чтобы предотвратить перегрузку. Разрешить в течение примерно 10 минут равновесия между каждым электрод перспективе.
  7. Установите форму волны по умолчанию на форму допамина. Сканирование от - 0,4 V до 1,3 V при 10 Гц и 400 В/с.
  8. Подготовка бульона раствор 10 мм допамина, серотонина, норадреналина и других в перхлорной кислоте. Разбавить нейрохимические вещества до конечной концентрации 1 мкм в буфере путем пайпетирования 1 мкм раствора допамина в 10 мл буфера PBS с помощью пипетки.
  9. Чтобы начать измерения, нажмите кнопку записи. После 10 с, вводят 0,2 мл 1 мМ допамина в клетку потока или любой другой концентрации нейромедиатора. Отрегулируйте концентрацию, скорость сканирования, форму волны (удержание потенциала или потенциал переключения) соответственно. Установите общее время выполнения для 30 s.
  10. Проанализируйте пробег с помощью программного обеспечения анализа HDCV. Изменение параметров по мере необходимости.
  11. После завершения эксперимента очистите ячейку потока, вводя 3 мл воды, а затем воздух в буфер и инъекционные порты ячейки потока три раза каждый.
  12. Выключите форму волны и инструмент.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для рисунка 1, мы показываем схему, где FSCV тестирование используется для измерения концентрации нейротрансмиттеров в пробирке. Рисунок 1 отображает форму допамина волны применяется. Сканирование формы треугольника от -0,4 В до 1,3 В при 400 В/с. Во второй части фигуры слева, он отображает окисление допамина допамина-орто-хинона (ДОЗ), два процесса передачи электрона происходит от поверхности analyte к поверхности электрода. Нак...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы демонстрируем новый метод построения золотисто-наночастиц ы модифицированных микроэлектродов углеродного волокна для обнаружения нейротрансмиттеров, таких как допамин с помощью быстрой циклической вулканической вольтамметрии. Этот метод является эффективным, зеленым и относительно недорогим подходом к повышению чувствительности обнаружения биомолекул. Толщина золота, отложенного на поверхность углеродного волокна, может контролироваться к моменту электродепозиции и концентрации золота, присутствующ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Американский университет, Грант поддержки исследований факультета, космический грант НАСА DC, и NSF-MRI-1625977.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дофамина гидрохлоридSigma AldrichH8502-5G
Фосфат буферизованный физиологический растворSigma AldrichP5493-1L
Pine WaveNeuro PotentiostatPine InstrumentsNEC-WN-BASICЭтот заказ поставляется оптом со всеми другими аксессуарами, такими как головные станции, адаптеры, шнуры и другая электроника
Pine Flow Cell и микроманипуляторPine InstrumentsNEC-FLOW-1Это также еще один оптовый заказ, включающий микроманипулятор, проточную ячейку, ручки, трубки, соединители и т. Д.
Стекло-капиллярныесистемы A-M602500
T-650 Углеродное волокноGoodfellowC 005711
Epon 828 Эпоксидная смолаMiller-StephensonEPON 828 TDS
ДиетелинетриаминSigma AldrichD93856-5ML
Золотой (III) хлоридSigma Aldrich254169HAuCl4 или AuCl3
FisherS90528
Клетка ФаррадеяAMETEK TMC81-334-03
Шприцевой насосNEW ERA PUMPNE-1000
Eppendorf Пипетки и наконечникиEppendorf2231000222Это также оптовый заказ, содержащий несколько пипеток и наконечников
10 -1,000 мл стаканыVWR10536-390
Углеродное волокноGoodfellowC 005711
SEMJEOLJSM-IT100
Поставляется как pH-метр

Ссылки

  1. Zestos, A. G., Nguyen, M. D., Poe, B. L., Jacobs, C. B., Venton, B. J. Epoxy insulated carbon fiber and carbon nanotube fiber microelectrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 182, 652-658 (2013).
  2. Bucher, E. S., Wightman, R. M. Electrochemical analysis of neurotransmitters. Annual review of analytical chemistry. 8, 239-261 (2015).
  3. Zestos, A. G., Venton, B. J. Communication—Carbon Nanotube Fiber Microelectrodes for High Temporal Measurements of Dopamine. Journal of The Electrochemical Society. 165, G3071-G3073 (2018).
  4. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of neurochemistry. 119, 932-944 (2011).
  5. Abdalla, A., et al. In Vivo Ambient Serotonin Measurements at Carbon-Fiber Microelectrodes. Analytical chemistry. 89, 9703-9711 (2017).
  6. Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PloS one. 13, e0196932(2018).
  7. Denno, M. E., Privman, E., Borman, R. P., Wolin, D. C., Venton, B. J. Quantification of histamine and carcinine in Drosophila melanogaster tissues. ACS chemical neuroscience. 7, 407-414 (2016).
  8. Sanford, A. L., et al. Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes. Analytical chemistry. 82, 5205-5210 (2010).
  9. Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Analytical chemistry. 76, 5697-5704 (2004).
  10. Raju, D., et al. Polymer modified carbon fiber-microelectrodes and waveform modifications enhance neurotransmitter metabolite detection. Analytical Methods. 11, 1620-1630 (2019).
  11. Jacobs, C. B., Ivanov, I. N., Nguyen, M. D., Zestos, A. G., Venton, B. J. High temporal resolution measurements of dopamine with carbon nanotube yarn microelectrodes. Analytical chemistry. 86, 5721-5727 (2014).
  12. Zestos, A. G., Yang, C., Jacobs, C. B., Hensley, D., Venton, B. J. Carbon nanospikes grown on metal wires as microelectrode sensors for dopamine. Analyst. 140, 7283-7292 (2015).
  13. Zestos, A. G. Carbon Nanoelectrodes for the Electrochemical Detection of Neurotransmitters. International Journal of Electrochemistry. , (2018).
  14. Kim, J. H., et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature. 418, 50(2002).
  15. Zestos, A. G., et al. Ruboxistaurin Reduces Cocaine-Stimulated Increases in Extracellular Dopamine by Modifying Dopamine-Autoreceptor Activity. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1960-1969 (2019).
  16. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS Journal. 19, 1284-1293 (2017).
  17. Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42, 1940(2017).
  18. Zestos, A. G., Venton, B. J. Carbon Nanotube-Based Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection. ECS Transactions. 80, 1497-1509 (2017).
  19. Zachek, M. K., Hermans, A., Wightman, R. M., McCarty, G. S. Electrochemical Dopamine Detection: Comparing Gold and Carbon Fiber Microelectrodes using Background Subtracted Fast Scan Cyclic Voltammetry. J Electroanal Chem (Lausanne Switz). 614, 113-120 (2008).
  20. Li, J., Xie, H., Chen, L. A sensitive hydrazine electrochemical sensor based on electrodeposition of gold nanoparticles on choline film modified glassy carbon electrode. Sensors and Actuators B: Chemical. 153, 239-245 (2011).
  21. Hartings, M. R., Fox, D. M., Miller, A. E., Muratore, K. E. A hybrid integrated laboratory and inquiry-based research experience: replacing traditional laboratory instruction with a sustainable student-led research project. Journal of Chemical Education. 92, 1016-1023 (2015).
  22. Hart, C., et al. Protein-templated gold nanoparticle synthesis: protein organization, controlled gold sequestration, and unexpected reaction products. Dalton Transactions. 46, 16465-16473 (2017).
  23. Hartings, M. R., et al. Concurrent zero-dimensional and one-dimensional biomineralization of gold from a solution of Au3+ and bovine serum albumin. Science and technology of advanced materials. 14, 065004(2013).
  24. Xiao, N., Venton, B. J. Rapid, sensitive detection of neurotransmitters at microelectrodes modified with self-assembled SWCNT forests. Analytical chemistry. 84, 7816-7822 (2012).
  25. Zestos, A. G., Jacobs, C. B., Trikantzopoulos, E., Ross, A. E., Venton, B. J. Polyethylenimine Carbon Nanotube Fiber Electrodes for Enhanced Detection of Neurotransmitters. Analytical chemistry. 86, 8568-8575 (2014).
  26. Yang, C., et al. Carbon nanotubes grown on metal microelectrodes for the detection of dopamine. Analytical chemistry. 88, 645-652 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo

Похожие статьи