Технический аспект автоматизированного синтеза и кинетической оценки в реальном времениNo 11C'SNAP-7941

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для полностью автоматизированной радиомаркировки^{No 11}C'SNAP-7941 и анализа кинетики в реальном времени этого ПЭТ-трассировщика на P-gp выражении и невыразительных клетках.

Аннотация

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) является важным методом молекулярной визуализации, обеспечивающим понимание путей и использование конкретных целевых радиолигандов для исследований in vivo. В рамках этого протокола описан надежный и надежный дистанционно управляемый радиосинтез^{No 11}C'SNAP-7941, антагонист к рецептору гормона, концентрирующего меланин 1. Радиосинтез начинается с циклотрона, произведенного^{No 11}C'CO 2, который впоследствии дополнительно реагирует с помощью газофазного перехода к^{No 11}C'CH₃OTf. Затем этот реактивный промежуточный вводится в раствор-предшественник и формирует соответствующий радиотрейстер. Химическая, а также радиохимическая чистота определяются с помощью RP-HPLC, регулярно внедряемого в процессе контроля качества радиофармацевтических препаратов. Кроме того, активность моляра рассчитывается так как она является необходимостью для следующих кинетарных исследований в реальном времени. Кроме того, для оценки влияния Экспрессии P-гликопротеинов (P-gp) на накопление клеток применяется¹¹C'SNAP-7941. По этой причине, P-gp экспрессии клеточной линии (MDCKII-hMDR1) либо используется без или с блокированием до экспериментов с помощью P-gp субстрата (я)-вераполила и результаты сравниваются с теми, наблюдается для клеток дикого типа. Общий экспериментальный подход демонстрирует важность точного тайм-менеджмента, который необходим для каждого доклинического и клинического исследования с использованием ПЭТ-трассировок, оснащенных недолговечными нуклидами, такими как углерод-11 (половина жизни: 20 мин).

Введение

11^С. SNAP-7941 был разработан в качестве первого позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-трассировщик ориентации меланина концентрации гормона рецептора 1 (MCHR1) - рецептор в основном участвует в центральной регуляции аппетита и потребление пищи¹. Углерод-11 маркировки SNAP-7941, хорошо характеризуется MCHR1 антагонист, дали подлинный ПЭТ-трейсер^2,3,4,5. Тем не менее, полностью автоматизированный радиосинтез является весьма сложной задачей с точки зрения эффективности времени и воспроизводимости с недолговечной радионуклид углерода-11 предлагает период полураспада 20 мин⁶. Общее время синтеза должно быть сведено к минимуму, и, как правило, не должно превышать 2-3 период ыполудения (т.е. около 40-60 мин для углерода-11)⁷. Особенно, процедуры синтеза для радиотрейсеров ориентации рецепторных систем с низкой плотностью экспрессии должны быть широко оптимизированы для получения достаточной урожайности и, следовательно, высокой молярной активности⁸. Синтетическая стратегия часто следует за продукцией радионуклида внутри циклотрон и отпуском^{No 11}C'CO₂ к синтезатору. Там,^{No 11}C'CO₂ сначала сводится к¹¹C CH 4, а затем отреагировал ийодом, чтобы дать¹¹C'CH₃Я с помощью газофазного метода^9,10. Дальнейшая обработка серебряным трифлом дает¹¹C'CH₃OTf непосредственно в режиме он-лайн. После этого реактивный углерод-11 помечены промежуточные вводится в раствор, содержащий молекулы-предшественника. Автоматизированный радиосинтез дополнительно включает в себя процесс очистки с полу-подготовкой RP-HPLC, включая последующую разработку продукта, пригодного для доклинических и клинических исследований.

Независимо от период полураспада радионуклида и времени усилия радиосинтеза, фармакокинетическая радиофармацевтической является наиболее важной частью для оценки во время развития ПЭТ-трассировки. С точки зрения нейровизуализации, ввод мозга ПЭТ-трекер является основным условием. Тем не менее, гематоэнцефалический барьер (BBB), "граница безопасности" мозга, высоко выражает efflux транспортеров, которые могут выгрузить небольшие молекулы (например, ПЭТ-трассы) и эффективно препятствовать их применимости.

Огромным недостатком во время доклинической оценки являются неожиданные взаимодействия с этими транспортерами efflux, которые часто не распознаются вэкспериментах in vitro и приводят к сбою ПЭТ-трасса in vivo, как это наблюдается в 11 C'SNAP-7941. Изображение ПЕТ у крыс продемонстрировало низкое накопление мозга, которое резко возросло после введения ингибитора P-gp tariquidar^11. Эти данные свидетельствуют о том, что^{No 11}C'SNAP-7941 является субстратом этой системы транспортера efflux, препятствующей связыванию лиганда к центральному MCHR1. К сожалению, по-прежнему отсутствует адекватные модели in vitro, позволяющие прогнозировать проникновение BBB на ранней стадии развития трассировщика.

Здесь мы описываем автоматизированный синтез^{No 11}C'SNAP-7941 с использованием синтезатора для метилирования углерода-11. Основное внимание в этой работе, чтобы дать обзор о том, как организовать последовательный экспериментальный подход, включая автоматизированный синтез, контроль качества, а также последовательные в пробирке оценки с очень недолго нуклид углерода-11.

Во-первых, описаны ключевые шаги для успешного радиосинтеза с минимальными затратами времени и максимаальной урожайностью. Затем, надежная процедура контроля качества устанавливается сделать радиотрейстер доступны для потенциальных клинических исследований и отвечают критериям Европейской Pharmacopoeia¹². Количественная оценка концентрации моляров и расчет соответствующей молярной активности является необходимым требованием для последовательных кинетических измерений.

Наконец, представлен новый и простой метод in vitro, оценивающий взаимодействие¹¹C'SNAP-7941 с транспортером эффлюкса, P-gp (hMDR1). Предлагаемая кинетическая модель использует простое в обращении устройство, которое позволяет немедленную интерпретацию данных и требует минимальных усилий по культуре клеток^13.

Протокол

ВНИМАНИЕ: В следующем протоколе участвуют несколько этапов, которые требуют обработки и манипуляции радиоактивностью. Важно, чтобы каждый шаг был согласован с Департаментом радиационной безопасности института и соответствующим национальным законодательным органом. Необходимо свести к минимуму воздействие ионизирующего излучения для операторов, участвующих в этом проекте по принципу ALARA ("Как мало, как разумно достижимый").

1. Управление временем и планирование эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Короткий период полураспада углерода-11 требует точного управления временем, чтобы свести к минимуму потерю радиоактивности (рисунок 1). Важно, чтобы любое лицо, о котором идет речь, знало свою область ответственности и сроки соответствующего действия. Для создания кинетической эксперимента в режиме реального времени, состоящего из¹¹C'SNAP-7941, необходимо около четырех человек для плавного процесса.

1. Организуйте производителя для¹¹C'SNAP-7941.
2. Сообщите оператору контроля качества, выполняя оценку спецификации, расчет концентрации массы и молярной активности времени начала синтеза.
3. Держите кинетического экспериментатора в реальном времени готового к расчету разбавления и выполнению эксперимента.
4. Проинструктируйте бегуна о переносе радиоактивности в соответствующее место в соответствующем временном пункте.

2. Автоматизированный синтез^{No 11}C'SNAP-7941 для доклинического использования

1. Приготовление синтезатора (рисунок 2).
   1. Включите синтезатор, необходимые технические газы (гелий и водород) и программное обеспечение для управления синтезатором Tracerlab. Выберите соответствующую последовательность синтеза оснастки .
   2. Вымойте V1-V3 один раз с водой и дважды с ацетоном через реактор и клапан HPLC либо на нагрузку или впрыснуть положение в бутылку отходов цикла.
   3. Сухие все связанные линии в и из реактора через инъекционный клапан с непрерывным потоком гелия, активированным через V18.
   4. Нагрейте ловушку No¹¹C'CH 3, а также ловушку^{No 11}C'CH₃OTf под гелиевым потоком 100 мл.мин^-1 до 200 градусов по Цельсию через V24, V25, V29, V15, V9, V17 и V32/V33 с отсоединителем.
   5. Проверьте тот же путь на наличие утечек (с прикрепленным реактором) с гелиевым потоком 100 мл-мин^-1. Герметичность гарантируется, когда поток опускается ниже 4 мл.мин^-1.
   6. Включите насос HPLC (5-10 мл-мин^-1) и промойте линии HPLC и инъекционный клапан ацетонитрилом/водой (50/50, v/v), а также линии HPLC с растворителем HPLC через V14 в лампочку.
   7. Опустошить луковицу через V11 и V12 в бутылку отходов с гелием поток через V19. Вымойте соответствующие линии с водой из V6 снова через V11 и V12 с гелиевым потоком через V18.
   8. Вымойте V5 с этанолом и V4 с водой через V11 и V12 в флакон коллекции продукции (PCV) с помощью гелия поток через V18, а затем опорожнить PCV через V13 в бутылку отходов с гелием поток через V20.
   9. Выключите насос HPLC, переключитесь на растворитель для синтеза ((ацетат аммония (2,5 г) L^-1)/уксусная кислота 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/ацетонитрил 75/25 v/v), прикрепите полупрепаративную колонку HPLC и уравновесите столбец (поток 5 мл.мин^-1).
   10. Заполните реагенты для синтеза и очистки: 1,5 мл воды (V2), 4,5 мл 0,9% NaCl (V4), 0,5 мл 96% этанола (V5), 10 мл воды (V6), и 90 мл воды (луковица).
   11. Прикрепите новый флакон отходов цикла; продукт флакон (помечены и оснащены аэрации иглы) на V13 и жидкого азота.
   12. Предварительно езкомыт картридж SPE (твердая фаза извлечения) с 10 мл 96% этанола и 20 мл воды и прикрепить его между V11 и V12.
   13. Начните предзапуск последовательности 20 мин перед началом синтеза, состоящий из нагрева ловушки^{No 11}C'CO₂ до 400 градусов по Цельсию и промывки ловушки с гелием поток 50 мл'мин^-1через V27 (2 мин). Затем предварительно промойте ловушку^{No 11}C'CO₂ в течение 3 мин с водородным газом (120 мл.м.,^-1) и, наконец, остыть до уровня ниже 40 градусов по Цельсию.
   14. Растворите 1 мг прекурсора в 400 л ацетонитрила (для синтеза ДНК, lt; 10 H₂O), перенесите раствор на реакцию и добавьте 5,5 л TBAH (264 мг/мл^-1 в метаноле). Прикрепите реактор к соответствующей позиции.
   15. Закройте горячую ячейку и включите под давлением горячей ячейки.
   16. Подтвердите начало процесса охлаждения ловушки CH₄ с жидким азотом до -75 градусов по Цельсию.
   17. Отпустите радиоактивность при температуре.
2. Производство циклотронов^{No 11}C'CO₂
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.2.1-2.2.4 проводятся одновременно с подготовкой модуля радиосинтеза (см. также рисунок1).
   1. Включите магнит циклотрон.
   2. Выберите цель ¹¹C-CO₂ и начните луч 65 ЗА.
   3. Подтвердите начало облучения, нажав кнопку Начало облучения
   4. Остановите луч и подтвердите высвобождение радиоактивности в синтезатор, нажав кнопку Доставка,после достижения желаемого количества радиоактивности (около 120 ГБК после 30 мин).
3. Выполнение полностью автоматизированного радиосинтеза
   1. Подтвердите, что система готова к приему радиоактивности и запуску автоматизированного процесса
   2. Мониторинг следующего автоматизированного процесса.
      1. Проверить, если11 C'CO₂ автоматически передается из циклотрона в единицу синтеза через V26 (около 4 мин) и что¹¹C'CO₂ в ловушке на молекулярном сито пропитанник никеля в качестве катализатора ( ^{11 Год} Ловушка C'CO₂ при комнатной температуре.
      2. Отслеживайте, если ловушка No¹¹C'CO₂ автоматически промывается сначала гелием (50 мл., то^сводородным газом (120 мл-мин^-1). Затем заметьте, что V27 и V25 закрыты, а захваченные¹¹C'CO 2, включая водородный газ, нагреваются до 400 градусов по Цельсию и что сформированный^{No 11}C-CH₄ дополнительно транспортируется в предварительно охлажденный No¹¹C ловушки и в ловушке там.
      3. Монитор, что V10 закрыт, V9 открыт (в сторону йодной колонки) и^{No 11}C CH₄ снова освобождается путем нагрева ловушки^{No 11}C CH₄ медленно до 80 градусов по Цельсию и транспортируется в блок циркуляции с гелиевым потоком через V10 (выход из выхлопных газов). И далее проверить, если¹¹C CH₄ преобразуется в^{No 11}C CH₃Я в циркуляции единицы, которая длится около 3 мин, и формируется¹¹C CH₃Я постоянно в ловушке на¹¹C CH₃I ловушка.
      4. Убедитесь, что выхлопной клапан V16 открыт, а ловушка No¹¹C'CH₃I нагревается до 90 градусов по Цельсию с потоком гелия (20 мл-мин^-1) через V24. Таким образом, возможные побочные продукты удаляются, а затем V16 закрывается.
   3. Подтвердите, что^{No 11}C CH₃я готов к выпуску в реактор.
   4. Мониторинг следующего автоматизированного процесса: Проверьте, если ловушка No¹¹C'CH₃Я нагревается до 190 градусов по Цельсию, а сформированная 11 C'CH₃Я выпущена в реактор через ловушку No¹¹C'CH₃OTf (V32 и V33, еще на 200 C), V7 и V8 под непрерывным гелиевым потоком (10-25 мЛ-мин^-1, V24). Во время этого процесса, V21 и V23 (выход из выхлопных газов) должны быть открыты.
   5. Подтвердите, что радиоактивность прибыла в реактор, как только количество радиоактивности в реакторе больше не повышается.
   6. Мониторинг следующего автоматизированного процесса и подготовка к ручному вмешательству, если это необходимо
      1. Проверьте, автоматически ли автоматически закрываются V23, V21 и V8, а реакционная смесь нагревается до 75 градусов по Цельсию. После 3 мин, наблюдать, если реактор охлаждается жидким азотом, пока температура не будет ниже 35 градусов по Цельсию. Впоследствии убедитесь, что реакционная смесь затушена 1,5 мл воды через V2. Во время этого процесса, V21 и V23 (выход из выхлопных газов) должны быть открыты.
      2. Отслеживайте, если V21 и V23 закрыты и реакционная смесь передается в инъекционный клапан HPLC, проходя через детектор жидкости в петлю HPLC (5 мл). Отслеживайте, если реакционная смесь автоматически вводится в столбец HPLC.
   7. Наблюдайте хроматограмму и отрежьте вручную пик продукта через стартпик кнопки. Нажмите Пик конца, когда продукт пиковый сигнал падает ниже примерно 400 cps после времени удержания около 8-10 мин (поток: 5 мЛ мин^-1, Рисунок 3).
   8. Включите дополнительный поток гелия для ускорения опорожнения лампы.
   9. Монитор ли лампа опорожнения и наблюдать за отходами бутылку: Проверьте, если лампа опорожняется через V11, картридж SPE и V12 в отходы с гелием поток через V19 и дополнительной линии гелия, и если продукт сохраняет на картридже SPE.
   10. Подтвердите, что лампочка полностью пуста.
   11. Мониторинг автоматизированного процесса очистки SPE и передачи продукции
       1. Проверьте, если картридж SPE промывают с 10 мл воды через V6, V11, и V12 в отходы, и если этанол elutes продукт в PCV через V5, V11, и V12. Наконец, обратите внимание, если 0,9% NaCl добавляется в PCV через V4, V11 и V12, чтобы разбавить продукт.
       2. Убедитесь, что решение продукта передается через V13 и стерильный фильтр в флакон конечного продукта с гелиевым потоком через V20.
   12. Подтвердите, что продукт был полностью передан.

3. Контроль качества (КК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль качества радиофармацевтических препаратов включает в себя измерение следующих параметров:

• Радиохимическая чистота и моляровая активность (RP-HPLC)
• Остаточные растворители (газовая хроматография, ГК)
• Осмолальность (осмометр давления пара)
• рН (рН-метр)
• Чистота спектра/радионуклида (з-спектрометр)
• Полураспада / радионуклид чистоты (доза калибратора)

Все физико-химические параметры определяются до выпуска продукта, а значения должны быть в определенном параметре качества.

1. Подготовка оборудования для контроля качества
   1. Начните подготовку за 30 минут до окончания синтеза.
   2. Приготовьте конический флакон в свинцовом защищенном контейнере и защищенный шприц объемом 1 мл с прикрепленной иглой.
   3. Подготовьте эталонное стандартное решение SNAP-7941 (10 мкгл^-1) в воде для HPLC.
   4. Включите счетчик рН, газовый хроматограф и использованные газы, осмометр и все компоненты HPLC.
   5. Включите программное обеспечение управления HPLC и выберите выделенную колонку и соответствующий метод для^{No 11}C'SNAP-7941 (мобильная фаза: (вода/ацетика 97,5/ 2,5 v/v; 2,5 г.Л.л^.1 аммоний ацетат; рН 3,5)/ацетонитрий 70/30 v/v; поток: 1 мл/мин ^-1) и написать список образцов с двумя измерениями (стандарт и продукт). Запустите метод кондиционирования столбца.
   6. Введите 20 злиц референтного раствора SNAP-7941 со шприцем Hamilton после 10 мин кондиционирования и начните аналитический запуск.
   7. Вымойте шприц Гамильтона два раза с ацетонитрилом и водой после инъекции.
   8. Запустите программное обеспечение управления GC и напишите список примеров.
2. Выполнение контроля качества
   1. Измерьте абсолютный радиоактивный выход продукта после окончания синтеза и перенесите 100 л продукта в реакционный флакон с подготовленным шприцем для контроля качества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, полученные в ходе контроля качества, должны быть задокументированы в соответствии с национальными правилами.
   2. Аналитический HPLC: Измерьте радиохимическую чистоту и химическую чистоту и сообщите персоне ответственному для экспериментов культуры клетки немедленно результатов.
      1. Нарисуйте 40 зл и вводят в HPLC 40 qL образца КК. Начните пробег, перемещая руку инъекционного клапана от нагрузки к inject (рисунок3).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Во время бега (8 минут), другие измерения протокола могут быть выполнены, чтобы избежать как можно больше распада, как это возможно.
      2. Откройте хроматограмму и интегрируйте все пики в канал радиоактивности. Сравните время хранения продукта (5.0-7.0 мин) с временем удержания эталонного стандарта. Сравните область под кривой в процентах от всех интегрированных пиков. Пик продукта должен составить более 95% (радиохимическая чистота) от общего интегрированного участка (радиоканала).
      3. Интегрируйте сигнал в УФ-канал для определения химической чистоты. Основной примеси, как правило, предшественник SNAP кислоты на 2,8-3,5 мин. Концентрация^натC'SNAP-7941 рассчитывается из кривой калибровки после интеграции. Рассчитайте концентрацию SNAP-7941 в «мололимл-1» и определите активность моляра с помощью следующего уравнения:
         
   3. Для газовой хроматографии перенесите 20 зл и контроля качества в специальный стеклянный флакон. Поместите его в автосэмпере и начните измерение. После завершения измерения откройте хроматограмму и запишите числа автоматически интегрированных пиков. Образец не должен содержать более 410 ppm ацетонитрила и 10% этанола.
   4. Осмолальность: Положите бумажный образец диска на выделенную полость и нанесите 10 зл и на образец. Нажмите кнопку "Закрыть" для измерения осмолальности. После 3 мин, устройство отображает осмолинность, которая должна быть в диапазоне 190-500 мхм кг^-1.
   5. рН: Вымойте электрод водой. Измерьте рН, поставив электрод в образец. РН должен быть в диапазоне 5,0-8,5. Вымойте электрод снова после измерения и поместите электрод в референтный раствор рН.
   6. В-спектр: Поместите образец КК в спектрометр, откройте программное обеспечение для управления и начните измерение. Остановите измерение и запишите измеренную энергию, которая должна быть 511 кеВ (диапазон 420-520 кеВ). Откройте меню файла и обезопасите файл с соответствующим номером партии. Вспомните сохраненный спектр в специальном программном обеспечении и распечатайте спектр.
   7. Период полураспада: Измерьте активность образца КК два раза с помощью калибратора дозы. Запишите соответствующие времена и вычислите период полураспада экспоненциального.
3. Выпуска
   1. После того, как все параметры были проверены и результаты в соответствии с руководящими принципами австрийских властей, освободить radiotracer. Оператор должен подписать правильность данных.

4. Оценка взаимодействия с транспортером P-gp

1. Культура сотовой связи
   1. Начните ламинарный поток воздуха (LAF) рабочей скамьи и очистите скамейку не менее 15 минут, прежде чем приступить к работе.
   2. Смешайте среднюю среду клеточной культуры в стерильных условиях в LAF с 10% FCS (50 мл) и 0,5% антибиотиков (2,5 мл) со стерильной объемной пипеткой с помощью автоматизированной помощи пипетки.
   3. Оттепель MDCKII-hMDR1 и MDCKII-WT клетки и культивировать в T75 или T175 клеточной культуры колбу 10-14 дней до экспериментов в асептических условиях (LAF).
   4. Изменение среды на следующий день, чтобы удалить все не приверженцы и апоптотические клетки.
   5. Замените каждые три дня среду на свежую (12 мл для T75 и 23 мл для колбы культуры т175, соответственно).
   6. Разделите клетки в соответствии с графиком экспериментов на свежие колбы или к посудам клеточной культуры при слиянии 80%, чтобы избежать двуслойности.
2. Подготовка клеток к экспериментам
   1. Разделите клетки за два дня до начала экспериментов и семена в концентрации 2,5 х 10⁵ ячеек на 2 мл в косой плоскости тарелки клеточной культуры (рисунок4). Используйте автоматическое устройство счетчика ячеек или камеру подсчета голосов Neubauer для подсчета ячеек и расчета соответствующего коэффициента расщепления.
   2. Удалите среду за день до экспериментов, вымойте клетки на культурном блюде с 4 мл DPBS и добавьте свежие 5 мл среды клеточной культуры. Поместите блюдо горизонтально в инкубатор.
   3. Вымойте клетки с DPBS по крайней мере 0,5 ч до экспериментов и заменить 2 мл FBS свободной среде. Изучите слияние и морфологию клеток с помощью микроскопа.
3. Выполнение экспериментов в трех различных установках.
   1. Используйте чашку Петри для экспериментов, описанных в 4.2.3.
   2. Лечить клетки в течение 0,5 ч перед экспериментами с 10 мкм (я)-вераполил гидрохлорид.
   3. Добавьте в ДМСО 0,98 л раствора запасов верапамиля (20,4 мм) -верапамил гидрохлорид в ДМСО). Окончательное содержание DMSO составляет 0,05% во время лечения.
   4. Инкубировать клетки на 0,5 л с управлением транспортным средством (DMSO). Используйте тот же объем, что и для лечения препарата.
4. Эксперименты в режиме реального времени (для всех трех установк)
   1. Включите устройство, компьютер и убедитесь, что они правильно подключены, а затем открыть программное обеспечение управления.
   2. Выберите опцию One Target, разблокируйте шаблон и отрегулируйте следующие настройки:
      Количество позиций: 2 (два)
      Время обнаружения (сек): 3 (три)
      Время задержки обнаружения (ы): 2 (два)
      Название первого этапа: базовый
   3. Вставьте блюдо культуры клетки в наклонную поддержку прибора, убеждаясь что полюс клетки находится на нижней стороне и покрыно с средой культуры клетки.
   4. Запустите запуск с помощью кнопки «Пуск». Система просит сохранить файл. Выберите имя файла и путь сохранения. Центр управления всплывает и начинается базовое измерение (поддержка клеточной культуры начинает вращаться).
   5. Выберите по другим опциям:
      Шкала времени: минуты
      Коррекция нуклидов: углерод-11
   6. Проверьте все коробки под кривыми на графике (фон (красный), целевой (синий) и целевой минус фон (черный)).
   7. Получить параметры контроля качества: моляровская активность «GBq.»mol^-1» и концентрация активности »MBq.mL^-1» в конце синтеза.
   8. Рассчитайте соответствующий объем трассировщика на 15 нм от^natC'SNAP-7941 в объеме ассса 2 мл.
      
      
   9. Подготовьте пипетку к соответствующей объему и аликоту продукта No¹¹C'SNAP-7941 в свинцовой защите.
   10. Нажмите Пауза запустить в окне центра управления. Подождите, пока блюдо вращения останавливается и боковой бар с названием Приостановлено и следующий этап происходят.
   11. Откройте крышку кинетической устройства в режиме реального времени. Поверните культурный блюдо поддержки 90 "влево. Добавьте рассчитанный объем трассировщика и вернитесь к исходной позиции. Затем закройте крышку устройства. Немедленно нажмите кнопку «Продолжить» для начала эксперимента.
   12. Завершите эксперимент через 20 минут, выбрав паузу, а затем прекратите запуск (нажмите End Run в боковой панели).
5. Анализ и обработка данных с использованием статистического программного обеспечения
   1. Откройте программное обеспечение для управления в режиме реального времени. Нажмите на Открытые файлы, чтобы напомнить о требуемой кинетике. Кинетика иллюстрируется в окне центра управления.
   2. Выберите по правому щелчку прямо на кривыхэкспорта кинетики. Сохраните текстовый файл, содержащий необработанные данные. Откройте программу статистики и вставьте необработанный файл данных экспериментов в реальном времени.
   3. Начните со времени (x-оси) при добавлении радиотрака (исключите фоновое измерение) и нормализуйте до процентного сигнала максимального CPS (рассчитывает в секунду).
   4. Загрузите все нормализованные данные в новый файл GraphPad Prism.
   5. Рассчитать средние значения и стандартное отклонение.
   6. Проиллюстрировать полученные данные в виде графика, показывающего отклонение (скорость увеличения) поглощения трассировщика всех трех установленных исправления.

Результаты

Полностью автоматизированный радиосинтез^{No 11}C'SNAP-7941 дал 5,7 и 2,5 ГБК (4,6 и 2,0% в EOB, 14,9 и 5,9% на основе¹¹C'CH₃OTf; n - 10) сформулированного продукта. Общий синтез длился около 40 минут, где 15 мин были необходимы для подготовки^{No 11}C CH₃OTf с помощью метода газовой фазы, еще 5 мин были необходимы для радиомаркировки предшественника, а затем 10 мин полу-препаративного RP-HPLC очистки и 10 мин для c18 картридж твердой фазы извлечения и разработки. Затем, небольшой aliquot (приблизительно 100-200 QL) был доставлен к лицу, ответственному за контроль качества, в то время как оригинальный флакон продукта, содержащий готовый к использованию трассировщик был передан экспериментатору кинетический анализ в реальном времени.

Контроль качества был завершен в течение 10 минут после окончания синтеза. Моляровская активность была в диапазоне 72 и 41 ГБК/моль (н No 10), а радиохимическая чистота всегда была Все остальные параметры (рН, осмолность, остаточные растворители) соответствовали критериям выпуска. Для кинетической ассеии в режиме реального времени были выбраны три различных экспериментальных установки: (A) обработанные и необработанные (транспортные средства) клетки MDCKII-WT, (B) необработанные или обработанные клетками MDCKII-hMDR1 и (C) последней клеточной линией с блокированием до реального времени кинетическое асссис транспортера с использованием (я)-верапамил. Применение No¹¹C'SNAP-7941 к линии клеток дикого типа MDCKII-WT (P-gp non-expressing) и MDCKII-hMDR1 (P-gp expressing) показывает различное кинетическое поведение, так как происходит быстрое накопление линии клеток дикого типа, в то время как накопление не наблюдалось для клеток MDCKII-hMDR1. Тем не менее, блокирование P-gp efflux транспортер в MDCKII-hMDR1 клетки с (я)-verapamil привело к сопоставимым в режиме реального времени кинетические, как уже видели для линии клеток wildtype (Рисунок 5).

Рисунок 1: Обзор рабочего потока. Рабочий поток радиосинтеза, контроль качества и выполнение кинетической измерения в реальном времени^{No 11}C'SNAP-7941. Черные стрелки указывают транспортный путь радиоактивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Радиосинтетическая схема автоматизированного синтезатора. Переключение цепи автоматизированного синтезатора, начиная с блока циркуляции для^{No 11}C CH₃I /¹¹C CH₃OTf производства, реактора для внедрения деятельности в раствор прекурсора и SPE очистки (SPE твердая фаза извлечения; PCV - флакон для сбора продукции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Представительные хроматограммы полностью автоматизированного радиосинтеза^{No 11}C'SNAP-7841. Полупрепаративная хроматограмма RP-HPLC иллюстрируется в верхней и аналитической после очищения на дне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Подготовка блюда клеточной культуры для экспериментов в реальном времени. Шаг 1 включает в себя посев 2,5 х 10⁵ до 1 х 10⁶ в зависимости от типа ячейки и их темпов роста. Впоследствии, блюдо культуры помещается в косой плоскости (примерно 30-45 " ). Поэтому поставляемый металлический аппарат или крышка блюда клеточной культуры могут быть использованы в инкубаторе для стабилизации наклонного положения блюда. На следующий день после (24 ч) блюдо регулируется горизонтально, и свежая среда культуры клеток добавляется, чтобы полностью покрыть поверхность клетки. В день эксперимента исследуются жизнеспособность и слияние клеток. Согласно экспериментальному протоколу, клетки промывают dPBS, среда заменяется сывороточной средой (2 мл), а культурное блюдо перемещается в косое положение до начала экспериментов. Отныне клетки можно лечить с помощью ингибитора или транспортного средства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Кинетические измерения в реальном времени^{No 11}C'SNAP-7941. Представительная кинетика в реальном времени No¹¹C'SNAP-7941 показана в трех различных установках: с использованием клеток MDCKII-WT; Клетки MDCKII-hMDR1 предварительно блокируются с помощью (я)-вераполила в виде ингибитора P-gp и mdCKII-hMDR1 без блокировки. Оси y иллюстрирует скорость увеличения предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1 и WT по сравнению с результатами необработанных или обработанных транспортными средствами клеток MDCKII-MDR1, соответственно (без поглощения, 0%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Радиосинтез No¹¹C'SNAP-7941 был создан на коммерческом модуле синтеза. Благодаря возможности полной автоматизации процедуры приготовления радиосинтез был надежно надежен, и были достигнуты улучшения в области радиационной защиты оператора. Подготовка синтезатора оказывает огромное влияние на качество радиотрактора, особенно с точки зрения молярной активности. Таким образом, необходимо постоянно работать в инертных условиях (например, атмосфера гелия) и промывка всех линий, расположенных до реакционного сосуда (целевая линия, производственный цикл И реакторnoNo¹¹CCH₃I (см. рисунок2).). Кроме того, нагревание соответствующих ловушек и печей перед началом синтеза для удаления влаги и атмосферного углерода выгодно повышает активность моляров. Особенно столбец AgOTf, пропитанный графитным углем, чрезвычайно чувствителен к влажности. Даже незначительные количества любого источника влаги нарушают преобразование^{No 11}C'CH₃I в¹¹C'CH₃OTf. Перед началом синтеза ловушка^{No 11}C'CO₂ и ловушка^{No 11}C'CH₃I должны быть охлаждены до комнатной температуры снова, чтобы обеспечить последующее улавливание. Кроме того, рекомендуется растворить предшественник незадолго до начала синтеза и добавить основание непосредственно в раствор прекурсора.

Контроль качества радиочастот углерода-11 должен быть рационально разработан для непрерывного и быстрого рабочего процесса. Однако наиболее важными параметрами для исследований клеточной культуры являются радиохимическая чистота и моляровая активность для получения достоверных результатов. Правильная оценка молярной активности требует надежного аналитического метода HPLC, а кривая калибровки должна охватывать диапазон концентрации конечного продукта. Сложная часть для радиочастот заключается в достижении концентрации выше предела количественной оценки (ЛОЗ) за счет небольших количеств, которые производятся во время радиосинтеза. Таким образом, искусство заключается в том, чтобы найти баланс между высокой молярной деятельности, чтобы избежать насыщения рецепторов и достаточно высоких концентраций, чтобы все еще быть в состоянии количественно нерадиоактивного сигнала.

11^С. SNAP-7941 был подтвержден как мощный субстрат человека P-gp транспортер, как не было обнаружено накопления в необработанных или транспортных средств лечения MDCKII-hMDR1 клеток из-за быстрого efflux. В отличие от этого, оба экспериментальных установки (MDCKII-WT или предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1) дали аналогичные результаты (накопление¹¹C'SNAP-7941), поддерживая универсальность этого анализа in vitro. Клетки MDCKII-hMDR1 очень подходят для экспериментов LigandTracer из-за их стабильной трансфекции, быстрого роста и стойких против сдвига стресса, вызванного вращающейся клеточной культуры блюдо. Отсутствие поглощения¹¹C'SNAP-7941 в мозге крыс и мышей может, таким образом, произойти, вызванные efflux через P-gp транспортер. Из-за трансфекции клеток собачьих почек с человеческим мультинаркотической резистентностью белка 1 (hMDR-1, P-gp), прогностического значения этого метода для связывания транспортера эффлюкса у человека высока, что благоприятно с точки зрения будущего клинического применения. Однако до сих пор избирательность по отношению к другим транспортеру эффлюкса не была проверена. Таким образом, другие линии клеток могут быть использованы, выражая различные видные транспортеры efflux как белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP) или многократное сопротивление белка-1 (MRP-1), для изучения взаимодействия с этими транспортерами. Метод по сравнению с классическим накоплением или транспортным анализом очень прост и дает сразу качественные результаты. Кроме того, самым большим преимуществом является то, что эта технология позволяет оценивать прямое взаимодействие ПЭТ-трекера и цели в режиме реального времени, в отличие от обычного эксперимента с использованием косвенной количественной оценки (в основном смещения). Кроме того, программное обеспечение радиоассава в реальном времени обеспечивает экспериментальную гибкость (например, коррекция распада нуклидов, измерение времени и позиций и т.д.) и, следовательно, высокую свободу для пользователей. С другой стороны, ограничения метода включают низкую пропускную стоимость образца, так как одновременно можно измерить только одну клеточную тарелку. Кроме того, следует принять во внимание ряд других технических и оперативных вопросов: описанная технология очень чувствительна к фоновой радиации; таким образом, источники излучения должны храниться на расстоянии, и следует уделять особое внимание фоновым измерениям до проведения эксперимента. Другой вопрос, касающийся экспериментов при более высоких температурах, чем комнатная температура, является нагревание наклонной поддержки: испарение среды клеточной культуры может повлиять на детектор. Вместо нагрева, все устройство предпочтительно помещается в инкубатор. Кроме того, метод ограничен линиями клеток приверженцев. Через вращение тарелки культуры клетки, сдвига чувствительных к стрессу клетки могут отделиться от блюда, что может привести к недействительным результатам.

Тем не менее, если экспериментатор обращает внимание на эти незначительные недостатки, метод дает быстрые и надежные результаты для анализа кинетического поведения доклинических ПЭТ-трассеров.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Table 1: Перечень материалов и приборов для полностью автоматизированного радиосинтеза катализатора [11C]SNAP-7941
Ni	Shimadzu, Киото, Япония		Shimalilte Ni восстановленный, 80/100 меш
Йод	Merck, Дармштадт, Германия		1.04761.0100
Ацетонитрил	Merck, Дармштадт, Германия		для синтеза ДНК, < 10 ppm H2O
Ацетонитрил	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США		ВЭЖХ
ацетат аммония	марки Merck, Дармштадт, Германия
Уксусная кислота	Merck, Дармштадт, Германия		ледниковый
этанол	Merck, Дармштадт, Германия		96%
NaCl	B. Braun, Мельзунген, Германия		0,9%
Гидроксид тетрабутиламмония	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США
Метанол	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США		класса ВЭЖХ
	Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США		SepPak C18plus
Полупрепаративный RP-ВЭЖХ Колонка	Merck, Дармштадт, Германия		Хромолитовый полупрепарат RP-18e, 100-10 мм
Предколонка	Merck, Дармштадт, Германия		Chromolith Guard RP-18e, 5-4,6 мм
Прекурсор	Венский университет, Австрия		SNAP-кислотное
референтное соединение	Венский университет, Австрия		SNAP-7941
Трифторметансульфонат серебра	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США
Graphpa GC	Alltech, Дирфилд, Иллинойс, США		80/100 меш
ПЭТ трейс 860 циклотрон	GE Healthcare, Уппсала, Швеция
[11C]CO2 мишень высокого давления	Air Liquide, Вена, Австрия
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Уппсала, Швеция
N2 + 1% O2	Air Liquide, Вена, Австрия		Целевой газ
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Таблица 2: Перечень материалов и контрольно-измерительных приборов для контроля качества [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Вена, Австрия)		ВЭЖХ-насос
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Токио, Япония)		УФ-детектор
NaI-радиодетектор	Raytest (Штраубенхардт, Германия)		NaI-радиодетектор
хромолита Performance RP-18e, 100-4,6 мм	Merck (Дармштадт, Германия)	ВЭЖХ-колонка
430-GC	Bruker (Бремен, Германия)		Газовый хроматограф
Капиллярная колонка ID-BP20; 12 м x 0,22 мм x 0,25 мм	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Виктория, Австралия)		Газовый капилляр
Wesco, осмометр Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Вена, Австрия)		Осмометр
g-спектрометр			g-спектрометр
Программное обеспечение для управления газовой хроматографией	VARIAN (Пало-Альто, Калифорния, США)		Galaxie Version 1.9.302.952
Программное обеспечение для управления гамма-спектрометром	ORTEC (Оук-Ридж, Тенесси, США)		Maestro для windows Версия 6.06
Программное обеспечение для вызова гамма-спектра	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, США)		Winplots version 3.21
Программное обеспечение для управления ВЭЖХ	Raytest (Straubenhardt, Германия)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Германия)		pH-метр
Name	Company	Каталожный номер	Комментарии
Таблица 3: Список материалов и приборов для оценки кинетического поведения [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney Cell line (MDCKII-hMDR1)	Нидерландский институт рака (NKI, Амстердам, Нидерланды)		Экспрессия человеческого P-гликопротеина (hMDR1)
Клеточная линия собачьей почки Мадина-Дарби (MDCKII-WT)	Нидерландский институт рака (NKI, Амстердам, Нидерланды)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Вена, Австрия		Gibco 61965-026
Фетальная сыворотка теленка (FCS)	VWR International GmbH, Вена, Австрия		Gibco 10270-106
Пенициллин/стрептомицин	VWR International GmbH, Вена, Австрия		Gibco 15140
Чашка для клеточных культур	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия		Cellstar 100 мм x 20 мм, Mfr.No. 664160
in vitro эксперименты
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Вена, Австрия		Gibco 61965-026
(±)-Верапамила гидрохлорид	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)
ДМСО	Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)		276855-100 мл
Чашка для клеточных культур	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия		Cellstar 100 мм x 20 мм, Mfr.No. 664160
Стерильные одноразовые пластиковые пипетки	VWR International GmbH, Вена, Австрия		Стерилин, 5 мл – 25 mL
Стерильные наконечники для дозатора	VWR International GmbH, Вена, Австрия		Eppendorf epT.I.P.S. Биопур 20 &микро; L – 200 &микро; L
Колбы для клеточных культур	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия		Cellstar 250 мл, 75 см<суп>2 красная крышка фильтрующего фильтра, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Уппсала, Швеция.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Уппсала, Швеция.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Уппсала, Швеция.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Портативный автоматизированный счетчик ячеек	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Датчики счетчика ячеек	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 &микро; м (Cat.No. PHCC60050)