Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Контролируемая кортикальная модель воздействия мышечной травмы мозга с терапевтической трансплантацией индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронных клеток

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

10 июля 2019 г.

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует методологии для мыши модели открытой черепа черепа черепа черепа черепа черепа травмы головного мозга и трансплантации культивированных человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток в месте травмы. Поведенческие и гистологические тесты результатов этих процедур также описаны вкратце.

Аннотация

Травматическая черепно-мозговая травма (ТБИ) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Патология заболевания из-за TBI прогрессирует от первичного механического оскорбления к вторичным процессам травмы, включая апоптоз и воспаление. Моделирование животных было ценным в поисках, чтобы разгадать механизмы травмы и оценить потенциальные нейропротекторные терапии. Этот протокол описывает контролируемую корковую модель воздействия (CCI) фокусного, открытого TBI. В частности, описаны параметры для получения легкой односторонней корковой травмы. Поведенческие последствия ТПП анализируются с помощью теста на удаление клейкой ленты двусторонней сенсорной интеграции. Что касается экспериментальной терапии патологии TBI, этот протокол также иллюстрирует процесс трансплантации культивированных клеток в мозг. Нейронные клетки культур, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) были выбраны для их потенциал, чтобы показать превосходное функциональное восстановление в человека TBI пациентов. Хроническое выживание hiPSCs в ткани мозга мыши хозяина обнаруживается с помощью модифицированного иммуногистохимического процесса DAB.

Введение

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является общим термином для приобретенных травм головного мозга из-за либо косвенные механические силы (вращательное ускорение / замедление или контр-переворот) от ударов по голове или прямого повреждения от объектов или взрывных волн. TBI, по оценкам, является причиной примерно 9% всех случаев смерти во всем мире и наблюдается, по оценкам, 50 миллионов случаев в год1,2. В докладе, подготовленном Центрами по контролю и профилактике заболеваний за 2017 год, подсчитано, что в 2013 году в США было зарегистрировано в общей сложности 2,8 миллиона посещений больниц и смертей от ТБИ в США3. Многие более мягкие ТБи остаются незарегистрированными каждый год. Серьезные TBI может привести к пожизненному ухудшению познания, двигательной функции и общего качества жизни. Последствия мягкой TBI, особенно повторяющиеся связанные со спортом TBI, были только недавно оценили за их коварные последствия для здоровья4,5.

Доклиническое моделирование является жизненно важным компонентом разработки новых механистической идеи и потенциальной восстановительной терапии для TBI. Модель контролируемого воздействия коры (CCI) TBI представляет собой модель с открытой головой механической контузии коры головного мозга. Параметры удара могут быть изменены для получения травм CCI, которые варьируются от легкой до тяжелой6. CcI травмы являются координационными, а не диффузные, как видно с другими закрытыми моделями головы TBI. CCI может быть выполнена, чтобы вызвать одностороннюю травму, так что контралатеральная кора может служить в качестве внутреннего компаратора. Этот протокол демонстрирует характеристики мягкой CCI к части коры, которая охватывает первичные соматосенсорные и моторные области. Эта корковая область была выбрана для его участия в сенсорном поведении, для которых многочисленные тесты поведения могут обнаружить травмы индуцированных дефицитов7. Поведенческие улучшения в связи с терапевтическими вмешательствами для ТБИ могут быть обнаружены, а также.

Отличительной чертой TBI является широко распространенной нервной дисфункции в пострадавшем регионе. Поврежденные нейроны подвергаются клеточной смерти,а подключение нейронной сети нарушается 8,9. TBI нарушает набор эндогенных стволовых клеток, что приводит к дальнейшему вниз по течению дефицит поведения10,11.  Трансплантация нервных стволовых клеток и стволовых клеток, полученных из стволовых клеток, была изучена как возможность восстановления функции в поврежденном мозге. В дополнение к потенциалу для восстановления поврежденных нейронных схем, пересаженные клетки оказывают паракриновые эффекты, которые способствуют выживанию нейронов и функциональному восстановлению от TBI12. Различные типы клеток были пересажены доклинически для оценки их восстановительного потенциала в моделях неврологических расстройств13,14,15. Недавняя популяризация индуцированной технологии стволовых клеток16 способствовала развитию многочисленных линий стволовых клеток человека для экспериментального использования. Доклиническое тестирование с клетками, полученными из hiPSC, является важным первым шагом к характеристике потенциальной терапевтической эффективности данной клеточной линии против болезней человека. Эта лаборатория разработала протоколы для дифференциации hiPSCs к нервным фенотипам17 в погоне за трансплантируемыми клетками, чтобы помочь восстановлению после черепно-мозговой травмы.

Эксперименты в этом протоколе использовать односторонний CCI, чтобы побудить TBI к левой соматосенсорной и моторной коры взрослых мышей. Мягкая травма CCI приводит к устойчивому функциональному дефициту в правой передней лапе, который используется для отслеживания последствий hiPSC полученных нейронных клеток прививок на функциональное восстановление. Испытание датчика Forepaw в этом протоколе было адаптировано из методологии, установленной Bouet и коллегами18 и продемонстрировано ранее Флемингом и коллегами19.  Этот протокол описывает полный рабочий процесс для выполнения экспериментальной черепно-мозговой травмы, терапевтическая трансплантация клеток HIPS, а также поведенческий и гистологический анализ экспериментальных показателей исхода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, описанные в этом протоколе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию при едином университете.

1. Краниэктомия и контролируемое корково-воздействие

  1. Подготовка контролируемого коркового ударного устройства и хирургических принадлежностей.
    1. Загрузите 1 мл слип-наконечник шприц с 0,5 мл стерильного солевого раствора для орошения ран. Прикрепите 25 G иглу к шприцу для контроля орошения.
    2. Приготовьте разбавленный раствор CSA в DMSO до конечной концентрации 1 мг/мл. Загрузите второй шприц с лип-наконечником 1 мл с 0,5 мл циклоспорина A (CsA) раствор для иммуносупрессии. Прикрепите 25 G иглу или больше к шприцу CsA.
    3. Прикрепите контролируемый кортикальный поршень удара к руке на стереотаксической раме и установите под углом 15 ". Прикрепите 3-мм ударный зонд к поршню.
    4. Установите скорость удара до 1,5 м/с, а время удара - 0,1 с, чтобы произвести легкую корковую травму.
  2. Выполните одностороннюю краниэктомию
    1. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии, соединенную с изофрурановым испарителем со сжатым источником кислорода. Индуцировать анестезию с изофлураном в размере 3%, при кислороде 0,7 л/мин. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на нос-щепотка.
    2. Бритькожу кожу головы с помощью электрических клиперов и стереть любой свободный мех.
    3. Поместите мышь в стереотаксической раме с прикрепленным анестезией доставки носовой конус.
      1. Поместите согревающую площадку, установленную до 37 градусов по Цельсию, на стереотаксической раме под мышью для поддержания температуры тела под наркозом. Закрепите голову на месте с ушными прутьями и баром укуса и сориентируйте голову так, чтобы лобная кость черепа была горизонтальной. Поддержание анестезии на уровне 1,5%-2% изолюран на протяжении всего операции.
    4. Для выполнения предоперационного ухода и асептического хирургического препарата нанесите антибиотикоо-офтальмона на глаза с помощью стерильного ватного тампона. Нанесите раствор на основе йода на бритую область кожи головы. Удалите это с 70% этанола. Обложка животное с fenestrated хирургической драпировки так, что верхняя часть головы видна, но глаза покрыты.
    5. Сделайте разрез средней линии (1,5-2 см) на коже головы с помощью скальпеля или ножниц.  Используйте стерильные ватные тампоны, чтобы очистить рану и очистить фасцию слева от средней линии на bregma.
    6. Используйте зонд удара для идентификации участка краниэктомии.
      1. Установите стереотаксическая точка отсчета (X - 0, Y - 0) на bregma.  Отрегулируйте зонд боковой до 2 мм слева от средней линии. Очертите круг диаметром 5 мм вокруг зонда, используя тонкий наконечник хирургически безопасный маркер. Поднимите и поверните ударог из положения.
    7. Используйте высокоскоростной роторный микромоторный набор ручной инструмент, чтобы сделать открытое отверстие в черепе, используя круглые кончик0,6 мм или 0,8 мм заусенца сверло бит на 70%-80% максимальной скорости. Применить легкое давление на череп во время бурения вдоль 5 мм окружной контур, чтобы разредить эту границу.
      1. Не применяйте избыточное давление при бурении. Это может привести к повреждению корковой коры из-за вибрации, сжатия или случайного проникновения. Разрешить скорость сверла бит, чтобы сделать работу.
      2. Не сверлите в любом месте слишком долго, чтобы избежать избыточного трения нагрева черепа. Орошать краниэктомии иногда стерильной сольник для удаления мусора и уменьшить нагрева от роторного инструмента.
      3. Обратите пристальное внимание во время бурения над корональной линией шва, так как эти точки уязвимы для кровоизлияния.
    8. Используйте пару тонких пинцетов, чтобы удалить лоскут черепа, когда контур краниэктомии достаточно истончен. Возьмитесь за лоскут медиально, и осторожно поднимите и потяните боковое движение с радиальным движением.
      1. Не повредить dura mater при подъеме лоскута; это может привести к тяжелым травмам и кровоизлиянию.
  3. Выполните легкую контролируемую травму коркового удара
    1. Очистите зонд удара с помощью стерильной подготовительной прокладки алкоголя. Переместите зонд удара обратно в положение над открытой корой. Опустите зонд до тех пор, пока он не коснется поверхности dura mater. Отметьте эту позицию как No 0.
    2. Снимите поршень и перейдите на -1,0 мм. Разгрузите поршень, чтобы воздействовать на кору.
    3. Быстро поднимите поршень и выдвините руку из положения. Нанесите щедрое количество сольнца для орошения коры головного мозга после травмы. Промыть место операции с сольнием по мере необходимости и шов разрез кожи головы с помощью простых прерванных stiches с 5.0 шелковый шов.
  4. Выполните послеоперационный уход на мышке
    1. Прекратите анестезию. Доставка CSA путем подкожной инъекции в потертости в 10 мг/кг дозы. Поместите мышь в чистую и предварительно разогретую послеоперационную клетку.
    2. Обеспечить ацетаминофен анальгетик в питьевой воде на 1,0 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить обезболивание в соответствии с соответствующей стандартной операционной процедурой IACUC и с учетом экспериментальных переменных результатов (например, седав, нейровоспаление).
    3. Обеспечить увлажненные чау-пищу в разогретой клетке восстановления, чтобы помочь в регидратации и восстановления.
  5. Приступить от раздела 2 до раздела 4 выше при выполнении краниэктомии только (фиктивный) управления.

2. Стереотаксическая трансплантация клеточной суспензии

  1. Начните процедуру трансплантации клеток примерно 24 ч после краниэктомии.
  2. Подготовка оборудования для трансплантации клеток и хирургических принадлежностей
    1. Заполните 1 мл скольжения наконечник шприц с стерильным сольнием для орошения ран. Прикрепите 25 G иглу к шприцу для контроля орошения.
    2. Заполните 1 мл скольжения наконечник шприц с csA решение для иммуносупрессии. Прикрепите 25 G иглу или больше к шприцу CsA. Пополнить csA шприц по мере необходимости между операциями.
    3. Приготовьте стеклянные иглы из 1,0 мм OD borosilicate стеклянных капиллярных пипетков с использованием стандартных методов.
    4. Используйте тонкие пинцеты, чтобы сломать иглы советы примерно 200 мкм диаметром. Убедитесь, что цилиндрический вал иглы не превышает 2,5 см.
  3. Калибровать шприц для использования с 10 л шприца.  Введите скорость потока 0,2 л/мин, чтобы обеспечить общий объем 2,0 л.
  4. Подготовка человека индуцированной плюрипотентной стволовых клеток (iPSC) суспензии.
    1. Выполните все обработки клеток в клеточной культуре BSL-2 капот с использованием стандартных методов стерильной обработки.
    2. Подготовьте клеточные культуры заранее в соответствии со стандартными условиями, определенными для типа клетки. В качестве примера можно назвать Lischka et al.17.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, показанные в этой демонстрации, использовали различные нейронные клетки фенотипа, полученные из hiPSCs.
    3. Аккуратно разъединяют клетки в одноклеточную подвеску с помощью раствора отслоения клеток или других предпочтительных ферментативных или химических средств.
    4. Подсчитайте клетки в подвеске, затем разбавьте суспензию до 5 х 104 ячеек/ЗЛ в среде минимальной клеточной культуры (например, DMEM) в пробирке с альпли.м.
    5. Обратите внимание на следующие заметки для трансплантации:
      1. Поддерживайте клетки в суспензии при 37 градусах По Цельсию в течение всего срока проведения процедур.
      2. Загрузите шприц только непосредственно перед выполнением интрапланхимальной инъекции (шаг 4,5 ниже).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гравитация может привести к суспензии клетки, чтобы урегулировать или цепляться за сторону шприца, если положил на его стороне. Это приводит к нарушениям в количестве вводимых клеток.
      3. Выделяй 5 х 105 клеток (10 л суспензии) на мышь при выполнении нескольких процедур трансплантации клеток в один день.
  5. Выполните стереотаксическую трансплантационную операцию
    1. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии, соединенную с изофрурановым испарителем со сжатым источником кислорода. Индуцировать анестезию с изофлураном в размере 3%, при кислороде 0,7 л/мин.
    2. Поместите мышь в стереотаксической раме с прикрепленным анестезируемым носовым конусом.
      1. Закрепите голову на месте с ушными прутьями и баром укуса и сориентируйте голову так, чтобы лобная кость черепа была горизонтальной. Поддержание анестезии на уровне 1,5%-2% изолюран на протяжении всего операции.
    3. Выполнение предоперационного ухода и асептического препарата
      1. Нанесите увлажняющий офтальмент, содержащий антибиотик, на глаза с помощью ватного тампона.
      2. Lavage разрез аусс с стерильным сольников для очистки сайта и ослабить швы. Аккуратно нанесите 70% этанола ватным тампоном для стерилизации места разреза.
    4. Удалите швы с помощью тонкого пинцета и офтальмологических ножниц. Орошать место хирургии и краниэктомии с обильным стерильным сольником.
      1. Рассмотрим животное для исключения, если кора показывает дисквалификационные характеристики, включая чрезмерное грыжу, обесцвечивание, нарушение васкуляризации, или кровоизлияние.
    5. Загрузите шприц для пересадки клеток
      1. Переместите суспензию клеток из инкубатора 37 градусов по Цельсию в капюшон биобезопасности клеточной культуры. Аккуратно закружите или коснитесь трубки, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток.
      2. Используйте микропипеттор для загрузки 7,5 л подвески клеток в шприц Гамильтона через конец поршеня.
        1. Держите шприц под углом 120 евро с концом поршеня вниз. Вставьте поршень, заботясь, чтобы не ввести пузырь воздуха между подвеской и поршень кончик.
      3. Прикрепите сборку прокладки к игле пипетки, а затем прикрепите иглу к шприцу.
      4. Нажмите поршень, чтобы переместить подвеску клетки в пипетку иглу.  Если есть сопротивление оттоку подвески, используйте тонкие пинцеты, чтобы сломать кончик иглы, чтобы увеличить диаметр.
    6. Прикрепите шприц к стереотаксическому шприцу.  Предварительный поршень, чтобы убедиться, что сборка шприца насос работает должным образом.
    7. Переместите иглу в координаты для инъекций.
      1. Выровнять кончик иглы с bregma. Установите координаты X и Y до 0. Затем переместите кончик иглы над краниэктомией до 2,0 мм боковой и -1,0 мм задней в брегму.  Прикоснитесь к кончику иглы на поверхность dura mater и установите стереотаксические координаты на 0.
      2. Нажмите поршень, чтобы обеспечить суспензию клетки течет адекватно перед введением иглы в мозг.
      3. Введите иглу в мозг на глубину -1,4 мм. Эти стереотаксические координаты место трансплантата на серое вещество-белое вещество границы глубокой коры20.
    8. Запустите шприц насос для наполнить подвески ячейки. Установите таймер скамейки лаборатории до 15 минут и запустите таймер. Используйте большой рабочий междугородний микроскоп для мониторинга оттока клеточной подвески.
      1. Орошайте место операции стерильным сольнием во время инъекций для поддержания гидратации тканей.
      2. На 15 мин, медленно снять иглы трансплантации.  Орошаем место операции сольным раствором и закройте разрез швами.
    9. Выполнение послеоперационного ухода
      1. Прекратите анестезию. Доставка CSA путем подкожной инъекции в потертости в 10 мг/кг дозы. Поместите мышь в чистую и предварительно разогретую послеоперационную клетку.
      2. Обеспечить ацетаминофен анальгетик в питьевой воде на 1,0 мг/мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить обезболивающее в соответствии с соответствующим стандартным операционным протоколом IACUC (SOP) и с учетом экспериментальных переменных результатов.
      3. Обеспечить увлажненные чау пищи восстановления клетке, чтобы помочь в регидратации и восстановления.
  6. Продолжайте ежедневные инъекции CSA при 10 мг/кг на протяжении всей продолжительности выживаемости мыши.

3. Тест удаления клейкой ленты сенсомоторной интеграции

  1. Разрежьте электрическую ленту на 3 мм х 5 мм полоски с помощью небольшого бритвемного ножа до выполнения теста поведения. Используйте гладкую стеклянную поверхность для резки клеевых полосок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте желтую и волокиту, так как мышам трудно различать эти цвета21.
    1. Выберите небольшое зеркало, которое хорошо вписывается в прозрачная пластиковая коробка.
      1. Исправьте зеркало на месте под углом примерно 45 градусов с помощью глины или клейкой ленты для просмотра поведения животных снизу.
    2. Поместите коробку и зеркальную сборку на скамейку в тихом специальном зале для тестирования поведения.  Расположите цилиндр на пластиковой коробке над зеркалом.
    3. Упорядочить обработки ткани, пинцет, и клея полосы на скамейке рядом с поведением тестирования поле.
    4. Очистите коробку и цилиндр с 70% этанола и бумажных полотенец.  Дайте поверхностям тщательно высохнуть.
    5. Принесите мышей в комнату для тестирования поведения. Разрешить мышам акклиматизироваться в испытательном зале, по крайней мере 30 минут до тестирования поведения.
    6. Удалить водоснабжение из клеток, чтобы свести к минимуму мочеиспускания событий во время тестирования, которые могут помешать эффективной производительности испытаний.
  2. Выполните тест на удаление клея
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест поведения лучше всего выполняется двумя-тремя следователями: один для работы секундомеров, и один или два для обработки мышей и наблюдать за поведением.
    1. Используйте каждый пинцет, чтобы очистить одну клейку полосы каждого цвета.
      1. Выберите, какой цвет полосы соответствует какой передний лапы и остаются последовательными на протяжении всего судебного разбирательства.
    2. Используйте обработку ткани, чтобы сдержать мышь по шерсти шеи и спины так, что мышь держит передние лапы от его тела и головы.
    3. Используйте пинцет, чтобы поместить клей полосы на подошвенной поверхности каждого переднего лапы. Используйте деликатное и последовательное давление пальца, чтобы закрепить полоски к лапам.
    4. Быстро поместите мышь в пластиковый цилиндр. Начните два секундомеры, когда мышь имеет все четыре лапы на пластиковой коробке.
    5. Используйте два секундомеры для записи опозданий для следующих четырех событий: левая лапа уведомления, удаление левой лапы, правая лапа уведомления, правая лапа удаления.
      1. Запись уведомления событие, когда животное делает однозначное признание клей полосы, встряхивая или вздрагивая лапу или кусать полосу.
      2. Запись удалить событие, когда животное эффективно удаляет полосу с поверхности подошвы переднего лапы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Событие удаления не дисквалифицируется по полосе readherence или если полоса цепляется за боковую поверхность переднего лапы.
      3. Остановите таймер на 120 с, если соответствующая полоса не была удалена.
      4. Запись прошедшего времени для четырех событий в листе данных.
    6. Выполните второе испытание на каждой мыши
      1. Разрешить как минимум 5 минут, чтобы проходить между испытаниями для отдельных мышей, чтобы уменьшить стресс, который может помешать эффективной работы на тесте.
      2. Очистите аппарат бумажными полотенцами между тестированием мышей, чтобы удалить отходы при тестировании нескольких мышей из одной клетки.
        1. Тщательно очистите аппарат 70% этанола и бумажных полотенец при тестировании мышей из нескольких клеток.
      3. Обратный цвет-лапа размещения порядка для второго испытания сессии рандомизировать любой эффект цвета.
    7. Рассчитайте среднюю задержку каждого события между двумя испытаниями в день для каждого животного.
  3. Очистите аппарат и обработки ткани тщательно с водой, заменить клетку водоснабжения, и вернуть мышей в их удерживании объекта.
  4. Повторите шаги 3.1-3.2 на последовательных экспериментальных тайм-пойнтах для повторного пробного проектирования мер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 3.2.1-3.2.5.3 ежедневно в течение 5 дней до сбора данных, чтобы акклиматизировать животных к задаче. Рекомендуется получение базовых данных до операции.

4. Диаминобензидин (DAB) иммуногистохимический анализ выживания трансплантата и патологии травмы

  1. Эвтанизировать животных и выполнять транскардиальный перфузии.
    1. Подготовьте растворы 0,1 М фосфатно-буферизированного солей (PBS) и 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Сбалансируйте рН обоих растворов до 7,4.
    2. Поместите два раствора на льду в дымовой капот. Поместите перистальтический насос в капот дыма, и запустить насос, чтобы заполнить трубки с PBS. Установите скорость потока насоса до 7 мл/мин.  Подключите иглу 25 G к трубе оттока насоса.
    3. Поместите дренажный лоток с мягким субстратом в капоте. Поднимите один конец лотка под небольшим углом, чтобы перфузионные жидкости стекали до нижнего конца.
    4. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии. Заполните камеру с 4% изолюран с использованием сжатого 100% кислорода транспортного средства газа.
    5. Переместите анестезирующую мышь из камеры в конус носа для анестезии. Снижение изолюрани до 2%.
    6. Выполните торакотомию, чтобы разоблачить сердце. Прекратите анестезию, так как торакотомия вызывает эвтаназию.
    7. Аккуратно поместите перфузионный насос оттока иглы в левом желудочке вдоль длинной оси сердца. Не прокалывайте перегородку сердца, так как это вызовет плохое перфузию.
    8. Используйте небольшие ножницы, чтобы вырезать правое предсердие, а затем сразу же включить перистальтический насос.
    9. Продолжайте поток PBS до тех пор, пока жидкость, оставляя правое предсердие проходит из крови.
      1. Выключи насос. Переместите трубку для ввоза насоса в контейнер PFA. Перезапустите насос. Продолжайте проникать PFA до тех пор, пока животное не будет достаточно жестким или до тех пор, пока объем 20 мл не будет прокачан.
      2. Выключи насос. Удалите иглу оттока из сердца. Переместите входе трубки из PFA в PBS, и тщательно промыть PFA из труб.
  2. Удалить мозг из черепа путем тщательного вскрытия. Поместите мозг в небольшой контейнер, наполненный 4% параформальдегида, и позволить мозгу после фиксации ночь на 4 градуса По Цельсию.
  3. На следующий день после фиксации, заменить P с PBS и 0,1% азидея натрия. Храните мозги в этом растворе до подготовки к гистологическому сечению.
  4. Соберите 40-50 мкм участков формальдегида фиксированной ткани мозга с помощью замораживания микротома или вибратом комнатной температуры.
  5. Предварительное лечение тканей в 0,3% перекиси водорода в воде, чтобы инактивировать эндогенные перекисты, которые могут производить неспецифические окрашивания.
  6. Выполняйте извлечение антигена с использованием лимонной кислоты буфера (10 мМ цитрат натрия, 0,05% полисорбат-20, рН 6,0) при 60 градусах По цельсии в течение 30 мин.
  7. Выполняйте маркировку антител стандартными методами.  Обратитесь к Lundell и др.' s доклад22 из этой лаборатории для получения более подробной информации.
    1. Используйте набор нейтрализации мыши IgG (см. Таблицаматериалов), чтобы уменьшить поперечную реактивность с эндогенными антителами. Инкубировать ткани в буфере нейтрализации IgG не менее 1 ч при комнатной температуре (RT), следуя указаниям производителя.
    2. Используйте мышь анти-человеческого ядерного антигена первичного антитела (hNA; 1:500 разбавления) при пересадке человеческих клеток, полученных iPSC, чтобы найти пересаженные клетки. Инкубировать ткани с первичным антителом при 4 градусах по Цельсию 48-72 ч с помощью нежного возбуждения.
    3. После промывки первичного раствора антитела, инкубировать ткани с HRP-конъюгированных анти-мышь вторичных антител в 1:250 разбавления в течение 2 ч на RT.
    4. Выполните реакцию DAB хромогена стандартными методами для выявления иммуномаркировки. Разрешить DAB реакции развиваться в течение 5 до 10 минут на RT.
  8. Прикрепите окрашенные ткани к слайдам и нанесите крышку скользит с помощью стандартных методов.
  9. Количественная оценка числа помеченных клеток с использованием беспристрастной стереологии, как описано ранее23,24. Выполните анализ с использованием 20 мкм оптических секций и между интервалом раздела из трех.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Craniectomy хирургии облегчает экспериментальную черепно-мозговую травму и терапевтической трансплантации клеток: контролируемые корковой модели воздействия черепа и последующей трансплантации клеток терапии требуют тщательного удаления надлежащего черепа. Краниэктомия может быть выполнена на любой донской поверхности черепа, чтобы позволить манипуляции в области мозга, представляющих интерес. Диаграмма на рисунке 1 изображает схему краниэктомии диаметром 5 мм, чтобы раскрыт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мягкая CCI как модельная система для тестирования экспериментальной регенеративной терапии
Модель CCI является ценным инструментом для исследования механизмов дисфункции тканей после механической травмы коры головного мозга. Настройка параметров травмы является привлекательной особенностью этой модели. Изменение глубины воздействия, скорость, или время пребывания может увеличить или уменьшить тяжесть травмы по желанию следователя10,25. Мягкая ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом От Центра неврологии и регенеративной медицины (CNRM, номер гранта G170244014). Мы высоко ценим помощь Махима Деван и Клары Сельбреде в экспериментальных исследованиях удаления клея. Кристина Радомски провела предварительную черепно-мозговую травму и операцию по пересадке клеток. Аманда Фу и Лора Такер (Amanda Fu) из основной лаборатории доклинических исследований CNRM сша предоставили ценные советы по операциям на животных и тестированию поведения, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприцы 1 млBecton Dickinson (BD) 
1,7 мл пробирки с откидной крышкойDenvilleC2170
10 мкл шприцHamilton7635-01
25G Precision Glide шприциглы Becton Dickinson (BD) 
70% этанолПродукт выбора; варьируется в зависимости от региона
ацетаминофен пероральная суспензияТайленол (детский)Разведите до 1 мг/мл в водном
анестетике ИспарительVetland521-11-22
для работы с животнымиКупить в универмаге
BetadinePurdue ПродукцияNDC-67618-151-32
сжатый кислородПродукт выбора; варьируется в зависимости от региона
циклоспорин АSigma-Aldrich30024-100 мг
DAB набор для окрашиванияVector LaboratoriesSK-4100
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD8418-500ml
DMEM Invitrogen (ThermoFisher)A14430-01
donkey антимышиный антитела IgG, HRP конъюгированныеImmunoResearch715-035-151
изолента3M CorporationПокупка в универмаге
тонкий пинцетFine Science Tools11254-20
щипцыFine Science Tools91106-12
стеклянные капиллярные пипетки, 1 мм OD, 0,58 мм IDWorld Precision Instruments1B100F-3
Комплект высокоскоростных роторных микромоторовForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
Идеальное микросверло Набор заусенцев из 5точек ячеек Научный 60-1000
Impact One для CCI Leica Biosystems39463920
изофлуранаBaxterNDC-10019-360-60
лабораторный настольный таймерыFisher Scientific14-649-17
МикропипеткаPuller MicroData Instruments, Inc.PMP-102Любой пуллер будет достаточным
Чехолки для микроскопа Чехлы для микроскопаFisherbrand12-545-E Средство
для крепления предметного стекла Средстводля крепления предмета Продукт
выбора зеркало Покупкав универмаге
мышь античеловеческий ядерный антиген антителоMilliporeMAB1281
Мышь на мыши Набор для блокировкиVector ЛабораторииБМК-2202
иглодержатель гемостатFine Science Tools12002-12
офтальмологическая мазьFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
офтальмологические пружинные ножницыFine Science Tools15018-10
пластиковая коробкаКупить в универмаге
пластиковый цилиндрПокупка в универмаге
QSI моторизованный шприцевой насосStoelting53311
Съемный игольчатый компрессионный фитингHamilton55750-01
маленький грызун стереотаксическая рамкаStoelting51925
маленькие ножницыFine Science Tools14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)
Стерильные спиртовые салфетки для приготовления спиртаFisherbrand06-669-62
стерильные ватные палочки/ватные палочки Kendall Q-tipsTyco Healthcare540500
Стерильный физиологический растворHospiraNDC-0409-1966-07
Секундомеры (2)Fisher Scientific06-662-56
Superfrost Plus Gold микроскоп слайдыFisherbrand15-188-48
шовные нити - шелк 5.0 с изогнутой иглойOasisMV-682
309659305122ткань Jackson Стереотаксический импактор A1110501

Ссылки

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280(2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142(2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Контролируемая кортикальная модель воздействия мышечной травмы мозга с терапевтической трансплантацией индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.