Изучение динамики органелл в В-клетках во время формирования иммунного синапса

B лимфоциты являются неотъемлемой частью адаптивной иммунной системы, ответственной за выработку антител против различных угроз и вторжения патогенов. Эффективность производства антител определяется способностью В-клеток приобретать, обрабатывать и представлять антигены, встречающиесялибо в растворимой или поверхностной форме 1,². Распознавание антигенов, прикрепленных к поверхности клетки представления, БКР, приводит к образованию близкого межклеточного контакта под видом IS^3,4. В рамках этой динамической платформы происходит как BCR-зависимых вниз по течению сигнализации и интернализации антигенов в эндо-лизосомы отсеков происходит. Убранные антигены обрабатываются и собираются на молекулы MHC-II и впоследствии подаются Т-лимфоцитам. Продуктивные B-T взаимодействия, называемые B-T-клеток сотрудничества, позволяют B лимфоцитов для получения соответствующих сигналов, которые способствуют их дифференциации в антитела производства плазматических клеток или клеток памяти⁸.

Два механизма были вовлечены в экстракцию антигена в клетках В. Первый опирается на секрецию протеаз, происходящих из лизосом, которые подвергаются набору и слиянию при синаптической расщелине^5,6. Второй, зависит от Миозина IIA-опосредованных сил, что вызывает вагинацию антигена, содержащего мембраны, которые интернализированы в clathrin покрытием ямы⁷. Режим экстракции антигена зависит от физических свойств мембраны, в которой находятся антигены. Тем не менее, в обоих случаях, В клетки проходят два основных события реконструкции: актиновый цитоскелет реорганизации и поляризации органелл в IS. Actin цитоскелет ремоделирования включает в себя начальную стадию распространения, где актин-зависимых выступов в синаптической мембраны увеличить поверхность в контакте с антигеном. За этим следует фаза сокращения, где BCRs в сочетании с антигенами сосредоточены в центре ИС с согласованным действием молекулярных двигателей и актина цитоскелет ремоделирования^{8,9,10, 11}. Поляризация органелл также опирается на ремоделирование актина цитоскелета. Например, центросома становится отсоединена от ядра, путем локальной деполимеризации ассоциированного актина, что позволяет перепозиционировать эту органель в^{IS 5,12}. В В-клетки, перепозиционирование центросомы на один полюс клетки (IS) направляет лизосомы вербовки в синаптической мембраны, которая при секреции может облегчить добычу и / или обработки поверхностных антигенов⁶. Лисососомы, завербованные в ИГ, обогащаются MHC-II, что способствует образованию пептидных комплексов MHC-II в эндосомальных отсеках, которые будут представлены Т-клеткам^13. Кроме того, было отмечено, что аппарат Голги был тесно завербован в^{IS 14,}предполагая, что пузырьки, полученные голги из секреторного пути, могут быть вовлечены в добычу антигена и/или обработку.

В целом, внутриклеточные органеллы и цитоскелетные перестановки в В-клетках во время формирования синапсов являются ключевыми шагами, которые позволяют эффективное приобретение и обработку антигена, необходимые для их дальнейшей активации. В этой работе мы вводим подробные протоколы о том, как выполнять визуализацию и биохимический анализ в В-клетках для изучения внутриклеточной ремоделирования органелл, связанных с образованием ИС. Эти методы включают: i) иммунофлуоресценцию и анализ изображений В-клеток, активированных с антигеном покрытием бусины и на антиген-покрытие крышки, что позволяет визуализации и количественной внутриклеточной компоненты, которые мобилизованы в ИС и (ii ) изоляция обогащенных центросомой фракций в В-клетках путем ультрацентрифугирования на градиентах сахарозы, что позволяет выявлять белки, связанные с центросомой, потенциально участвующих в регулировании полярности клеток.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с использованием ячеек IIA1.6 B.

1. Активация клеток B с бусинами с антигенным покрытием

1. Приготовление бусинсев с антигенным покрытием
   1. Для активации В-клеток используйте NH₂-бусы ковалентно покрытые антигеном (Ag-покрытием шарики), которые готовятся с использованием 50 qL (20 х 10⁶ шариков) из 3 мкм NH₂-бусы с активацией (BCR-ligand) или неактивирующие (BCR-ligand-) антигены.
   2. Для IIA1.6 B клетки используют анти-IgG-F (ab')₂ фрагмента как BCR-лиганде и anti-IgM-F (ab')₂ или бычьего сыворотки альбумина (BSA) как BCR-ligand-. Для активации первичных В-клеток или линии клеток IgM^и B используйте anti-IgM-F (ab')₂ в качестве BCR-лиганд и BSA как BCR-лиганд-.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать связывания лигандов с рецептором FC, используйте F (ab') или F (ab')₂ антитела фрагментов вместо полнометражных антител.
   3. Чтобы продолжить подготовку Ag покрытием бисера, поместите бисер в низкобелковых связывания микроцентрифуговых труб, чтобы максимизировать восстановление бисера во время манипуляции образца. Добавьте 1 мл 1x фосфат-буферизированного сосудистого раствора (PBS) для мытья бисера и центрифуги при 16 000 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант.
   4. Отрежируйте бусинки с 500 qL 8% глютаральдегида, чтобы активировать NH₂ групп ы и повернуть в течение 4 ч при комнатной температуре (RT).
      ВНИМАНИЕ: Раствор запасов глютаральдегида должен использоваться только в химическом капоте дыма. Следуйте инструкциям на листе данных о безопасности материалов (MSDS).
   5. Центрифуга бисер а 16000 х г в течение 5 мин, удалить глютаральдегид и мыть бисер еще три раза с 1 мл 1x PBS.
      ВНИМАНИЕ: Раствор глютаральдегида следует отбрасывать как опасные химические отходы.
   6. Отрежь активированные бусинки в 100 л 1x PBS. Образец можно разделить на две низкобелковые связывающие микроцентрифуги: 50 л для BCR-лиганд и 50 л для BCR-ligand-.
   7. Для подготовки антигенного раствора используйте две 2 мл низкобелковых связывающих микроцентрифуговых трубок, содержащих 100 мкг/мл антигенного раствора в 150 л ПБС: Одна трубка с BCR-лиганди и другая с BCR-ligand-.
   8. Добавьте 50 qL активированного раствора бисера к каждой трубке, содержащей 150 злитрологового раствора антигена, вихря и поверните на ночь при 4 градусах Цельсия.
   9. Добавьте 500 л из 10 мг/мл BSA, чтобы блокировать оставшиеся реактивные группы NH₂ на бисере и вращаться в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия.
   10. Centrifuge бисер на 16000 х г в течение 5 мин при 4 кв и удалить супернатант. Вымойте бисер с холодной 1x PBS еще три раза.
   11. Приостанавливай активированные бусы в 70 л 1x PBS.
   12. Чтобы определить конечную концентрацию бусин с покрытием Ag, разбавьте небольшой объем шариков в PBS (1:200) и отчислите с помощью гемоситометра. Затем храните при 4 градусах По цельсию до использования.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Бусы с ag покрытием не должны храниться более 1 месяца.
2. Приготовление поли-Л-лизиновых чехлов
   1. Перед активацией B-клеток проинсаживать с ag-покрытием шарики, приготовьте поли-L-лизин-покрытие покрытые крышки (PLL-coverslips). Используйте трубку диаметром 50 мл, содержащую 40 мл 0,01% ват/в раствора PLL, и погрузите в раствор крышки диаметром 12 мм. Поверните на ночь на RT.
   2. Вымойте крышки с 1x PBS и оставить высохнуть на 24-хорошо крышкой пластины покрыты парафина пленкой. Продолжить активацию B-клеток.
3. Активация В-клеток
   1. Чтобы начать активацию B-клеток с бисером, сначала разбавить линию icA1.6 B ячейки до 1,5 х 10⁶ ячеек/мл в среде CLICK (RPMI-1640 дополнен 2 мМ L-Аланин-L-Глютамин стрептомицин) - 5% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
   2. Объедините 100 кЛ (150 000 ячеек) ячеек IIA1.6 B с бисером с покрытием Ag в соотношении 1:1 в трубках 0,6 мл. Смешайте осторожно, используя вихрь и семена на PLL-крышки. Инкубировать для различных точек времени в инкубаторе клеточнойкультуры (37 кв/5% CO 2). Типичные точки активации времени 0, 30, 60 и 120 мин. На время 0, поместите PLL-крышки в 24-хорошо пластины крышкой на льду. Добавьте смесь из бисины с покрытием, атакжемированную агитированным, и насигите в течение 5 мин на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно смешивать вихрем, а не пипетка вверх и вниз, потому что это может уменьшить количество шариков в образце, из-за их накопления в пластиковой кончике пипетки. Используйте бусы с покрытием BCR-лиганд- в качестве отрицательного контроля для каждого асссе. Мы рекомендуем активировать самое длинное время инкубации, а затем в следующий раз точек. Рассчитайте интервалы активации для образцов таким образом, чтобы они были готовы к фиксации одновременно.
   3. Добавьте 100 л холодного 1x PBS к каждому coverslip для того чтобы остановить активацию и продолжать с протоколом immunofluorescence. Смотрите раздел протокола 3.

2. Активация клеток B на крышках с антигеном

1. Приготовление обложек с антигеном
   1. Перед активацией подготовьте антигенный раствор (1x PBS, содержащий 10 мкг/мЛ BCR-лиганд и 0,5 мкг/мл крысы против мыши CD45R/B220).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность подготовки обложек за день до асссе. B220 улучшает адгезию B-клеток, однако, BCR-Ligand достаточно для создания распространения реакции.
   2. Поместите 12-мм coverslip на 24-хорошую крышку пластины покрыты парафина пленкой, добавить 40 л антигена раствор на каждом coverslip и инкубировать при 4 градусах Цельсия в одночасье. Печать пластины, чтобы избежать испарения антигена раствора.
   3. Вымойте крышки с 1x PBS и воздух сухой.
2. Активация В-клеток
   1. Чтобы начать активацию, разбавить IIA1.6 B-клеток до 1,5 х 10⁶ ячеек/мл в среде CLICK 5% FBS.
   2. Добавьте 100 кл л клеток на покрытие антигена (Ag-coverslip) и активируйте для различных временных точек в клеточном инкубаторе при 37 КС / 5% CO2. Типичные точки активации времени 0, 30 и 60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в разделе 1, мы рекомендуем начать с самой длинной активации времени для того, чтобы исправить все образцы в то же время.
   3. На время 0, поместите 24-хорошо крышкой пластины, содержащей Ag-coverslip на льду и добавить клетки. Инкубировать в течение 5 мин на льду.
   4. Тщательно аспирировать средства массовой информации на каждом Ag-coverslip, а затем добавить 100 л холодного 1x PBS, чтобы остановить активацию. Продолжить с протоколом иммунофлуоресценции. Смотрите раздел 3.

3. Иммунофлуоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать перекрестной реактивности вторичного антитела с BCR IIA 1.6 B клеток, не используйте мыши полученных первичных антител.

1. Удалите 1x PBS и приступить к фиксации каждого coverslip.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы решить, какой среде фиксации использовать, проверьте лист данных антитела/красителя. Например, для маркировки актина фаллоидином используют параформальдегид (ПФА) среду фиксации, а для ценрозомной маркировки перицентрином используют метанол фиксацию.
   1. Добавьте 50 зл 1x PBS, дополненный 4% PFA и инкубировать в течение 10 минут на RT.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен. Пожалуйста, прочитайте MSDS, прежде чем работать с этим химическим веществом. Решения PFA должны быть сделаны только под химическим капотом дыма носить перчатки и защитные очки. Раствор PFA следует отбрасывать в качестве опасных химических отходов.
   2. Кроме того, добавьте 50 л холодного метанола и инкубировать в течение 20 мин.
2. Вымойте три раза с 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обложки могут храниться при 4 градусах по Цельсию в этот момент в течение максимум трех дней в 1x PBS.
3. Удалите 1x PBS и добавьте 50 qL блокирующего буфера (2% BSA 0,3 М глицин в 1x PBS) на каждый coverslip. Инкубировать на RT в течение 10 мин.
4. Нежно аспирировать и добавлять 50 qL буфера пермяки (PB) (0.2% BSA и 0.05% сапонин в 1x PBS). Инкубировать на RT в течение 20 мин.
5. Подготовка антител или красителей в ПБ (использовать 30 л на coverslip) и инкубировать на RT в течение 1 ч или на ночь при 4 градусах Цельсия. Для получения дополнительной информации обратитесь к таблице материалов.
   1. Для обозначения микротрубоула организуающий центр (MTOC) или центросомы используйте следующие антитела: анти-К-Тубулин (1:500), анти-Цеп555 (1:500), анти-К-тубулин (1:500), антиперисентрин (1:1000).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для центросомы маркировки B-клеток можно трансфицировать с помощью плазмиды экспрессии центрин-GFP.
   2. Для маркировки аппарата Golgi используйте anti-Rab6a (1:500).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие антитела или красители также могут быть использованы.
   3. Для маркировки лизосомы используйте анти-Lamp1 (1:200).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Anti-H2-DM и anti-MHC-II также могут быть использованы для обозначения отсеков для обработки антигенов^15,16.
   4. Для маркировки эндоплазмического ретикулума используйте anti-Sec61a (1:500).
   5. Для актина цитоскелет ассоцизм считают следующим: полимеризованный актин может быть визуализирован фаллоидином, конъюгированным для флуоресцентных красителей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В-клеток, трансфицированных с LifeAct-GFP / RFP выражение плазмида также может быть использован для обозначения актина.
6. Вымойте крышки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
7. Разбавить вторичные антитела или красители в PBS (использовать 30 л на coverslip) и инкубировать 1 ч на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте подвергать образцы прямого света, чтобы сохранить качество сигнала флуоресценции.
8. Вымойте крышки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
9. Удалите раствор PBS из крышки.
10. Добавьте 4 зликатмонтажа реагента в слайд микроскопа. Установите coverslip на слайд с стороны ячейки вниз. Дайте слайдам высохнуть в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию или на RT на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность использования реагента для монтажа "анти-увядание" (см. таблицу материалов).
11. Приобретайте флуоресценцию изображения на конфокальный или эпифлуоресцентный микроскоп с 60x или 100x цель погружения масла. Для каждого приобретения рассмотреть передаваемые свет или яркое поле легко определить В-клеток, взаимодействующих с бисером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите трехмерные (3D) изображения, охватывающие всю ячейку с помощью z-стеков. Мы рекомендуем принимать 0,5 мкм толстые стеки, однако это зависит от микроскопа.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие алгоритмы описаны для программного обеспечения ImageJ. Тем не менее, это может быть выполнено с помощью эквивалентного программного обеспечения. Также учитывайте, что для всех измерений интенсивности флуоресценции мы используем интегрированную плотность флуоресценции ("RawIntDen" в ImageJ), так как этот параметр учитывает общее количество флуоресценции в каждом пикселе изображения, принимая во внимание область.

1. Анализ распределения органелл в В-клетках, активированных с помощью бисера с покрытием Ag
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки поляризации компонентов клеток в ИГ мы определяем произвольное значение как меру близости к ИГ. Индекс колеблется от -1 (антиполяризованный) и 1 (полностью поляризованный, объект на бисе), как это было ранее представлено Reversat et al.^{12 Лет}.
   1. Оцените индекс полярности для аппарата центросомы и Голги(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм может быть использован для органелл, которые ограничены одной точкой.
      1. Сначала определите области бисера и ячеек для анализа с помощью выбора инструментов круга, чтобы разграничить границы обоих, а затем сохраните их как области интереса (ROI). Смотрите Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, и рисунок 4.
      2. Определить центр ячейки(CC) и центр биса (дон.э.)путем запуска Анализ Измерение на участках клеток и бисовой бытия соответственно. Значения X и Y, полученные из окна Результатов, определяют координаты центра.
      3. Вручную определить центр центрального или Golgi аппарата (Органель) с помощью выбора точечного инструмента в ImageJ и запустить анализ Мера. Значения X и Y, полученные из окна результатов, определяют координаты.
      4. Затем нарисуйте угол отCC к Organelle (а) и CC до н.э. (b) с помощью выбора углового инструмента и запустить анализ Мера. Значение угла в окне результатов показывает угол (q) между обоими векторами (a и b).
      5. Рассчитайте индекс полярности с помощью следующей формулы:
         
   2. Оцените индекс полярности для лисосомы(рисунок 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем этот алгоритм для анализа полярности органелл, которые отображают более рассеянное распределение, например, изизосомы.
      1. Определите области бисера и ячейки для анализа, используя выбор инструментов круга, чтобы разграничить границы обоих, и сохранить их в качестве рентабельности инвестиций. После того, как бисер и клеточные области были определены, установить канал флуоресценции и проецировать изображение в один z-стек(Изображение Стеки Проект «Сумма ломтиками»),а затем запустите Анализ Измерьте и извлеките координаты массового центра (MC) (MX и MY) из окон результатов.
      2. Примените тот же алгоритм, упомянутый перед изменением Organelle для MC. Таким образом,угол (q ) определяется CC-MC (a) и CC-BC(b).
      3. Рассчитайте полярность с помощью следующей формулы:
         
   3. Оцените набор лисономы в синаптической области(рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм используется для количественной оценки органеллы, прилегающей к ИГ.
      1. После того, как бисер и области клеток были определены, определить угол вектора между CC и до н.э., а затем повернуть изображение для достижения 0 "угол.
      2. Установите флуоресцентный канал и проеците изображение в один z-стек(Изображение Стеки Проект «Sum slices»),устраняйте всю флуоресценцию, которая выпадает за пределы клетки и области бисера вместе (запуск отображения на улице в ImageJ).
      3. Используя прямоугольник инструмент выбор, нарисуйте прямоугольник, прилегающий к бисору и измерить синаптической области флуоресценции (SAF). Этот прямоугольник составляет четверть ширины ячейки.
      4. Выберите все изображение и запустите анализ Мера для получения всей флуоресценции клеток(WCF).
      5. Рассчитайте процент флуоресценции органеллы, примыкающий к ИГ, используя следующую формулу:
         
   4. Количественная набор клеточных компонентов в центросому.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм, адаптированный изObino et al. 5, используется для количественной оценки обогащения органелл в области центросомы. Короче говоря, мы рассматриваем центросомную область как область, в которой ассоциированная органеле флуоресценция остается постоянной или выше 70% в флуоресценции/радиусе. Необходимо установить этот параметр в условиях покоя, потому что этот радиус может измениться при активации.
      1. После того, как бисер и клеточные области были определены, определить локализацию центросомы с помощью выбора точечного инструмента (рисунок3B).
      2. Во-первых, определить максимальную площадь вокруг центросомы, что можно количественно, нарисовав 3 мкм-радиус круг, окружающий центросоому.
      3. Используйте ImageJ плагин радиальный профиль, который измеряет флуоресценцию в концентрических кругах и отображает флуоресценции / радиус участка.
      4. Определите максимальный радиус, в пределах которого сохраняется не менее 70% интенсивности флуоресценции.
      5. Рассчитайте соотношение плотности флуоресценции с помощью следующей формулы:
         =
         ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение плотности флуоресценции указывает на концентрацию органеллы в центросоме по сравнению с ее распределением во всей клетке.
2. Анализ распространения клеток и распределения органелл в В-клетках, активированных на Ag-coverslips
   1. Оценка распределения органелл в IS(Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот алгоритм позволяет количественно количественно распределить органеллы XY и их концентрацию в центре ИГ. Мы определяем соотношение плотности флуоресценции между центральной и общей синаптической областью. Полученные значения могут варьироваться от отрицательных к положительным, что указывает на периферическое или центральное распределение органеллы, соответственно.
      1. Определите срез, в котором клетка находится в контакте с крышкой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для разграничения границ клеток можно маркировать плазменную мембрану или актин, который обогащается на периферии ИГ.
      2. Измените тип среза на 8-разрядный, а затем бинареизировать(Процесс Двоичные Сделать двоичный) и подключить ближайшие точки аутсайдера Процесс Двоичные Контур. Разграничение границ областиклеток (CA) с помощью выбора полигонного инструмента.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг полезен для увеличения контрастности границ ячейки и упрощения идентификации. Кроме того, на данный момент, можно применить разъяснение частицы ImageJ для определения CA автоматически. Тем не менее, другие клетки в том же поле может вмешиваться в результаты.
      3. Возьмите параметры CA (высота и ширина) и разграничите центральную округлой области, которая отделена от границ на четверть высоты и ширины значений, рассмотрим эту область как область cell Center (CCA).
      4. Рассчитайте распределение плотности флуоресценции в центре ИС с помощью следующей формулы:
         
   2. Измерение распределения органелл в плоскостях (Рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ определяет общее распределение флуоресценции органеллы между плоскостями В-клеток, активированных на АГ-крышки, показывая процент флуоресценции на фракцию.
      1. Для количественной оценки распределения флуоресценции в З, сначала определить плоскость IS, где ячейка находится в контакте с Ag-coverslip, а затем плоскости, соответствующей верхней предел клетки.
      2. Нарисуйте линию через центр ячейки.
      3. Перерезка изображения в й(Изображение Стеки Reslice), для получения изображения X.
      4. Измерьте высоту и разделите изображение X' на 10 последовательных прямоугольников одинаковой высоты (фракция) от нижней части (интерфейс IS) к верхней (верхней стороне ячейки) и количественно оценивайте сигнал флуоресценции в каждом из них.
      5. Нормализовать интенсивность флуоресценции каждой фракции по сумме общей флуоресценции 10 фракций.
      6. Участок процент интенсивности флуоресценции на долю клетки.

5. Изоляция обогащенной центросомы фракции от отдыха и активированных В-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все растворы при 4 градусах по Цельсию во время эксперимента, чтобы избежать деградации белка. Этот протокол был адаптирован из предыдущей работы^17,18.

1. Активируйте 2 х 10⁷ В-клетки с бусинами с аг покрытием в 2 мл средней CLICK и 2% тепло-инактивированных FBS (коэффициент 1:1). Рассматривайте неактивированные В-клетки как покойные В-клетки.
2. Добавьте цитохалазин D (2 мкм) и нокодазол (0,2 мкм) и инкубировать на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти препараты используются для мягкого отсоединения центросомы от ядра, путем деполимеризации актина цитоскелет и микротрубочки, соответственно, чтобы избежать ядерного загрязнения.
3. Вымойте каждый образец с 5 мл холодной 1x TBS (50 мм Tris-HCl, рН 7,6, 150 мм NaCl), а затем с 1 мл 0,1x TBS дополнены 8% сахарозы.
4. Повторное действие клеток с 150 мл буфера лизосомы (1 мМ HEPES, рН 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 мМ MgCl₂, 0,1% бета-Mercaptoethanol, 1 мМ фенилметилфолилов фторид (PMSF) или процеазно-ингибитор ингибитор уменьшается, что указывает на то, что в образце идентифицируется лизис клеток. Положите образец в трубку 1,5 мл.
5. Центрифуга при 10 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы отделить органеллы от ядра.
6. Тщательно восстановить супернатант и поместить его на вершине 1,5 мл трубки с 300 мл градиента буфера (ГБ) (10 мМ PIPES pH 7,2, 0,1% Тритон X-100, 0,1% бета-меркаптоэтанол), содержащий 60% сахарозы.
7. Центрифуга при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы сконцентрировать центросомы в 60% фракции сахарозы.
8. Между тем, подготовить прерывистый градиент в 2 мл ультрацентрифуговых труб путем наложения 450 Л ГБ и 70% сахарозы с 270 МЛ ГБ и 50% сахарозы, а затем 270 Л ГБ и 40% сахарозы.
9. После первого центрифугирования (центрососососомного фракции) отбросьте верхнюю фракцию (менее плотную часть) до достижения интерфейса и вихря оставшегося образца в трубке. Затем, наложение на верхней части прерывистого градиента ранее подготовленные с центросоом обогащенный образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарушить градиент, все процедуры пипетки должны быть тщательно выполнены.
10. Центрифуга при 40 000 х г на 1 ч при 4 градусах Цельсия с минимальным ускорением и с выключенным тормозом центрифуги, чтобы избежать нарушения градиента.
11. Соберите 12 фракций по 100 л в отдельные трубки, начиная с вершины.
12. Определите центросомы обогащенных фракций иммуноблотом с помощью з-тубулина в качестве маркера центросомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно находим обогащенные центросом экстракты между фракциями 6 и 8.

В настоящей статье показано, как В-клетки могут быть активированы с помощью обездвижеонного антигена на бисере или крышках, чтобы вызвать образование ИГ. Мы предоставляем информацию о том, как определить и количественно поляризации различных органелл с помощью иммунофлюоресценции и как охарактеризовать белки, которые претерпевают динамические изменения в их связи с центросомой, которая поляризует IS, используя биохимический подход.

Изображение В-клеток с помощью иммунофлуоресценции позволяет нам следить за динамикой органелл, таких как центросома, аппарат Голги и лисосомы, которые завербованы в ИС после активации вяленых клеток. Можно получить количественные параметры для измерения поляризации этих органелл с ИГ и сравнить их в разных условиях. Как мы показываем на рисунке 1A, Центрисома и Golgi Apparatus завербованы в IS на активации ячейки B. Вербовка не наблюдалась в В-клетки стимулировали с BCR-лиганд-о том, что участие BCR требуется для мобилизации центросомы и Golgi аппарата в IS(Рисунок 1A). Для получения индекса полярности для каждой органеллы, как измерение его близости к ИГ, мы рассмотрели три особенности: расстояние между органеллой и центром клетки, расстояние между центром биса и центром клетки, и угол между ними два вектора(рисунок 1B). Этот индекс колеблется от -1 (антиполяризованный) и 1 (полностью поляризованный, объект на бисе). На рисунке 1С и 1D показаны графики, где индексы полярности каждой органеллы отображаются по сравнению со временем активации. В согласии с иммунофлуоресценцией окрашивания, как центросомы и Golgi аппарата, отображать более позитивные показатели полярности на более длительные точки времени активации, отражая, как они постепенно вербуются в IS. Этот алгоритм применим для органелл, ограниченных одной точкой.

Кроме того, мы количественно поляризации органелл, которые отображают рассеянное распределение, такие как лизосомы (Рисунок 1E), применяя тот же алгоритм, упомянутый ранее, но изменение точечной координат по координатам массового центра изосомы(рисунок 1F). Мы можем наблюдать, что индексы полярности полосообразных бассейнов достигают более положительных значений при активации, что указывает на то, что лисосомы мобилизуются в направлении синапса на активации В-клеток(рисунок 1G).

Мы также определили два алгоритма для определения органелл, которые находятся в контакте с синаптическим интерфейсом (бисиной) и количеством органелл в непосредственной близости от синапса, но не обязательно в контакте. Как мы показываем на рисунке 2, мы количественно лисососомы, контактируя с синаптической интерфейс (Рисунок2A), путем деления LAMP-1 сигнала на бисер области общей флуоресценции в клетке плюс бисер (Рисунок 2B). Важно учитывать, что диаметр области бисовой бисовой части определяет диапазон полученных процентов. Например, в отображаемся количественная оценка(рисунок 2B),мы рисуем круг с диаметром 3 мкм для измерения флуоресценции на бисере, что является ограничительным параметром с учетом размера бусины (3 мкм). Используя этот параметр, результаты показывают, что лисосомы постепенно набираются в синаптический интерфейс при активации B-клеток, достигая 10-15% от общей массы(рисунок 2C). Другой подход, показанный является количественное количественное количественное увеличение лисосомы в синаптической области. Рисунок 2D показывает, что лисосомы постепенно накапливают до 25% их лисососомы в ИС. В целом, выполняя оба вида анализа, можно оценить поляризацию и стыковку органелл в ИГ.

Во время активации В-клеток, изменения в пулецентросомного белка были задокументированы 5. Например, один из этих белков, который изменяет их связь в центре во время активации В-клеток актин. В этом случае актин истощается в пределах этого региона, что позволяет центросому оторваться от ядра, способствуя его поляризации в IS5. Здесь мы представляем количественную оценку актина в Центре и как он истощается при активации клеток B(рисунок 3). Чтобы определить центросомную область, используемую для количественной оценки связанного актина, мы измерили интенсивность флуоресценции этой метки в концентрических кругах, окружающих центросому. Радиус был определен на основе точки, где по крайней мере 70% интенсивности флуоресценции этикетки поддерживается(рисунок 3B) . Используя этот подход можно количественно снижение плотности актина в центросоме на активации вяленых, как показано на рисунке 3C.

Чтобы получить большее разрешение в распределении органелл на интерфейсе IS, мы активировали В-клетки на антиген-покрытиекрышки, маркировка актина, аппарата Golgi и эндоплазмического ретикулума (Рисунок 4A). Распределение органелл в IS может быть выполнено путем погружения синаптической области в центральной и периферийной области, применяя критерии, показанные на рисунке 4B. Это было основано на предыдущей работе, показывающей, что БЦП собираются в пределах этой центральной области, что, скорее всего, соответствует центральному супрамолекулятивно-активизму (cSMAC)10,19. На рисунке 4А показано, что органеллы, завербованные в ИГ, такие как аппарат Голги и эндоплазмический ретикулум, демонстрируют противоположные распределения. Действительно, их индексы распределения коррелируют с их иммунофлюоресценции окрашивания показано на рисунке 4C. Аппарат Голги показывает положительную ценность, а это значит, что он сконцентрирован в центре ИГ, в то время как эндоплазмический ретикулум показывает отрицательные значения, что означает, что он в основном локализован в периферийном регионе ИГ. Кроме того, можно взять значения синаптической области, ранее определенные, для измерения области распространения во время активации В-клеток, как показано на рисунках 4D и 4E. Эти результаты показывают увеличение области распространения на активации B-клеток, как ранее описано10,20.

Как и в обзоре биса, мы можем определить распределение органелл к иммунной синапсе, принимая изображения X', активированных на антиген-покрытиех крышки и измерения флуоресценции органеллы через измерение q (Рисунок 4F). Интенсивность флуоресценции актина в плоскости q была измерена, так как она представлена в плоскости X' на рисунке 4F, где можно наблюдать прогрессивное обогащение актина в синаптическом интерфейсе (фракции 1 и 2)(Рисунок 4G).

В дополнение к анализу визуализации клеток В, мы выполнили изоляцию обогащенных центром фракций для количественной оценки связанных с центромногоми белков(рисунок 5A). Этот подход может быть важным в дополнение к изучению образования ИС в В-клетки, учитывая, что центросома поляризует синаптической мембраны и было показано, координировать лизосомы торговли, участвующих в антиген акции добычи и презентации21. Этот метод был ранее описан с использованием большого количества клеток (1 х 109 клеток)17,18, но мы стандартизировали упрощенную версию, которая использует уменьшенное количество клеток и может быть выполнена с использованием более низкого объема ультрацентрифуг-трубки (2-3 мл). Как мы показываем на рисунке 5B, мы проанализировали различные фракции клеток путем иммуноблоттинга и определили, какие из них соответствуют центросомы богатых фракций, гамма-тубулина окрашивания. Здесь мы показываем пример белков, которые претерпевают изменения в их накоплении в центросоме, таких как Actin и Arp2, которые ранее сообщалось5.

Рисунок 1 : Поляризация органелл по отношению кИГ. ()Иммунофлуоресценция окрашивания аппарата Golgi (Rab6a) и микротрубок (я-тубулин) в IIA1.6 B клеток инкубируется BCR-лиганде (0, 30, 60 и 120 мин) или BCR-лиганд-бусы (120 мин). Стрелы указывают на центросому. БФ - Яркое поле. Шкала бар No 3 мкм. (B) Схема, изображающая, как вычислить индекс полярности органелл (центросома или аппарата Голги) к IS. a Расстояние между центром клетки (CC) к органелле. б - Расстояние от CC и до бис-центра (до британской). (C, D) Представительные точечные сюжеты, показывающие индексы полярности органелл в разных временных точках активации. Каждая точка представляет одну ячейку. (E) Иммунофлуоресценция окрашивания лисососомы (Lamp1) в В-клеток инкубируется с BCR-лиганде (0, 30, 60 и 120 мин) или BCR-лиганд-бусы (120 мин). БФ - Яркое поле. Шкала бар No 3 мкм. (F)Схема, представляющая, как вычислить индекс полярности лисососомы. a Расстояние между CC до массового центра (MC). б - Расстояние от CC до до н.э. (G) Представительные точечные сюжеты, показывающие полярности индексы изизосомы в разное время точек активации. Каждая точка представляет одну ячейку. Была проведена 2-сторонний ANOVA с послетестом Сидака. Показаны средства с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : Накопление лисосомы в ИГ. ()Иммунофлуоресценция окрашивания лизосомы (Lamp1) в В-клеток инкубируется с BCR-лиганде (0, 30, 60 и 120 мин) или BCR-лиганд-бусы (120 мин). BF - яркое поле. Шкала бар No 3 мкм. (B) Схема, изображающая, как вычислить накопление органелл, таких как лисосомы в бисотовой и синаптической области. Флуоресценция всей клетки (WCF), бисины флуоресценции (BF) и синаптической области флуоресценции (SAF) показаны. (C, D) Представитель бар графики для накопления лисосомы в бисиной и синаптической области. N No 1. 20 клеток. Была проведена 2-сторонний ANOVA с послетестом Сидака. Показаны средства с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Количественная оценка актина у центросомы во время формирования ИГ. ()Иммунофлуоресценция окрашивание актина (фаллоидин) и микротрубулей (з-Тубулин) в В-клетки инкубируются с BCR-лиганде (0 и 60 мин) или BCR-лиганд-бусы (0 и 60 мин). Наконечникстрела указывает на центросому. Шкала бар No 3 мкм. (B) Схема, изображающая, как вычислить набор или истощение связанных с centrosome компонентов. Область центросомы рассчитывается с помощью радиуса (X мкм), которые поддерживают не менее 70% максимальной флуоресценции. (C) Представитель точки участков, показывающих актин в центросоме под активацией (BCR-лиганд) и неактивации (BCR-лиганд-) условиях. N No 1. 15 клеток. Была проведена 2-сторонний ANOVA с послетестом Сидака. Показаны средства с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4 : Распределение клеточных компонентов в синаптическом интерфейсе. (A) Иммунофлуоресценция окрашивание актина (Фаллоидин), Эндоплазмический ретикулум (Sec61a), аппарат Golgi (трансфицируется KDELR-DN-GFP отрицательный доминант KDEL Рецептор, который локализуется в Golgi). В-клетки были посеяны на крышках, покрытых BCR-лигандве в течение 60 мин. BF - яркое поле. Шкала бар No 5 мкм. (B) Схема, изображающая, как определить площадь распространения ячейки и вербовки органелл в центре ИГ. В схеме, CA указывает область клетки делимитирована корковой актин и CCA указывает область клетки центра. (C) Аппарат Golgi и эндоплазмическое распределение reticulum на IS, представленном графиком адвокатского сословия где значение qgt;0 показывает обогащение в центре IS и qlt; 0 показывает периферийное распределение. N No 1. 20 клеток. Показаны средства с SEM. (D) Репрезентативные изображения В-клеток, маркированных для актина (Phalloidin), активированных на крышках с покрытием Ag в разных точках времени (0, 30 и 60 мин), показывая плоскость X' и XY. (E) График, показывающий область распространения В-клеток в E. (F) Схема, изображающая, как определить распределение сигнала интереса в плоскости , и сюжет на фракцию. Прямоугольник указывает на интерфейс IS. (G) Распределение актина через плоскость, представленную линейным участком процента распределения флуоресценции по сравнению с каждой фракцией. Прямоугольник представляет интерфейс IS. N No 1. 25 ячеек. Показаны средства с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5 : Центросома обогащает фракции В-клеток. (A) Рабочий процесс о том, как получить центросомы обогащенных фракций сахарозы градиента ультрацентрифугирования. (B) Иммуноблот фракций, полученных от отдыха и активированных В-клеток (60 мин). Богатые центром фракции обнаруживаются путем маркировки с помощью к-тубулина и указываются в пунктирной прямоугольнике (фракция 6 к 8). Центросомные связанные белки (Actin и Arp2) показаны в богатых центром фракциях в условиях активации и покоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.