Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59720

⸱

11 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол с использованием передового генетического подхода к экрану для мутантов, демонстрирующих нейродегенерацию в Drosophila melanogaster. Она включает в себя альпинизм анализ, гистологический анализ, генотирование и секвенирование ДНК, чтобы в конечном итоге определить новые гены, связанные с процессом нейрозащиты.

Аннотация

Существует много понять о начале и прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, в том числе основных генов, ответственных. Вперед генетического скрининга с использованием химических мутагенов является полезной стратегией для отображения мутантных фенотипов к генам среди drosophila и других модельных организмов, которые разделяют сохраненные клеточные пути с людьми. Если мутировавший ген интереса не летальный в предыдущих этапах развития мух, то восхождение исследование можно дирижировать для того чтобы экранировать для фенотипических индикаторов уменьшенного функционирования мозга, such as низкие тарифы взбираясь. Впоследствии, вторичный гистологический анализ ткани мозга может быть выполнен для того, чтобы проверить нейропротекторную функцию гена, забив фенотипов нейродегенерации. Стратегии картирования генов включают мейотическое и дефицитное картирование, которые полагаются на эти же ассеифы, могут сопровождаться секвенированием ДНК для выявления возможных нуклеотидных изменений в интересуемом гене.

Введение

Нейроны по большей части пост-митотические и не способны разделить1,2. У большинства животных существуют нейропротекторные механизмы для поддержания этих клеток на протяжении всей жизни организма, особенно в пожилом возрасте, когда нейроны наиболее уязвимы к повреждениям. Гены, лежащие в основе этих механизмов, могут быть идентифицированы в мутантах, демонстрирующих нейродегенерацию, фенотипический индикатор потери нейропротекторной защиты, используя вперед генетический протокол. Вперед генетические экраны с использованием химических мутагенов, таких как этил метанесульфонат (EMS) или N-этил-N-нитросурея (ENU) особенно полезны из-за случайных мутаций точки они вызывают, в результате чего по своей сути беспристрастный подход, который пролил свет на многочисленные функции генов вэукариотических модельных организмах 3,4,5 (в отличие от рентгеновского мутагенеза создает разрывы ДНК и могут привести к перестановкам, а не точечным мутациям6).

Обычная плодовая муха Drosophila melanogaster является идеальным предметом для этих экранов из-за его высокого качества, хорошо аннотированной последовательности генома, его долгой истории в качестве модельного организма с высокоразвитыми генетическими инструментами, и, самое главное, его общей эволюционная история с людьми7,8. Ограничивающим фактором применимости этого протокола является ранняя летальность, вызванная мутировавшими генами, что предотвратило бы тестирование в пожилом возрасте9. Однако, для нелетальных мутаций, альпинистский анализ, который использует негативные геотаксиса, является простым, хотя и обширным, методом количественной оценки нарушения функционирования двигателя10. Чтобы продемонстрировать достаточную реакционную реакцию локомотора, мухи зависят от нервных функций, чтобы определить направление, почувствовать его положение и координировать движение. Неспособность мух достаточно подняться в ответ на раздражители может поэтому указать неврологические дефекты11. После того, как конкретный дефектный альпинистский фенотип выявлен, дальнейшее тестирование с использованием вторичного экрана, такого как гистологический анализ тканей мозга, может быть использовано для выявления нейродегенерации у альпинистских мух. Последующее картирование генов может быть использовано для выявления геномной области на хромосоме, несущей дефектный нейропротекторный ген, представляющий интерес. Чтобы сузить хромосомную область, представляющих интерес, может быть выполнено мейотическое картирование с использованием линий мухмутов, несущих доминирующие маркерные гены с известными местами на хромосоме. Гены маркеров служат отправной точкой для мутации, так как частота рекомбинации между двумя локусами обеспечивает измеримое расстояние, которое может быть использовано для картирования приблизительного местоположения гена. Наконец, пересечение линий мутантов с линиями, несущими сбалансированные недостатки на мейотически отображенной хромосомной области интереса создает дополнение тест, в котором ген интереса может быть проверен, если его известный фенотип выражен5. Полиморфные нуклеотидные последовательности в идентифицированном гене, возможно, в результате изменения аминокислотных последовательностей, могут быть оценены путем секвенирования гена и сравнения его с последовательностью генома дрозофилы. Последующая характеристика интересуемого гена может включать тестирование дополнительных мутантных аллелей, эксперименты по спасению мутаций и изучение дополнительных фенотипов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка и старение мух

  1. Получить или создать6 коллекция дрозофилы мутантов, которые будут использоваться для генетического экрана. Здесь используются эну-мутагенизированные линии, отображаемые ко второй хромосоме и сбалансированные по сравнению с CyO.
  2. Усиль экспериментальные линии генотипа в инкубаторе, установленном при 25 градусах Цельсия, 12 ч светло-темном цикле на среде кукурузной муки-патоки.
  3. Соберите около 20 гомозиготных потомков между 0-2 днями взрослой эклосии от каждого экспериментального генотипа. Устранить половой предвзятости, последовательно собирая либо мужчины или женщины мух.
  4. Возраст мух на кукурузной муке-патоки среды по желанию при 29 градусов по Цельсию, листать флаконы каждые 2-3 дня для того, чтобы сохранить мух на свежие продукты питания, как они стареют. На представленном здесь экране мухи выдержаны 10-12 дней.
  5. Соберите альпинистский анализ испытательной камеры с помощью двух флаконов и ленты, как ранее описано10. Флаконы должны быть соединены на обоих открытых концах. Используйте линейку, чтобы отметить 5 см линии на одном конце камеры.

2. Протокол 1: Альпинизм Асса (адаптировано от Али и др.10)

  1. Проверка альпинистского исследования. В этом исследовании, проверить восхождение анализ на основе ранее описанной методологии Али и др.10, используя ElavC155 контроль) и ElavC155
  2. Переверните мух в испытательную камеру, по одной линии за раз (не используйте АНЕСТЕЗИю CO 2) и дайте им восстановиться в течение 5 минут. Если тестирование проводится в разные дни, выполните анализ в одно и то же время дня. В этом исследовании, все альпинистские анализы были выполнены во второй половине дня для контроля за циркадные эффекты на передвижение12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте подвергая мух для прямого солнечного света при тестировании; это помешает их способности подниматься.
  3. Насильно коснитесь камеры (отмеченной стороной вниз) на коврик для мыши, помещенный на твердую поверхность 3 раза, чтобы все мухи начали асссеировать внизу. Наблюдайте движение мух в течение 10 с.
  4. Запишите количество мух, которые достигают или проходят 5 см линии в течение этого времени, а также общее количество мух испытания. Повторите протокол, ожидая 1 минуту между каждым испытанием, как минимум 3 пробные репликации на строку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании каждый флакон содержит от 2 до 19 мух для первоначального скрининга (мужские мухи) и от 6 до 21 мухи для анализа дефицита мутантов пересекшихся женских линий (раздел 5.3.).

3. Протокол 2: Выбор штаммов дрозофилы для дальнейшего анализа

  1. Введите данные альпинистского анализа в Microsoft Excel или аналогичное программное обеспечение и вычислите скорость восхождения для каждой строки по всем репликациям в процентах.
  2. Выполните статистический анализ для обнаружения линий мутантов, которые значительно отклоняются от среднего значения, поднимающегося на процент всех линий, используя пакет программного обеспечения R13.
    1. Читайте в файлах данных, курируемых для файлов R (.csv или .txt с столбцом для каждой переменной или фактора, и строками, представляющими определенные значения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь данные для мужчин (первоначальный анализ) и женщин (линия 867 перешли к линии дефицита) были введены в отдельные листы .xlsx как две колонки, один, где строки столбца определить мутант линии и сколько раз анализ был реплицирован, а другой, где строки представляют средний успех восхождения (в процентах) для каждого репликации флакон мух.
    2. Прочитайте данные в R с помощью следующего кода:
      малиlt;-read.csv(". /male-init.csv")
      femdef-lt;-read.csv(". /fem'def-cross.csv")
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каталоги ".." в каталогах путей являются абсолютными путями из корневого каталога компьютера пользователя и должны быть указаны отдельным пользователем для путей каталога своего компьютера.
    3. Выполнение линейного моделирования
      1. Выполните фиктивную переменную регрессию с функцией lm в R. Для первоначального анализа линий мутантов, оценить значение эффектов уровня фактора (мутантных линий) на процент восхождение успех против великого среднего для нулевой средней средней переменной реакции (процент успеха).
        ПРИМЕЧАНИЕ: "-1" в конце функции lm вызова в разделе 3.2.3.2. удаляет перехват и позволяет нам проверить все уровни фактора против нулевого среднего среднецентрового процента процентного восхождения проходной ставки.
      2. Печать результатов на экране с помощью функции R резюме:
        малианова-л;-лм (масштаб (мали$/P-Успех)-мали$Мутант-лин -1)
        резюме (малиянова)
      3. Используйте линии управления (если они присутствуют) в качестве базового уровня для проверки эффектов факторного уровня в отношении использования следующего R-кода: x'lt;-relevel (femdef$Mutant'line, ref'a867'plus)
        femdef-anova-lt;-lm (femdef$P'success'x)
        резюме (фемдефанова)
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первая строка кода перевыполняет уровни фактора, так что отрицательная линия управления становится базовым перехватом, против которого тестируются все другие уровни фактора (мутантные линии) со встроенными т-тестами в функции lm.
  3. Выберите порог для кандидатов в зависимости от возраста на момент тестирования. Чтобы определить порог, выполнить предварительный тест в нужном возрасте с использованием известных мутантов, которые демонстрируют нейродегенерации и низкие показатели восхождения проход по сравнению с диким типом, контроль мух10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проходной показатель ниже 50% может быть подходящим для 10 дней летает, как сообщалось ранее для Drosophila линий overexpressing человека нейродегенерации, связанных с геном Тау в нервной системе10. Более старые мухи должны иметь более высокий порог проходной тариф в виду того что они предположены, что exhibit уменьшенное передвижение, таким образом, увеличено neurodegeneration.

4. Протокол 3: Гистологический анализ

  1. Ношение перчаток, разорвать летать головы с хирургическим лезвием после восхождения анализ и использовать кисть, чтобы аккуратно поместить их в 1 мл фиксации Карной (6:3:1 из 100% EtOH: хлороформ: ледниковая уксусная кислота) в 1,5 мл микро центрифуги трубки O / N при 4 градусах Цельсия. Убедитесь, что головки тонут в фиксаторном растворе.
  2. Замените фиксаторное решение на следующий день 1 мл 70% EtOH и сохранить образцы по-прежнему на 4 градусов по Цельсию для будущего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на этом этапе.
  3. Поместите головки со ступени 4.2. не более пяти на микробиопсию кассеты. Немедленно поместите кассеты в контейнер, наполненный 70% EtOH. Храните контейнер при 4 градусах Цельсия перед отправкой в гистологическое учреждение для обработки и встраивания голов парафина. Если доступно оборудование для обработки тканей и встраивания, следуйте шагу 4.4.
  4. Встраивай головы в парафин для микротомирования:
    1. Следуйте настройкам программы для автоматизированной машины обработки тканей в порядке, представленном в таблице 1 для обезвоживания, очистки и проникновения с парафином головы.
    2. Передача образцов в металлические формы базы, которые соответствуют кассете с помощью парафина нагревается при 60 градусов по Цельсию с помощью парафина встраивания станции.
    3. Ориентируйте головы (антеро-задняя ориентация, обращенная к вершине) в базовой плесени с помощью тонких щипц, чтобы обеспечить надлежащую визуализацию ткани мозга после секции. Это может быть сделано путем разогрева парафина при 60 градусах Цельсия и перепозиционирования головок в случае необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Металлические формы могут быть заменены одноразовыми базовыми формами.
    4. Расположите кассету в верхней части соответствующей базовой формы и аккуратно переместите их на охлажденный борт станции встраивания парафина (4 кВ). Подождите, пока блок затвердеет, прежде чем удалить его со станции.
    5. Удалите блок форме формы, мягко отделяя форму от кассеты.
  5. Обрезать каждый парафин блок предварительного раздела, чтобы свести к минимуму поверхность, которая будет разделена.
  6. Установите микротом, чтобы сократить 5 мкм разделов каждого блока.
  7. Поместите секционированную парафиновую ленту, содержащую ткани, в нагретой водяной бане (35 градусов по Цельсию) максимум 5 мин.
  8. Погрузите полилизинс покрытием слайд (помогает сохранить ткани) в нагретой водяной бане, размещение секционированной лентой на слайде с помощью древесных аппликаторов. Пусть слайды воздуха сухой O / N при комнатной температуре.
  9. Нагрейте горки в течение 15 минут при температуре 63 градусов по Цельсию с помощью горки теплее.
  10. Поместите слайды на слайде окрашивания стойку и пятно с гематоксилин и эосин (H и E) под дымом капот, уважая следующие шаги.
    1. Поместите стойку в Histochoice (нетоксическая замена ксилена, который помогает удалить парафин из образца) в течение 5 мин.
    2. Перенесите стойку в контейнер, наполненный Histochoice, на 5 минут.
    3. Перенесите стойку в контейнер, наполненный 100% EtOH 1 в течение 5 минут.
    4. Перенесите стойку в контейнер, наполненный 100% EtOH 2 в течение 5 минут.
    5. Перенесите стойку в контейнер, заполненный 95% EtOH в течение 3 мин.
    6. Перенесите стойку в контейнер, наполненный 70% EtOH в течение 3 мин.
    7. Перенесите стойку в контейнер, наполненный дистиллированной H2O в течение 5 мин.
    8. Перенесите стойку в контейнер, наполненный Харрисом Гемацилином, на 2-5 мин.
    9. Выняйте стойку из раствора гематоксилин и поместите ее под проточной водопроводной водой в течение 10 мин.
    10. Перенесите стойку в контейнер, наполненный дистиллированной водой, делая короткий замочить.
    11. Перенесите стойку в контейнер, наполненный Эозином, на 1-2 мин.
    12. Перенесите стойку в контейнер, наполненный 95% EtOH, делая короткий замочить.
    13. Перенесите стойку в контейнер, заполненный 95% EtOH в течение 5 минут.
    14. Перенесите стойку в контейнер, наполненный 100% EtOH в течение 5 минут.
    15. Перенесите стойку в контейнер, наполненный 100% EtOH в течение 5 минут.
    16. Перенесите стойку в контейнер, наполненный Histochoice (или Xylene) в течение 5-10 минут, пока все слайды не будут установлены.
    17. Смонтировать горку и крышку (24 мм х 60 мм размера). Используя щипчи, возьмите слайд из раствора Histochoice или Xylene и сделайте тонкую полоску монтажной среды на верхней части. Аккуратно поместите крышку сверху, стараясь избежать образования пузырьков.
    18. Пусть монтаж наяприва на установленных слайдах затвердеет O/N под капотом дыма до анализа.
    19. Храните окрашенные горки в коробке при комнатной температуре.
  11. Количественно нейродегенерации, глядя на все серийные разделы на слайде на 20x увеличение под легким микроскопом. Изучите весь мозг, принимая качественное ксведению размера и количества вакуол, которые появляются в трех последовательных разделах.
  12. Получение изображений репрезентативных секций мозга примерно в середине мозга с помощью светового микроскопа, оснащенного программным обеспечением для визуализации.

5. Протокол 4: Гена Картирование рецессивного фенотипа мютанта

  1. Перекрестите линию кандидата на дикий тип CantonS (BL- 9517) или другой дикий тип или изогенизированный штамм (например, OregonR (BL) 2376), w1118 (BL-5905) или yw (BL- 6599), чтобы определить, является ли фенотип доминирующим или Рецессивный.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Результаты этого шага будут направлять следующие шаги отображения. Если фенотип рецессивный, то дефицит отображение может быть выполнено.
    1. Используя кисть, сделать крест, поместив впищевой, содержащий флакон CO 2-анестезируется мухмутов линии интереса (5 мужчин) и Линии CantonS (10-15 девственных женщин). Поместите флакон при 25 градусах Цельсия.
    2. Соберите гетерозиготное потомство F1 и повторите альпинистские и гистологические эксперименты.
    3. Сравните полученные результаты только с контрольной линией и с гомозиготными мутантами. Хорошим признаком рецессивного фенотипа будет если гетерозиготные мутанты обладают аналогичными фенотипами, как дикие мухи типа.
  2. Выполните мейотическое отображение, чтобы приблизительно оценить расположение мутации на второй хромосоме с помощью WGSp-1 J1 L2 Pin 1/CyO (BL-3227) или эквивалентного штамма с связанными доминирующими маркерами на известных цитологическое расположение. При этом ранее было известно, что мутация находится на второй хромосоме.
    1. Используя кисть, сделать крест, поместив впищевой, содержащий флакон CO 2-анестезированных мух мутантной линии интереса (5 мужчин) и WGSp-1 J1 L2 Pin1/CyO линии (10 женщин). Поместите флакон при 25 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого креста заключается в генерации гетерозиготных самок, несущих хромосому с новой мутацией и маркерной хромосомой, которая будет рекомбинировать сяводом во время мейоза6,14. Женского потомства F1 выбираются, а не мужчины, так как рекомбинация не происходит у мужчин.
    2. Соберите по крайней мере 15 девственных женских потомков, несущих хромосому с новой мутацией и маркерной хромосомой и перекрестите их к 5 самцам со сбалансированной линии, которая несет в себе другой видимый доминирующий маркер (например, CyO/snaSco (BL-2555) или эквивалент).
    3. Соберите гетерозиготное мужское потомство, несущее либо Sco или CyO, так и потенциально рекомбинированную хромосому от креста в шаге 5.2.2. и индивидуально спаривать их с девственными самками из запаса, несущего мутитную хромосому.
    4. Соберите потомство с финального креста, описанного в шаге 5.2.3. и возраст мух на 29 градусов по Цельсию (в этом исследовании мухи были в возрасте 10-14 дней).
    5. Соберите головы, выполнить гистологический анализ, как описано в Протоколе 3 и посмотреть на слайды с разделами мозга, чтобы определить степень нейропатологии, как описано в шаге 4.11. Гистологический анализ выполняется, а не анализ передвижения из-за фенотипов, которые могут повлиять на восхождение анализ, такие как Jammed (J), который вызывает накопление жидкости в крыльях15.
  3. Выполните недостачное отображение на суженных областях хромосомы, чтобы уточнить расположение рецессивной мутации с помощью альпинистского анализа. Каждая линия дефицита имеет удаление различных области хромосом, что позволяет использовать их для дополнительного тестирования.
    1. Начните с больших недостатков, которые охватывают регион, выявленные в мейотических карт, которые затем могут быть дополнительно сужены с помощью небольших недостатков. Если анализ дефицита приводит к более чем одному гену-кандидату, рекомендуется использовать запасы РНК-интерференции (РНК) для их целевой цели.
    2. Перекрестные линии из комплекта дефицита Drosophila 16 для второй хромосомы (DK2L в данном исследовании) и искать не-дополнения фенотипа интереса (в этом исследовании: восхождение проходной курс 8,5%, что соответствует проходной ставке гомозиготные мухи от линии 867 используется в качестве положительного контроля).
    3. Подтвердите фенотип нейродегенерации с помощью гистологии проверки, как описано в разделе 4 (Протокол 3).

6. Протокол 5: секвенирование и анализ ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что ENU mutagenesis вводит точки мутации11.

  1. Дизайн вперед и обратный грунтовки последовательности фланговых экзон-кодирования области гена brat для усиления по Полимераза цепной реакции (PCR) региона интереса (в случае линии 867 фрагмент ДНК размером 3247 bp усиливается для секвенирование17).
  2. Извлеките ДНК из одной мухи18 :
    1. Аккуратно хлюпать летать в 0,5 мл микро центрифуга трубки, содержащей 50 л squishing буфера (10 мм Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 мМ NaCl, и 200 мкг /мл Протеиназа K; фермент должен быть разбавлен свежим от запаса замороженных кончик перед каждым использованием) с помощью P100.
    2. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия
    3. Отключите Proteinase K, поставив трубку на 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеченная ДНК может храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев.
  3. Выполните реакцию ПЦР с использованием высокой точности ДНК Taq Polymerase (реагенты и тепловые условия цикла, используемые в этом исследовании, показаны в таблице 2 и таблице3, соответственно), соблюдая инструкции производителя и запуская продукт ПЦР на 1 % агарозный гель, содержащий Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, который является нетоксичной альтернативой бромистого эхидия.
  4. Акциз полоса правильного размера из геля скальпелем и очистить продукт ПЦР с помощью Волшебник SV гель и PCR Очистка-Up системы (Promega) или эквивалентный комплект, уважая инструкции производителя.
  5. Дизайн вперед и обратные грунтовки, которые будут использоваться для секвенирования ДНК для того, чтобы охватить весь регион интересов, если это возможно. Последовательность гель-очищенной ДНК от предыдущего шага для выявления точечных мутаций. Высокая точность в автоматизированной флуоресцентной секвенирования Sanger может быть достигнута до 700 bp.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полимераза Ex Taq (TaKaRa) может использоваться для усиления продуктов ПЦР из геномных шаблонов ДНК размером до 20 кб.
  6. Анализ полученных последовательностей ДНК с помощью плазмидного редактора (ApE, М. Уэйн Дэвис) или аналогичного программного обеспечения путем выравнивания их и сравнения их с последовательностями, полученными после секвенирования той же геномной области эталонного штамма (например, первоначально мутагенизированных линии).
    1. Открыть файлы последовательности с ApE. В качестве ссылки используйте файл ApE, содержащий геномную последовательность консенсуса гена brat, загруженного в формате FASTA с Flybase, или файл, содержащий результаты для последовательности генетического фонового контроля (например, первоначально мутагенизированная Drosophila линии).
    2. Перейти к инструментам, а затем выровнять последовательности. Используя мышь компьютера, выберите все последовательности для сравнения. Не забудьте указать ссылку последовательность, используемую для этого выравнивания в меню капли.
    3. Проинспектировать секвенированный регион на наличие нуклеотидных изменений по сравнению с эталонной последовательностью. При желании сохраните выравнивание на компьютере в формате .rtf, нажав на текст, затем сохраните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если бы мутации не были выявлены, протокол секвенирования и анализа ДНК повторялся бы с помощью грунтовок, предназначенных для включения некодирующих областей гена.

7. Протокол 6: Дальнейший анализ функции гена кандидата

  1. Выполните спасательные эксперименты в нейробластов, чтобы определить, является ли ген brat несет ответственность за фенотип нейродегенерации.
    1. Двойной баланс UAS-brat19 и нейроблас-специфические запасы worniu-Gal4 (wor-G4 ) несущие конструкции на третьей хромосоме, а также линию 867, которая является мутантом для генного брата, расположенного на втором Хромосомы.
      1. Сделайте три отдельных креста, разместив в трех различных пищевых флаконах 5 самцов из UAS-Brat, wor-G4 и 867 линий и добавьте к каждому набору самцов 10-15 девственных самок от линии, несущей маркеры и балансеры для второго и третьи хромосомы(Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL59967).
      2. Соберите 10-15 девственных самок из F1 каждого креста со следующими генотипами: q/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, q/CyO; wor-G4/Tm3,sb и 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, q/Sp; wor-G4/Tm3,sb и 867/CyO;
      3. Крестколлектированный Q/CyO; UAS-брат/Tm3, sb девственные женщины к q/Sp; UAS-брат/Tm3, sb мужчины; в отдельном флаконе сделать второй крест с q/CyO; wor-G4 /Tm3, sb девственные женщины к q/Sp; wor-G4/Tm3, sb мужчины и после этого в третьем кресте флакона 867/CyO;/Tm3,sb девственные женщины и 867/CyO;
      4. Из F1 каждого из этих крестов соберите как самцов, так и самок следующих генотипов: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb от первого креста, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb от второго креста и 867/CyO; Dr/Tm3,sb от второго креста.
      5. Выполните окончательный крест между братьями и сестрами, собранными от каждого потомства F1, чтобы установить постоянные двойные сбалансированные запасы для всех трех линий.
    2. Объедините UAS-brat и wor-G4 с мутацией 867.
      1. Соберите достаточное количество (20-30 мух) девственных самок из 867/CyO; Dr/Tm3,sb двойной сбалансированный запас для выполнения двух крестов.
      2. Поместите 10-15 девственных самок с мужчинами no5 от Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (кросс #1) и во втором флаконе 10-15 девственных самок с 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3, sb самцы.
      3. Соберите братьев и сестер из F1 каждого креста со следующими генотипами: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb от креста #1 и 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb от креста #2. Используйте собранные F1 потомство от каждого креста, чтобы установить постоянные запасы, пересекая братьев и сестер между ними.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После этого заключительного шага, запасы для 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb и 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb должны быть сгенерированы.
    3. Выполните спасательный эксперимент.
      1. Соберите 15-20 девственных самок из 867/CyO; wor-G4/Tm3, запас и перекрестите их 5-10 самцов со склада 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. В качестве контроля, крест No 15-20 девственных самок из 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb и No 15-20 девственных самок из 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb линия только к линии 867/CyO.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 867 мух несут чувствительный к температуре аллель мальчишки, а спасательный крест должен быть выполнен при температуре 29 градусов по Цельсию.
      2. Соберите следующее потомство F1 от каждого креста, тщательно отбирая отмеченные балансы: 867/867; wor-G4/UAS-brat (спасение), 867/867; wor-G4/' (контроль) и 867/867; UAS-брат/з (контроль).
      3. Возраст мух по желанию на 29 градусов по Цельсию и выполнять гистологический анализ на мозг, чтобы искать нейродегенерации с помощью протокола, описанного в разделе 4 (Протокол 3).
  2. Выполняйте возрастно-зависимый анализ нейродегенерации у 867 мутантов.
    1. Соберите 867;pcna-GFP и yw управления мухи, которые несут репортер гена (pcna-GFP ) и жизнеспособны при 25 "C и проявлять как более высокую penetrance и более высокую выразительность фенотипа нейродегенерации, чем 867 только в этом температура17.
    2. Возраст мух до 5, 15 и 25, как описано в разделе 1.4 и выполнять последующий гистологический анализ, следуя протоколу в разделе 4 (Протокол 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом aerticle, мы представляем шаги, используемые для выявления опухоли мозга гена(brat) как играющий роль в поддержании целостности нейронов (например, нейропротекция) у взрослых мух17; методология, которая может быть использована для выявления генов, участвующих в нейропротекции. Мы использовали вперед генетический подход (стратегия изложена на рисунке 1A) для проверки через коллекцию химически мутагенизированных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Вперед генетические экраны в Drosophila были эффективным подходом для выявления генов, участвующих в различных биологических процессов, в том числе возрастной нейропротекции5,23,24, 25. Используя эту стратегию, мы были успешны в определении мальчишка, как новый нейропротекторный ген17.

Одним из важнейших шагов в этом протокол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы особенно признательны доктору Барри Ганецки, в лаборатории которого был проведен генетический экран, что позволило идентифицировать и охарактеризовать мальчишку как нейропротекторный ген. Мы благодарим д-ра Стивена Робиноу за любезное предоставление коллекции энагенизированных мух, используемых в генетическом экране, представленном в этой статье. Мы благодарим членов лаборатории Ганецки, д-ра Грейс Боехофф-Фалк и Дэвида Вассармана за полезные обсуждения на протяжении всего проекта, Линг Линг Хо и Боба Кребера за техническую помощь, д-ра Аки Икеды за использование его микротомного объекта в Университет Висконсина и д-р Ким Lackey и оптический анализ фонда в Университете штата Алабама.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильное>основное оборудование
вытяжной шкаф для гистологии
Световой микроскопNikonEclipe E100Предпочтительный объектив для визуализации 20x
Программное обеспечение для визуализацииNikon
Микроскоп Фотоаппарат Nikon ТермоциклерEppendorf
Fly Pushing and climbing assay
VWR® Флакон для дрозофилы, узкийVWR75813-160
VWR® Лабораторная маркировочная лента общего назначенияVWR89097-912
Стандартный коврик
СтереоскопМотикМодель SMZ-168
CO2 анестезиологическая станция (Blowgun, ножной клапан, Ultimate Flypad)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172Doesn' Щетки
тонким наконечникомSOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila ИнкубаторVWR89510-750
Gene mapping
CantonSBloomington Drosophila Stock Center9517
w1118Bloomington Drosophila Stock Center5905
yw Bloomington Drosophila Stock Center6599
Drosophila линия, используемая для рекомбинационного картированияBloomington Drosophila Stock Center3227Генотип: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] Bloomington Drosophila Stock Center2555Линия балансировщика дрозофилы, используемая для рекомбинационного картирования
дефицита Набор для хромосомы2L Bloomington Drosophila Stock CenterDK2LCook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%)Thermo Fischer ScientificA4094
ChloroformThermo Fischer ScientificC298-500
Ледяная уксусная кислотаThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand™   Микроцентрифужные пробирки премиум-класса: 1,5 млThermo Fischer Scientific05-408-129
Очищающий агент Histochoice 1xVWR Life Sciences97060-934
Harris HematoxylinVWR95057-858
EosinVWR95057-848
Thermo Scientific&торговля;   Ричард-Аллан Scientific™ Монтаж MediumThermo Scientific&торговля; 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Предметные стекла для микроскопа Unifrost Poly-L-Lysine, 75 мм x 25 мм x 1 мм, EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand™   Крышка Стекла: ПрямоугольникиFisherbrand12-545MРазмеры: 24 мм x 60 мм
Отслеживаемый таймерVWR
Подогреватель слайдовBarnstead Internationalмодель No 26025
Поднос и стеллажиDWK Life SciencesСтеллаж для хранения 20 слайдов
Fisherbrand™   Универсальные удлиненные щипцыFisherbrand10-316A
Kimwipes™Kimberly-Clark™ Профессионалы 
6-дюймовые аппликаторы PuritanHardwood Products Company, Гилфорд, Мэн807-12
VWR® Бритвенные лезвияVWR55411-050
Tupperware или стеклянные емкости для гистологических жидкостей16 + 1 для проточной воды
Высокопрофильные микротомные лезвия с покрытиемVWR95057-834
Corning™   Круглое ведро для льда с крышкой, 4 лCorning™
Стаканили другой контейнер для ледяной воды и кассет
Tissue BathPrecision Scientific Company66630
MicrotomeLeica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV гель и система для очистки ПЦРPromegaA9282
Ex Taq ДНК-полимеразаTaKaRa5 U/μ l
Invitrogen™   СИБР&трейд; Safe™ Окрашивание гелем ДНК   Invitrogen™
UltraPure™ Агароза  Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen™
Программное обеспечениеEditor доступно для бесплатной загрузки
Statistical analysis
R пакет
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]Bloomington Drosophila Stock Center59967
для мыши с для баллона CO2 ApE-A Plasmid программ

Ссылки

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21(2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816(2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Тест на способность к лазаниюгистологический анализкартирование дефицитовсеквенирование ДНКфиксатор Карноязаливка парафиномокрашивание гематоксилином
В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.