Здесь представлены протоколы для биохимических анализов in vitro с использованием этикеток биотина, которые могут быть широко применимы для изучения белково-нуклеиновых кислотных взаимодействий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В vitro биохимические анализы с использованием биотина этикетки для изучения белково-нуклеиновой кислоты взаимодействия
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белково-нуклеиновые кислоты взаимодействия играют важную роль в биологических процессах, таких как транскрипция, рекомбинация, и метаболизм РНК. Экспериментальные методы изучения белково-нуклееновых кислотных взаимодействий требуют использования флуоресцентных меток, радиоактивных изотопов или других меток для обнаружения и анализа конкретных молекул-мишеней. Биотин, нерадиоактивный ярлык нуклеиновой кислоты, обычно используется в электрофоретической перекосной анализов (EMSA), но не регулярно используется для мониторинга активности белка во время нуклеиновых процессов. Этот протокол иллюстрирует полезность маркировки биотина во время ферментативных реакций in vitro, демонстрируя, что эта этикетка хорошо работает с целым рядом различных биохимических анализов. В частности, в соответствии с предыдущими выводами с использованием радиоизотопа 32P-маркированных субстратов, это подтверждается с помощью биотина помечены EMSA, что MEIOB (белок, специально участвующих в мейотической рекомбинации) является ДНК-связывающей белка, что MOV10 (an Рнк helicase) разрешает биотин-маркированные структуры дуплекса РНК, и что MEIOB расщепляет биотин-маркированную одноцепочечную ДНК. Это исследование показывает, что биотин способен заменить 32P в различных нуклеиновой кислоты связанных биохимических анализов в пробирке.
Введение
Белково-ядерные кислоты взаимодействия участвуют во многих важных клеточных процессов, таких как ремонт ДНК, репликация, транскрипция, обработка РНК, и перевод. Белковые взаимодействия с конкретными последовательностями ДНК в хроматине необходимы для жесткогоконтроля экспрессии генов на транскрипционном уровне 1. Точная посттрансконсальная регуляция многочисленных кодирования и некодирования РНК требует обширных и сложных взаимодействий между любым белком и РНК2. Эти слои регулятивного механизма экспрессии генов составляют каскад динамических межмолекулярных событий, которые координируются взаимодействием транскрипционны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Препарат протеина
- Конструкции экспрессий MEIOB и MOV10
- Создание cDNA-выражении конструирует кодирующую мышь MEIOB-A, C и E(рисунок 1A)и MOV10.
- Нарань реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого фрагмента. Смешайте 1 кДНК мыши (от C57BL/6 мыслят testis), 1 л dNTP, 2 Зл из 10 мкм вперед грунтовка, 2 Зл из 10 ММ обратной грунтовки, 1 л ПОЛимеразы ДНК, 25 л 2x буфера ПЦР, и 18 л двойной дистиллированной H2O (ddH2O) в финале объемом 50 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для усиления фрагментов генов Meiob и Mov10 перечислены в таблице 1.
- Нарань реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого фрагмента. Смешайте 1 кДНК мыши (от C57BL/6 мыслят testis), 1 л dNTP, 2 Зл из 10 мкм вперед грунтовка, 2 Зл из 10 ММ обратной грунтовки, 1 л ПОЛимеразы ДНК, 25 л 2x буфера ПЦР, и 18 л двойной дистиллированной H2O (ddH2O) в финале объемом 50 л.
- Создание cDNA-выражении конструирует кодирующую мышь MEIOB-A, C и E(рисунок 1A)и MOV10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Белковая структура MEIOB и выражения конструкций, используемых в этом исследовании иллюстрируются на рисунке 1A. OB складки в MEIOB являются компактными баррель-подобных структур, которые могут распознавать и взаимодействовать с одноцепочечными нуклеиновой кислоты. Один из областей ОБ (aa 136-307, построить) связывает одной мель ДНК (ssDNA), усеченный белок (аа 136-178 усечения, построить C) и точка мутантформе (R235A мутации, построить E) MEIOB. Белк.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Исследование взаимодействия белково-нуклеиновой кислоты имеет решающее значение для нашего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе различных биологических процессов. Например, MEIOB является яичка конкретных белка, необходимого для мейоза и плодородия у млекопитающих25,26,27. MEIOB содержит OB домен, который связывается с одноцепочечной ДНК и экспонатов от 3'до 5' экзонуклизировать деятельности26
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не декларируются.
Благодарности
Мы благодарим. Джереми Вана (Университет Пенсильвании) за полезные edits и обсуждения. Мы также благодарим Сигрид Экардт за редактирование языка. К. З. была поддержана Национальной программой исследований и разбироков Китая (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) и Национальным фондом естественных наук Китая (31771653). Л. Я. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (81471502, 31871503) и инновационной и предпринимательской программой провинции Цзянсу. J. N. была поддержана Чжэцзянской медицинской научно-технической проекта (2019KY499). М.Л. был поддержан грантами Национального фонда естественных наук Китая (31771588) и планом 1000 молодежных талантов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Оборудование | |||
| центрифуга | Eppendorf, Германия | 5242R | |
| Хемилюминесцентная система визуализации | Tanon, Китай | 5200 | |
| Цифровой сонифер | Branson, США | BBV12081048A | 450 Вт; 50/60 Гц |
| Полусухой электрофоретический промокатель | Hoefer, США | TE77XP | |
| Трубчатый револьвер | Кристалл, США | 3406051 | |
| УФ-светом сшивающий агент | UVP, США | CL-1000 | |
| Материалы | |||
| Amicon Ультра-4 Центробежный фильтр | Milipore, США | UFC801096 | 4 мл/10 К |
| Нейлоновая мембрана | Thermo Scientific, США | TG263940A | |
| обработанная TC культуральная чашка | Corning, США 430167 | 100 мм | |
| Обработанная TC питательная чашка | Corning, США | 430597 | 150 мм |
| Микропробирки пробирки | AXYGEN, США | MCT-150-C | 1,5 мл |
| Пробирки | Corning, США | 430791 | 15 мл |
| <сильно>реагенты | |||
| ampicillin | SunShine Bio, Китай | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 магнитные шарики | Sigma, США | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, США | 591136 | |
| BCIP/NBT набор для разработки красителей щелочной фосфатазы | Beyotime, Китай | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Реагент | Sigma, США | 107M4071V | |
| ClonExpress II одношаговый набор для клонирования | Vazyme, China | C112 | |
| Набор для обнаружения хемилюминесцентных нуклеиновых кислот | Thermo Scientific, США | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, США | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, США | 10569044 | |
| DPBS буфер | Gibco, США | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, США | AM9260G | 0,5 М |
| Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА | Roche, США | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, Китай | DC202 | |
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, Китай | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, США 10437028 | ||
| FLAG пептид | Sigma, США | F4799 | |
| Glycerin | Sigma, США | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, США | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, США | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, США | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, Китай | 127-08-02 | |
| Липофектамин 3000 Реагент для трансфекции | Thermo Scientific, США L3000001 | ||
| MgCl2 | Invitrogen, США | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, США | AM9759 | 5 М&nбсп; |
| NP-40 | Amresco, США | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, США | 31985062 | |
| PBS | Gibco, США | 10010023 | ингибитор РНазы PH 7,4 |
| Promega | , США | N251B | |
| стрептавидин щелочная фосфатаза | Promega, США | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, США | 15581044 | |
| Буфер Tris-HCI | Invitrogen, США | 15567027 | 1 мес, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, США | 15568025 | 1 мес, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, Китай | A600560 |
Ссылки
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
