Методическая статья

Очистка высокой урожайности Внеклеточных Препаратов Весикл вдали от вируса

11.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59876

⸱

12 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол изолирует внеклеточные пузырьки (EVs) от virions с высокой эффективностью и выходом путем включения EV осадков, градиента плотности ультрацентрифугирования, и захвата частиц, чтобы обеспечить рациональный рабочий процесс и сокращение начала требований к объему, что приводит к воспроизводимым препаратам для использования во всех исследованиях EV.

Аннотация

Одним из основных препятствий в области внеклеточного исследования везикулы (EV) сегодня является способность достичь очищенных препаратов EV в условиях вирусной инфекции. Представленный метод предназначен для изоляции ЭВ от вирионов (т.е. ВИЧ-1), что позволяет повысить эффективность и урожайность по сравнению с обычными методами ультрацентрифирования. Наш протокол содержит три шага: осадки EV, разделение градиента плотности и улавливание частиц. Анализы вниз по течению (т.е. западная поместье и ПЦР) могут быть запущены непосредственно после захвата частиц. Этот метод выгоден по сравнению с другими методами изоляции (т.е. ультрацентрифугированием), поскольку он позволяет использовать минимальные начальные тома. Кроме того, он более удобен для пользователя, чем альтернативные методы изоляции EV, требующие нескольких ультрацентрифугации. Тем не менее, представленный метод ограничен в своей сфере функциональных анализов EV, так как трудно вычерковать нетронутые ЭВ из наших частиц. Кроме того, этот метод разработан в строго научно-исследовательских условиях и не будет коммерчески жизнеспособным.

Введение

Исследования вокруг внеклеточных пузырьков (EVs), в частности экзосомы, тип EV в диапазоне 30-120 нм и характеризуется наличием трех тетраспанина маркеров CD81, CD9, и CD63, в значительной степени формируется в результате разработки методов изолировать и очистить пузырьки интереса. Способность вскрывать многогранные механизмы была затруднена из-за сложных и трудоемких методов, которые генерируют образцы, состоящие из разнородной популяции пузырьков, генерируемых различными путями с широким диапазоном содержимого, размеров и Плотности. Хотя это вопрос для почти всех исследований EV, это особенно важно при изучении EVs в контексте вирусной инфекции, как virions и вирусоподобных частиц (VLPs) может быть похож по диаметру на пузырьки интереса. Например, вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) составляет около 100 нм в диаметре, что примерно такого же размера, как и многие типы Экв. По этой причине мы разработали новый рабочий процесс изоляции EV для решения этих вопросов.

Текущий золотой стандарт изоляции EV является ультрацентрифугированием. Этот метод использует различные злодеи везикулы, что позволяет пузырьков быть разделены центрифугации с дифференциальной осаждения частиц более высокой плотности по сравнению с частицами более низкой плотности на каждом этапе 1,2. Для удаления нетронутых клеток (300-400 х г на 10 мин), клеточного мусора (2000 х г на 10 мин) требуется несколько низкоскоростных шагов/крупных пузырьков (10 000 х г на 10 мин). Эти первоначальные очищения следуют высокоскоростной ультрацентрифугирования (100000-20000 х г для 1,5-2 ч) для отложений ЭВ. Стирки выполняются для дальнейшего обеспечения чистоты EV, однако, это приводит к сокращению числа изолированных EVs, тем самым снижая общую доходность 3,4. Полезность этого метода еще больше ограничена потребностью в большом количестве ячеек (примерно 1 х 108)и большом объеме выборки (Зтт; 100 мл) для достижения адекватных результатов.

Для решения растущих проблем, осадки пузырьков с гидрофильных полимеров стало полезным методом в последние годы. Полиэтиленгликоль (PEG), или другие связанные с ними реагенты осадков, позволяет пользователю снести пузырьки, вирусы и белковые или белковые РНК агрегаты в образце, просто инкубируя образец с реагентом выбора, а затем один низкоскоростной центрифугация1,2,5. Мы ранее сообщали, что использование PEG или связанных с ними методов для осаждения EVs по сравнению с традиционными ультрацентрифугация приводит к значительно более высокой урожайности6. Эта стратегия быстрая, легкая, не требует дополнительного дорогостоящего оборудования, легко масштабируема и сохраняет структуру EV. Однако, из-за беспорядочной природы этого метода, полученные образцы содержат разнообразие продуктов включая свободные протеины, комплексы протеина, ряд EVs, и virions таким образом требуя более дальнеишее очищение для того чтобы получить пожеланное населенность1 ,2,7,8.

Для преодоления неоднородности ЭВ, полученных из различных методов осадков, градиент плотности ультрацентрифугирования (DG) используется для лучшего разделения частиц на основе их плотности. Этот метод осуществляется с использованием поэтапного градиента с использованием градиентной среды плотности, такой как йодиксанол или сахароза, что позволяет отделять ЭВ от белков, белковых комплексов и вирусоподобных частиц (VLPs). Важно отметить, что, хотя когда-то считалось, что ГД допускает более точное разделение субпопуляций Ev, в настоящее время известно, что размеры и плотность различных пузырьков могут перекрываться. Например, экзосомы, как известно, имеют плотность флотации 1,08-1,22 г/мл9, в то время как везикулы, изолированные от Голги (COPI или clathrin)имеют плотность 1,05-1,12 г/мл и те из эндоплазмического ретикулума (COPII) ) осадки на 1.18-1.25 г/мл1,2,3,4,9. Кроме того, если желать сравнить экзосомальные фракции с фракциями, содержащими вирусные частицы, это может стать более трудным в зависимости от плотности вируса, интересующего, есть вирусы, кроме ВИЧ-1, которые, вероятно, уравновешивают сятко плотности как экзосомальные положительные фракции2.

Наконец, обогащение EV preps для визуализации вниз по течению и функциональных анализов имеет жизненно важное значение для исследований EV. Использование наночастиц, обогащающих EV, в частности многофункциональных частиц гидрогеля диаметром 700-800 нм, является важным шагом в достижении концентрированных препон EV. Они обладают высоким сродством ароматические приманки, которые инкапсулированы пористой внешней оболочки сито для содействия избирательности. Наночастицы, используемые в этом исследовании включают в себя два различных препаратов с различными приманками ядра (Реактивный красный 120 NT80; и Cibacron Blue F3GA NT82), которые показали, что увеличение захвата EVs из различных реагентов и биожидкости (см. таблицу материалов )6,10,11,12,13,14,15. Частицы предлагают легкое обогащение EVs из многочисленных исходных материалов, включая фракции йодиксанола, супернатант клеточной культуры, а также биожидкости пациента, такие как плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость (CSF), и моча6,13 .

Представленный здесь метод повышает эффективность современных методов очистки EV, объединяя несколько технологий; EV осадков, градиент аттестации плотности ультрацентрифугирования, и улавливания частиц, чтобы упорядочить рабочий процесс, уменьшить требования к выборке, и увеличить урожайность для получения более однородной образец EV для использования во всех исследованиях EV. Этот метод особенно полезен в исследовании EVs и их содержание во время вирусной инфекции, как она включает в себя 0,22 мкм фильтрации шаг, чтобы исключить большие, нежелательные пузырьки и VLPs и разделение общей популяции EV на основе плотности эффективно изолировать EVs от virions.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Фильтрация и осадки внеклеточных пузырьков (EVs)

  1. Для подготовки культуры супернатанта из инфицированных или трансинфицированных клеток (т.е. клеточных линий и/или первичных клеток), культура примерно 10 мл клеток позднего входа в течение 5 дней при 37 КС и 5% CO2 в соответствующей среде культуры (т.е. RPMI или DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все культуры средних реагентов должны быть свободны от ЭВ, и могут быть либо приобретены (см. Таблица материалов), или подготовлены в доме предварительно ультрацентрифугации сыворотки на 100000 х г в течение 90 мин. Этот протокол был успешным для нескольких широко используемых клеточных линий, включая: CEM, Jurkat, 293T, U937 (неинфицированные линии), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (ВИЧ-1 и HTLV-1 зараженных линий), несколько трансинфицированных клеток, а также первичные миелоидные и Т-клетки (оба инфицированных и неинфицированных); однако этот протокол может быть использован для любого типа клеток, включая те, которые требуют специализированных носителей или условий культуры. Плотность клеток может потребоваться оптимизировать для различных типов клеток. Рекомендуется использовать самую высокую плотность при минимальной гибели клеток через 5 дней.
  2. Centrifuge культуры на 3000 х г в течение 5 минут, чтобы клетки гранул и отказаться от гранул.
  3. Фильтр культуры супернатант с помощью стерильного 0,22 мкм фильтр и собирать фильтрвать в чистой трубке.
  4. Добавьте равный объем реагента ОСАго (коэффициент 1:1) к отфильтрованным супернатантам. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы обеспечить однородную смесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ вихрь.
  5. Инкубировать смесь при 4 градусах Цельсия на ночь (O/N).
  6. Смесь центрифугна при температуре 1500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) дает разнородные гранулы EV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы EV должны выглядеть белого или небелого цвета.
  7. Откажитесь от супернатанта культуры, истощенной EV.
  8. Приостановите действие гранул EV в 150-300 л 1x фосфат-буферизированного сольения без кальция и магния (PBS) и держите на льду.

2. Строительство градиента плотности

  1. Смешайте йодиксанол плотность градиента среды с 1x PBS для создания 11 различных 1 мл фракции плотности от 6 до 18% йодиксанол в 1,2% шагом в отдельных микроцентрифуговых труб, как показано на рисунке 1A.
  2. Vortex каждую трубку для смешивания.
  3. Слой плотности фракций в предварительно очищенных и сухих размахивая ведро ultracentrifuge трубки, начиная с фракции #18 и заканчивая фракции #6, как указано на рисунке 1B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все трубки должны быть продезинфицированы с помощью 10% отбеливателя спрей следуют затем полоскания 3x с деионизированной водой и окончательной стирки стерильной деионизированной воды до загрузки градиентных фракций.
  4. Добавьте вновь наложенные гранулы EV (300 л) к верхней части многослойного градиента в ультрацентрифуговой трубке.
  5. Ультрацентрифуге при 100,00 х г при 4 кв. м в течение 90 мин.
  6. Тщательно удалите 1 мл фракций из ультрацентрифуги трубки и передать каждую фракцию в новые микроцентрифугные трубки.

3. Обогащение EV Фракции uUsing наночастицы

  1. Создайте 30% наночастиц, используя равные объемы NT80, NT82 и 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна быть вихремпереданием перед использованием для обеспечения однородности.
  2. Добавьте 30 юл суспензии к каждой микроцентрифуговой трубке, содержащей фракции плотности и пипетки/инвертировать их несколько раз, чтобы смешать.
  3. Поверните EV-обогащающие наночастицы-содержащие фракционные фракции микроцентрифуговых труб O/N при 4 градусах Цельсия при примерно 20 об/мин.
  4. Плотность центрифуги фракции микроцентрифуговых труб оков при 20 000 х г в течение 5 мин на РТ.
  5. Отбросьте жидкость и дважды промойте эв-гранулы с помощью 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы наночастицы могут быть заморожены при -20 градусах цельсия или немедленно использованы для различных анализов вниз по течению (т.е. ПЦР, Западная поместья, масс-спектрометрия и другие анализы).

4. Рекомендуемая подготовка наночастицпелы для анализов вниз по течению

  1. Для изоляции РНК
    1. Приостановите пеллеты в 50 Л автоклавированной деионизированной воды, обработанной 0,001% диэтил-пирокарбоната (DEPC), фильтруемой через фильтр 0,2 мкм и изолировать РНК в соответствии с протоколом производителя комплекта.
  2. Для геля электрофореза
    1. Отрежь гранулы непосредственно в 15 л буфера Laemmli.
    2. Тепло образец 3x при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин. Vortex мягко и спина вниз между каждым теплового цикла.
    3. Centrifuge образец для 15 s на 20000 x g и загружают весь eluted материал сразу на гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов ограничьте количество частиц, загруженных на гель, и запустите гель при 100 В, чтобы обеспечить, чтобы все оставшиеся частицы содержались в скважинах.
  3. Для пищеварения трипсина
    1. Повторное увеличение гранул в 20 злител мочевины до алкилирования и трипсинизации образца. Наночастицы могут быть гранулированы 14000 х г центрифугации на RT в течение 10 мин. Образец, содержащий трипсионизированный пептид может быть перенесен в чистую трубку сбора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ОСАго PEG увеличивает выход EV
Наш комбинированный подход к изоляции EV значительно более эффективен с точки зрения восстановления EV по сравнению с традиционной ультрацентрифугией, о чем свидетельствует 90%-ное сокращение объема требуемого исходного материала. Ultracentrifugation, текущий золотой стандарт в изоляции EV, требует около 100 мл культуры супернатант производить адекватную подготовку EV для вниз по течению анализы, в то время как наш новый протокол требует ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изложенный метод позволяет повысить урожайность EV и отделить вирус от ЭВ с помощью комбинированного подхода к изоляции. Относительно большое количество исходного материала (т.е. супернатант клеток) может быть отфильтровано до изоляции EV путем выпадения осадков, разделения DG и обогащения наночастиц, что приводит к окончательному объему в 30 евро, что позволяет немедленно использовать в различных вниз по течению анализы. Использование обогащения наночастиц имеет важное значение, поскольку, по сравнению с традиционной ул...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

B.L. является аффилированным лицом Ceres Nanosciences inc., которая производит реагенты и/или инструменты, используемые в этой статье. Все остальные авторы не заявляют о каких-либо потенциальных конфликтах интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Кашанчи, особенно Гвен Кокс. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) Гранты (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, и NS099029 в Ф.К.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CEM CD4+ CellsNIH AIDS Reagent Program117CEM
DPBS без Ca и Mg (1x)Quality Biological114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1Реагент для осаждения ПЭГ
Экзосом-истощенный FBSThermo Fisher ScientificA2720801
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаПиковая сывороткаPS-FB3Сыворотка
ВИЧ-1 инфицированные U937 клеткиNIH Программа реагентов СПИДа165U1
Nalgene Шприц Фильтр 0,2 &; m SFCAThermo Scientific723-2520
Nanotrap (NT80)Ceres NanosciencesCN1030Реактивный красный 120 ядро
Nanotrap (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA ядро
Optima XE-980 УльтрацентрифугаBeckman CoulterA94471
OptiPrep Градиент плотности MediumSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti Ротор с качающимся ковшомBeckman Coulter331362
ультрапрозрачной трубе, 14 мм x 89 ммBeckman Coulter344059

Ссылки

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

1

Похожие статьи