Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Этот протокол изолирует внеклеточные пузырьки (EVs) от virions с высокой эффективностью и выходом путем включения EV осадков, градиента плотности ультрацентрифугирования, и захвата частиц, чтобы обеспечить рациональный рабочий процесс и сокращение начала требований к объему, что приводит к воспроизводимым препаратам для использования во всех исследованиях EV.

Abstract

Одним из основных препятствий в области внеклеточного исследования везикулы (EV) сегодня является способность достичь очищенных препаратов EV в условиях вирусной инфекции. Представленный метод предназначен для изоляции ЭВ от вирионов (т.е. ВИЧ-1), что позволяет повысить эффективность и урожайность по сравнению с обычными методами ультрацентрифирования. Наш протокол содержит три шага: осадки EV, разделение градиента плотности и улавливание частиц. Анализы вниз по течению (т.е. западная поместье и ПЦР) могут быть запущены непосредственно после захвата частиц. Этот метод выгоден по сравнению с другими методами изоляции (т.е. ультрацентрифугированием), поскольку он позволяет использовать минимальные начальные тома. Кроме того, он более удобен для пользователя, чем альтернативные методы изоляции EV, требующие нескольких ультрацентрифугации. Тем не менее, представленный метод ограничен в своей сфере функциональных анализов EV, так как трудно вычерковать нетронутые ЭВ из наших частиц. Кроме того, этот метод разработан в строго научно-исследовательских условиях и не будет коммерчески жизнеспособным.

Introduction

Исследования вокруг внеклеточных пузырьков (EVs), в частности экзосомы, тип EV в диапазоне 30-120 нм и характеризуется наличием трех тетраспанина маркеров CD81, CD9, и CD63, в значительной степени формируется в результате разработки методов изолировать и очистить пузырьки интереса. Способность вскрывать многогранные механизмы была затруднена из-за сложных и трудоемких методов, которые генерируют образцы, состоящие из разнородной популяции пузырьков, генерируемых различными путями с широким диапазоном содержимого, размеров и Плотности. Хотя это вопрос для почти всех исследований EV, это особенно важно при изучении EVs в контексте вирусной инфекции, как virions и вирусоподобных частиц (VLPs) может быть похож по диаметру на пузырьки интереса. Например, вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) составляет около 100 нм в диаметре, что примерно такого же размера, как и многие типы Экв. По этой причине мы разработали новый рабочий процесс изоляции EV для решения этих вопросов.

Текущий золотой стандарт изоляции EV является ультрацентрифугированием. Этот метод использует различные злодеи везикулы, что позволяет пузырьков быть разделены центрифугации с дифференциальной осаждения частиц более высокой плотности по сравнению с частицами более низкой плотности на каждом этапе ^1,2. Для удаления нетронутых клеток (300-400 х г на 10 мин), клеточного мусора (2000 х г на 10 мин) требуется несколько низкоскоростных шагов/крупных пузырьков (10 000 х г на 10 мин). Эти первоначальные очищения следуют высокоскоростной ультрацентрифугирования (100000-20000 х г для 1,5-2 ч) для отложений ЭВ. Стирки выполняются для дальнейшего обеспечения чистоты EV, однако, это приводит к сокращению числа изолированных EVs, тем самым снижая общую доходность ^3,4. Полезность этого метода еще больше ограничена потребностью в большом количестве ячеек (примерно 1 х 10⁸⁾и большом объеме выборки (Зтт; 100 мл) для достижения адекватных результатов.

Для решения растущих проблем, осадки пузырьков с гидрофильных полимеров стало полезным методом в последние годы. Полиэтиленгликоль (PEG), или другие связанные с ними реагенты осадков, позволяет пользователю снести пузырьки, вирусы и белковые или белковые РНК агрегаты в образце, просто инкубируя образец с реагентом выбора, а затем один низкоскоростной центрифугация^1,2,5. Мы ранее сообщали, что использование PEG или связанных с ними методов для осаждения EVs по сравнению с традиционными ультрацентрифугация приводит к значительно более высокой урожайности⁶. Эта стратегия быстрая, легкая, не требует дополнительного дорогостоящего оборудования, легко масштабируема и сохраняет структуру EV. Однако, из-за беспорядочной природы этого метода, полученные образцы содержат разнообразие продуктов включая свободные протеины, комплексы протеина, ряд EVs, и virions таким образом требуя более дальнеишее очищение для того чтобы получить пожеланное населенность^{1 ,2,7,8}.

Для преодоления неоднородности ЭВ, полученных из различных методов осадков, градиент плотности ультрацентрифугирования (DG) используется для лучшего разделения частиц на основе их плотности. Этот метод осуществляется с использованием поэтапного градиента с использованием градиентной среды плотности, такой как йодиксанол или сахароза, что позволяет отделять ЭВ от белков, белковых комплексов и вирусоподобных частиц (VLPs). Важно отметить, что, хотя когда-то считалось, что ГД допускает более точное разделение субпопуляций Ev, в настоящее время известно, что размеры и плотность различных пузырьков могут перекрываться. Например, экзосомы, как известно, имеют плотность флотации 1,08-1,22 г/мл⁹, в то время как везикулы, изолированные от Голги (COPI или clathrin⁾имеют плотность 1,05-1,12 г/мл и те из эндоплазмического ретикулума (COPII) ) осадки на 1.18-1.25 г/мл^1,2,3,4,9. Кроме того, если желать сравнить экзосомальные фракции с фракциями, содержащими вирусные частицы, это может стать более трудным в зависимости от плотности вируса, интересующего, есть вирусы, кроме ВИЧ-1, которые, вероятно, уравновешивают сятко плотности как экзосомальные положительные фракции².

Наконец, обогащение EV preps для визуализации вниз по течению и функциональных анализов имеет жизненно важное значение для исследований EV. Использование наночастиц, обогащающих EV, в частности многофункциональных частиц гидрогеля диаметром 700-800 нм, является важным шагом в достижении концентрированных препон EV. Они обладают высоким сродством ароматические приманки, которые инкапсулированы пористой внешней оболочки сито для содействия избирательности. Наночастицы, используемые в этом исследовании включают в себя два различных препаратов с различными приманками ядра (Реактивный красный 120 NT80; и Cibacron Blue F3GA NT82), которые показали, что увеличение захвата EVs из различных реагентов и биожидкости (см. таблицу материалов )^{6,10,11,12,13,14,15}. Частицы предлагают легкое обогащение EVs из многочисленных исходных материалов, включая фракции йодиксанола, супернатант клеточной культуры, а также биожидкости пациента, такие как плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость (CSF), и моча^6,13 .

Представленный здесь метод повышает эффективность современных методов очистки EV, объединяя несколько технологий; EV осадков, градиент аттестации плотности ультрацентрифугирования, и улавливания частиц, чтобы упорядочить рабочий процесс, уменьшить требования к выборке, и увеличить урожайность для получения более однородной образец EV для использования во всех исследованиях EV. Этот метод особенно полезен в исследовании EVs и их содержание во время вирусной инфекции, как она включает в себя 0,22 мкм фильтрации шаг, чтобы исключить большие, нежелательные пузырьки и VLPs и разделение общей популяции EV на основе плотности эффективно изолировать EVs от virions.

Protocol

1. Фильтрация и осадки внеклеточных пузырьков (EVs)

1. Для подготовки культуры супернатанта из инфицированных или трансинфицированных клеток (т.е. клеточных линий и/или первичных клеток), культура примерно 10 мл клеток позднего входа в течение 5 дней при 37 КС и 5% CO₂ в соответствующей среде культуры (т.е. RPMI или DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все культуры средних реагентов должны быть свободны от ЭВ, и могут быть либо приобретены (см. Таблица материалов), или подготовлены в доме предварительно ультрацентрифугации сыворотки на 100000 х г в течение 90 мин. Этот протокол был успешным для нескольких широко используемых клеточных линий, включая: CEM, Jurkat, 293T, U937 (неинфицированные линии), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (ВИЧ-1 и HTLV-1 зараженных линий), несколько трансинфицированных клеток, а также первичные миелоидные и Т-клетки (оба инфицированных и неинфицированных); однако этот протокол может быть использован для любого типа клеток, включая те, которые требуют специализированных носителей или условий культуры. Плотность клеток может потребоваться оптимизировать для различных типов клеток. Рекомендуется использовать самую высокую плотность при минимальной гибели клеток через 5 дней.
2. Centrifuge культуры на 3000 х г в течение 5 минут, чтобы клетки гранул и отказаться от гранул.
3. Фильтр культуры супернатант с помощью стерильного 0,22 мкм фильтр и собирать фильтрвать в чистой трубке.
4. Добавьте равный объем реагента ОСАго (коэффициент 1:1) к отфильтрованным супернатантам. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы обеспечить однородную смесь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ вихрь.
5. Инкубировать смесь при 4 градусах Цельсия на ночь (O/N).
6. Смесь центрифугна при температуре 1500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) дает разнородные гранулы EV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы EV должны выглядеть белого или небелого цвета.
7. Откажитесь от супернатанта культуры, истощенной EV.
8. Приостановите действие гранул EV в 150-300 л 1x фосфат-буферизированного сольения без кальция и магния (PBS) и держите на льду.

2. Строительство градиента плотности

1. Смешайте йодиксанол плотность градиента среды с 1x PBS для создания 11 различных 1 мл фракции плотности от 6 до 18% йодиксанол в 1,2% шагом в отдельных микроцентрифуговых труб, как показано на рисунке 1A.
2. Vortex каждую трубку для смешивания.
3. Слой плотности фракций в предварительно очищенных и сухих размахивая ведро ultracentrifuge трубки, начиная с фракции #18 и заканчивая фракции #6, как указано на рисунке 1B.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все трубки должны быть продезинфицированы с помощью 10% отбеливателя спрей следуют затем полоскания 3x с деионизированной водой и окончательной стирки стерильной деионизированной воды до загрузки градиентных фракций.
4. Добавьте вновь наложенные гранулы EV (300 л) к верхней части многослойного градиента в ультрацентрифуговой трубке.
5. Ультрацентрифуге при 100,00 х г при 4 кв. м в течение 90 мин.
6. Тщательно удалите 1 мл фракций из ультрацентрифуги трубки и передать каждую фракцию в новые микроцентрифугные трубки.

3. Обогащение EV Фракции uUsing наночастицы

1. Создайте 30% наночастиц, используя равные объемы NT80, NT82 и 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна быть вихремпереданием перед использованием для обеспечения однородности.
2. Добавьте 30 юл суспензии к каждой микроцентрифуговой трубке, содержащей фракции плотности и пипетки/инвертировать их несколько раз, чтобы смешать.
3. Поверните EV-обогащающие наночастицы-содержащие фракционные фракции микроцентрифуговых труб O/N при 4 градусах Цельсия при примерно 20 об/мин.
4. Плотность центрифуги фракции микроцентрифуговых труб оков при 20 000 х г в течение 5 мин на РТ.
5. Отбросьте жидкость и дважды промойте эв-гранулы с помощью 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы наночастицы могут быть заморожены при -20 градусах цельсия или немедленно использованы для различных анализов вниз по течению (т.е. ПЦР, Западная поместья, масс-спектрометрия и другие анализы).

4. Рекомендуемая подготовка наночастицпелы для анализов вниз по течению

1. Для изоляции РНК
   1. Приостановите пеллеты в 50 Л автоклавированной деионизированной воды, обработанной 0,001% диэтил-пирокарбоната (DEPC), фильтруемой через фильтр 0,2 мкм и изолировать РНК в соответствии с протоколом производителя комплекта.
2. Для геля электрофореза
   1. Отрежь гранулы непосредственно в 15 л буфера Laemmli.
   2. Тепло образец 3x при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин. Vortex мягко и спина вниз между каждым теплового цикла.
   3. Centrifuge образец для 15 s на 20000 x g и загружают весь eluted материал сразу на гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов ограничьте количество частиц, загруженных на гель, и запустите гель при 100 В, чтобы обеспечить, чтобы все оставшиеся частицы содержались в скважинах.
3. Для пищеварения трипсина
   1. Повторное увеличение гранул в 20 злител мочевины до алкилирования и трипсинизации образца. Наночастицы могут быть гранулированы 14000 х г центрифугации на RT в течение 10 мин. Образец, содержащий трипсионизированный пептид может быть перенесен в чистую трубку сбора.

Representative Results

Discussion

Изложенный метод позволяет повысить урожайность EV и отделить вирус от ЭВ с помощью комбинированного подхода к изоляции. Относительно большое количество исходного материала (т.е. супернатант клеток) может быть отфильтровано до изоляции EV путем выпадения осадков, разделения DG и обогащения наночастиц, что приводит к окончательному объему в 30 евро, что позволяет немедленно использовать в различных вниз по течению анализы. Использование обогащения наночастиц имеет важное значение, поскольку, по сравнению с традиционной ультрацентрифучения, эти EV-обогащения наночастиц, как было показано, захватить пузырьки более эффективно, что дает больше или равна количеству пузырьков от 1 мл культуры supernatant по сравнению с 10 мл ультрацентрифуги культуры супернатант¹⁵. В целом описанный протокол включает в себя сочетание нескольких хорошо известных методов и поэтому должен представлять ограниченные трудности. Тем не менее, включение EV-обогащающих наночастиц вводит новый метод, который может потребовать устранения неполадок и / или модификаций для достижения желаемых результатов в зависимости от вниз по течению ассс или биологической цели интереса. Мы рекомендуем инкубировать наночастицы с помощью фильтрованных клеточных супернационтов на ночь. Если целевой белок или РНК, представляющий интерес, имеет низкий объем в модельной системе, протокол может быть адаптирован для увеличения инкубационного периода для обеспечения захвата цели. Использование наночастиц в анализах вниз по течению, как правило, может быть достигнуто путем повторного приостановки гранулы в желаемом буфере образца для каждого анализа. Например, наночастицы могут быть перевешены непосредственно в буфере Laemmli для анализа западной помок. Захваченный материал должен быть более эффективно выемкой из наночастиц в SDS через нагревательные и вихревые циклы. Для достижения адекватного разделения белка следует позаботиться об ограничении количества наночастиц, загруженных в гель, и гель должен работать примерно при 100 В, чтобы обеспечить, чтобы все оставшиеся частицы содержались в скважинах. Кроме того, для визуализации белков с низким молекулярным весом, ночная влажная передача достигает оптимальных результатов. Хотя использование наночастиц приводит к значительному обогащению популяций везикул, необходимо предпринять дополнительные шаги, чтобы высветить захваченный материал из частиц. Кроме того, elution материала потенциально может ограничить полезность EVs в вниз по течению функциональных анализов, как многие elution буферов может повредить целостность мембраны EV. Необходимы дополнительные исследования для разработки стратегии, позволяющей удалять нетронутые пузырьки из наночастиц после инкубации. Другим недостатком этих частиц является отсутствие характеристик в настоящее время. Внешняя оболочка частицы была разработана, чтобы исключить молекулы высокого молекулярного веса. Тем не менее, конкретное таргетирование частиц на ЭВ не происходит, и в результате многие смешанные факторы и фоновые сигналы потенциально могут присутствовать в анализах вниз по течению.

Описанный метод в первую очередь будет использоваться в лабораторных целях. Недавно мы разработали альтернативные методы для расширения возможностей нашего комбинированного подхода к дополнительным методам изоляции ЭВ от мелкомасштабных биофлипов пациентов, таких как плазма и CSF, а также крупномасштабное коммерческое производство EV. Для изоляции ЭВ от вируса в материале пациента мы включили использование размеров исключения хроматографии (SEC) столбцов, которые используются вместо градиента плотности. Эти столбцы полезны тем, что они одноразовые и поэтому идеально подходят для лабораторий с высоким содержанием. Тем не менее, столбцы SEC разделяют частицы в зависимости от размера, поэтому из этого следует, что этот тип разделения применим только для разделения больших или очень маленьких вирусов, таких как EBOV (1 мкм) или ЗИКВ (40 нм), соответственно, от ЭВ или отделения от свободный белок. Что касается крупномасштабного производства Ev, то недавние достижения в области методов фильтрации, а именно тангенциальной фильтрации потока (ТФФ), позволили эффективно обезображять ЭВ от больших объемов выборки. TFF исторически использовался для очистки наноразмерных биомолекул, в том числе вирусов, и через оптимизацию протоколов эта система успешно адаптировалась для изоляции ЭВ^24,25. Кратко, во время процесса TFF, потоки жидкости образца касательно через поверхность полупроницаемой мембраны которая селективно сохраняет пузырьки основанные на размере и молекулярном весе, таким образом позволяющ для разъединения EVs далеко от свободных протеинов и других загрязняющих биомолекулы²⁶. По сравнению с ультрацентрифугированием, было сообщено, что TFF приводит к более высокой урожайности, меньше агрегации, и снижает много-много изменчивость EVs²⁷. Кроме того, использование TFF для хорошей производственной практики (GMP) класса изоляции EVs для терапевтического применения также было сообщено²⁸. Благодаря своей масштабируемости и воспроизводимости, эта технология предлагает большой потенциал для будущих исследований EV.

Вирусы бывают разных размеров и плотности, поэтому в зависимости от вируса, о котором идет речь, может потребоваться оптимизация этого протокола. Для очень больших вирусов, таких как Эбола (1 мкм или больше в длину), простая фильтрация может быть использована для удаления подавляющего большинства вирионов и крупных загрязняющих органов, таких как VLPs и апоптотические тела¹⁴. Это позволяет для большинства разделения вируса от EVs, чтобы быть исполняемым на переднем конце очистки. Однако в случае более мелких вирусов, таких как энтеровирус (30 нм), вирус Зика (40 нм), вирус гепатита В (42 нм), вирус гепатита С (55 нм) и другие, фракция, в которой осадок вирионов необходимо будет определить до дальнейшего снижения функционального Анализ. Нельзя всегда приблизить вероятную фракцию осадочных отложений, основанную только на диаметре частиц. Например, полиовирус, который составляет 30 нм в диаметре, также известно, инкапсулированы в секреторных аутофагосом^{29,30,31,32,33}, и, следовательно, вероятно, будет найден на правую сторону градиента (более плотные фракции), а не левую (менее плотные фракции). В то время как мы оптимизировали этот протокол в случае ВИЧ-1, HTLV-1 и EBOV VLPs, дополнительные вирусы потребуют характеристики для тонкой настройки протокола для их специфической очистки от EVs.

Протокол, изложенный здесь(Рисунок 4) позволяет впервые, пользователь отделить EVs от вируса с повышенной эффективностью и меньшие объемы исходного материала по сравнению с золотым стандартом изоляции EV, ультрацентрифугации. Этот метод может быть легко адаптирован к условиям, включая различные размеры выборки, требуемые урожаи, тип исходного материала (т.е. культурный супернатант по сравнению с терпеливым материалом) и различные различные вирусы разных размеров.

Materials

CEM CD4<sup>+</sup> Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 &micro;m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059