Никотинамид аденин динуклеотид (NADH) -связанный анализ ATPase был адаптирован к полувысокой пропускной скрининга малых ингибиторов миозина молекулы. Этот кинетический анализ проводится в формате микроплиты 384 колодца с общими объемами реакции всего 20 Лл на скважину. Платформа должна быть применима практически к любому ферменту ADP.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ферменты ATPase используют свободную энергию, хранящуюся в аденозинтрифосфате, чтобы катализировать широкий спектр эндергонных биохимических процессов in vivo, которые не будут происходить спонтанно. Эти белки имеют решающее значение для практически всех аспектов клеточной жизни, включая обмен веществ, деление клеток, реакцию на изменения окружающей среды и движение. Протокол, представленный здесь, описывает никотинамид аденин динуклеотид (NADH)-связанный анализ ATPase, который был адаптирован к полувысокой пропускной скрининг абиторы малых молекул АТПасе. Анализ был применен к сердечной и скелетной мышцы миозина II, два актин основе молекулярного двигателя ATPases, в качестве доказательства принципа. Гидролиз АТФ связан с окислением NADH ферментативными реакциями в ходе асссея. Во-первых, ADP, генерируемый ATPase, регенерируется в АТФ пирувате киназой (PK). ПК катализает переход фосфоненолпирувата (PEP) в пируват параллельно. Впоследствии пируват сводится к лактату при лактате дегидрогеназы (ЛДГ), которая катализает окисление NADH параллельно. Таким образом, снижение концентрации АТФ напрямую коррелирует со снижением концентрации NADH, за которым следует изменение внутренней флуоресценции NADH. До тех пор, как PEP доступна в системе реакции, концентрация ADP остается очень низкой, избегая ингибирования фермента ATPase своим собственным продуктом. Кроме того, концентрация АТС остается почти постоянной, что дает линейные временные курсы. Флуоресценция постоянно контролируется, что позволяет легко оценить качество данных и помогает отфильтровывать потенциальные артефакты (например, в результате сложных осадков или тепловых изменений).
Введение
Миозины механохимических преобразователей энергии, которые гидролизуют аденозин трифосфат (АТФ) для генерации направленного движения вдоль нитей актина цитоскелета в эукариотах1,2. Они имеют как структурно, так и кинетически адаптированы к их различных внутриклеточных функций, таких как транспорт органелл, сокращение мышц или генерации цитоскелетного напряжения1,2. Суперсемейка миозина представлена 40 генами миозина, принадлежащими к классумиосинов No12 в геноме человека 3,4. Члены классов миоз....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка фондовых растворов и реагентов
- Подготовка дитиотрейтол (DTT) бульонный раствор путем растворения кристаллического DTT в дистиллированной воде до конечной концентрации 1000 мм. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
- Подготовьте штучное решение АТС, растворив кристаллический АТС в дистиллированной воде до конечной концентрации 100 мМ. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
- Подготовка 10x NADH буфер, содержащий 70 мМ 3-(N-морфолино) пропанесульфоновой кислоты (MOPS), 10 мм MgCl2, 0,9 мМ этилен гликоль-бис (З-аминоэ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Типичная карта макета пластин, используемая для скрининговых экспериментов, показана на рисунке 1. Первая и последняя строки зарезервированы для калибровки NADH и положительного контроля (20 мкм пара-аминоблббистатин, 0,5% DMSO), соответственно. Остальные строки (B к O) используются для проверки ингибирующей активности соединений. Здесь готовятся и передаются из смежной пластины в тарелку 15-ступенчатые серийные 1:2 (0,5% ДМСО) на пластине асссея. Дл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в протоколе
Оптимизируйте расположение пластин, запустив несколько пластин только с отрицательным контролем (реакция ATPase без ингибитора). Тщательно проверяйте результаты на наличие закономерностей в темпах реакции. Например, они могут возникнуть в результате краевого эффекта и/или несовершенства в гидрофическом поверхностном покрытии "необязательных" пластин. При наблюдении шаблона измените тип пластины и/или макет пластины, чтобы свести к минимуму артефакт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального института неврологических расстройств и инсульта и Национального института по злоупотреблению наркотиками NS096833 (CAM).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 384-луночный Низкий фланец Черный Плоский Дно Полистирол NBS Микропластина | Corning | 3575 | |
| АТФ (Аденозин 5′-трифосфат динатрия Соль Гидрат) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Диспенсер | Aurora Discovery, Inc. | ||
| Biomek NXP Многоканальная автоматизированная лабораторная станция | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (бычья сыворотка альбумина, без протеазы) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Центрифуга 5430 R, охлаждаемая, с ротором FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Центрифуга 5430, не охлаждаемая, с ротором A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| ДМСО (диметилсульфоксидом) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-дитиотрейтол) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Многоканальный пипетка; 384-формат; 8-канальный | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Многоканальный пипетка; 96-формат; 8-канальный | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Считыватель многоканальных пластин | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Глицерин | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-лактатдегидрогеназа из мышц кролика) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (гексагидрат хлорида магния) | Вибростенд Sigma | M2670 | |
| VWR | 12620-926 | ||
| Микропланшет, 384 лунка, ПП, малый объем, глубокий колодец, натуральный | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (полная длина) (сердечная мышца крупного рогатого скота) | Цитоскелет | MY03 | |
| Моторный белок миозина (полная длина) (Скелетные мышцы кролика) | Цитоскелет | MY02 | |
| NADH (&бета;-никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный гидрат соли динатрия) | Sigma | N8129 | |
| NaN<суб>3 (азид натрия) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (гидроксид натрия) | Оптический фильтр Sigma | S8045 | |
| CFP 470/24 нм (излучение) | PerkinElmer | 2100-5850 | Штрих-код 240 |
| Оптический фильтр Fura2 380/10 нм (возбуждение) | PerkinElmer | 2100-5390 | Штрих-код 112 |
| Оптический модуль: бета лактамазы | PerkinElmer | 2100-4270 | Штрих-код 418 |
| Программное обеспечение OriginPro 2017 | OriginLab | н/д | |
| para-Аминоблеббистатин | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (соль фосфо(енола)пировиноградной кислоты монокалия) | Sigma | P7127 | |
| PK (пируваткиназа из мышц кролика) | Sigma | P9136 | |
| Порошок ацетона мышц кролика | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
Ссылки
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Po....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
