Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод изучения де Ново Формирование хрометинов доменов

5.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60039

⸱

23 августа 2019 г.

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

В этой статье

Краткое содержание

Этот метод предназначен для последующего формирования PRC2-опосредованных доменов хроматина в клеточных линиях, и метод может быть адаптирован ко многим другим системам.

Аннотация

Организация и структура доменов хроматина уникальны для отдельных клеточных линий. Их неправильное регулирование может привести к потере клеточной идентичности и/или болезни. Несмотря на огромные усилия, наше понимание формирования и распространения хроматина по-прежнему ограничено. Хроматин домены были изучены в условиях стабильного состояния, которые не способствуют после первоначальных событий во время их создания. Здесь мы представляем метод индуцирования хроматинов доменов и следовать их реформированию как функции времени. Хотя, сперва приложенное к случаю PRC2-опосредованного репрессивного образования домена chromatin, оно смогло легко быть приспособлено к другим доменам хроматина. Модификация и/или сочетание этого метода с геномикой и технологиями визуализации предоставит бесценные инструменты для детального изучения создания доменов хроматина. Мы считаем, что этот метод произведет революцию в нашем понимании того, как хроматины образуют и взаимодействуют друг с другом.

Введение

Эукариотические геномы хорошо организованы и изменения в доступностихроматина непосредственно контролируют транскрипцию генов 1. Геном содержит различные типы хроматиновых доменов, которые коррелируют с транскрипционной активностью и сроками репликации2,3. Эти хроматиндометы варьируются в размерах от нескольких килобаз (кб) до более чем 100 кб и характеризуются обогащением в различных модификациях гистона4. Главные вопросы: как формируются эти области и как они распространяются?

Один из наиболее хорошо охарактеризованных хроматина доменов поощряется через деятельность Поликомб репрессивного комплекса 2 (КНР2). КНР2 представляет собой многофункциональный комплекс, состоящий из подмножества Polycomb Group (PcG) белков5,6, и катализирует моно-, ди- и триметилирование лизина 27 гистон H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 связаны с репрессивным состоянием хроматина, но функция H3K27me1 неясна6,11. Один из основных компонентов PRC2, эмбрионального развития эктодерма (EED), связывает с конечным продуктом PRC2 катализ, H3K27me3, через его ароматические клетки, и эта функция приводит к аллостерической стимуляции PRC212,13. Ферментативная активность КНР2 имеет решающее значение для сохранения клеточной идентичности во время развития, так какнеуместное выражение определенных генов развития, которые противопоказаны для определенной линии, было бы пагубным 5,6 . Таким образом, распутывание механизмов, с помощью которых КНР2 способствует формированию репрессивных хроматинов у млекопитающих имеет основополагающее значение для понимания клеточной идентичности.

Все прошлые экспериментальные системы, предназначенные для исследования образования доменов хроматина, включая PRC2-опосредованные домены хроматина, были выполнены в условиях устойчивого состояния, которые не в состоянии отслеживать разворачивающиеся события образования доменов хроматина в Клетки. Здесь мы представляем подробный протокол для создания индуцируемой клеточной системы, которая отслеживает первоначальный набор и распространение хроматина доменов. В частности, мы фокусируемся на отслеживании формирования PRC2-опосредованных репрессивных доменов хроматина, которые составляют H3K27me2/3. Эта система, которая может захватить механистические детали образования доменов хроматина, может быть адаптирована для включения других областей хроматина, таких как широко изученные домены, включающие либо H2AK119ub или H3K9me. В сочетании с геномикой и технологиями визуализации, этот подход имеет потенциал для успешного решения различных, ключевых вопросов в биологии хроматина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Поколение индуцируемого EED спасательных mESCs

1. Культура клеток

  1. Используйте feeder-free C57BL/6 мыши эмбриональных стволовых клеток (mESCs), обладающих застойно интегрированных TransERT2 трансген, который может перемещаться в ядро при администрации 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Выращивайте mESCs в обычной среде ESC14,15, дополненный 1000 U/mL LIF, 1 ингибиторОМ ERK PD0325901 и 3 ингибитором ММ GSK3 CHIR99021. Для обычной среды ESC используйте нокаутD-MMEM, содержащий 15% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2 мМ L-глютамин, 1X пенициллин/стрептомицин и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол.
  3. Используйте пластины с покрытием 0,1% желатина раствор для культивирования mESC.

2. Поколение клональных EED нокаут (KO) mESCs

  1. Дизайн руководство РНК (gRNAs), чтобы удалить Exon 10 и Exon 11 эндогенной копии EED в mESCs с помощью инструмента дизайна CRISPR в Бенчлинг16. EED-KO-gRNA-1 цели интрон сразу вверх по течению exon 10 и EED-KO-gRNA-2 цели интрон непосредственно вниз по течению Exon 11. Одновременное применение этих gRNA удаляет как Exon 10, так и Exon 11 путем негомомного конечного присоединения (NHEJ).
  2. Клон gRNAs в pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) с использованием инструкций в Ран и др., 201317.
  3. В формате 6-колодцвой пластины, трансфект 2 х 105 mESCs с 1 мг каждого EED-KO-gRNA-1 и EED-KO-gRNA-2 (см. Таблица материалов) с использованием трансфекционного реагента, следуя инструкциям производителя. Измените медиа2 ч после трансфекции.
  4. Через два дня после трансфекции изолировать положительные клетки GFP с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией (FACS). Ожидать, что эффективность трансфекции варьироваться около 10-30%. Сортировать около 5 х 105 ячеек, чтобы захватить достаточно ЕФП положительные ячейки для покрытия.
  5. Плита изолированных GFP положительных mESCs в 15 см пластин предварительно покрытием с 0,1% желатин (10-20 x103 клетки на тарелку) для колонии сбор.
  6. Выращивайте клетки в среде ESC в течение примерно одной недели, пока не будут видны отдельные колонии. Меняйте средства массовой информации каждые 2 дня.
  7. Выберите как минимум 48 колоний, используя 20 наконечник микропипетты. Очистите над колонией, а усполивая в микропипетку наконечник. Не разбивайте колонию на единичные камеры. Перенесите колонию в аккутазу-содержащую (20 мл) 96 скважину.
  8. Инкубировать колонии в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия, пока все клетки не будут разобщены.
  9. Добавьте 200 мл средств esC в каждую скважину с помощью многоканального пипетка.
  10. Хорошо перемешайте и раздельно на две отдельные пластины из 96 колодцев с помощью многоканальных пипетков.
  11. Используйте одну из 96 пластин скважины для генотипирования и держать другие растет до генотипирования не будет заключен. Используйте раствор экстракции ДНК для извлечения ДНК из пластины 96 скважин, следуя инструкциям производителя.
  12. Используйте генотипирование грунтовки Gnt'EED-KO-Up и Gnt'EED-KO-down, которые охватывают удаленный сайт и выполнять генотипирование ПЦР с полимеразой ДНК Taq следуя инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы полимеразы ДНК также могут быть использованы для генотипирования, однако, Taq ДНК полимеразы предлагает удобство, как реакция ПЦР может быть непосредственно загружен на гель, когда его цветной буфер реакции используется.
    1. Наблюдайте продукт дна более низкого молекулярного веса в клетках с гомозиготным удалением относительно случая дикого типа (WT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания КНР2 нулевых клеток, гомозиготное удаление экзонов 10 и 11 необходимо дестабилизировать и деградировать EED, существенное подразделение ядра PRC213. Эффективность таргетинга CRISPR составляет около 10%.
  13. Проверить удаление EED экзон 10 и 11 и потеря белка EED Секан секвенирования и западного blotting, соответственно.
  14. Подтвердите истощение EED и H3K27me2/me3 из хроматина в клетках EED KO с помощью антител против H3K27me2/me3 и EED. Используйте протокол, приведенный в Oksuz et al., 201715 для экспериментов ChIP-seq.

3. Проектирование EED нокаут mESCs гавани Cre-ERT2 на основе индуцируемого eED выражение

  1. Дизайн gRNA (EED-gRNA-индуцируемых) ввести разрез в пределах интрона после экзон 9 EED с помощью инструмента дизайна CRISPR в Бенчлинг16 (см. Таблица материалов).
  2. Клон gRNAs в pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) с использованием инструкций в Ран и др., 201317.
  3. Дизайн донорского шаблона ДНК, который включает в себя EED cDNA последовательность после экзон 9 и C-терминал Флаг-HA тег вверх по течению последовательности T2A-GFP, все в обратной ориентации по отношению к эндогенной последовательности генов.
    1. Фланк кассеты с сращивания-приемителя и последовательность полиаденилации вложенных между гетерологическими перевернутые локс-сайтов (lox66 и lox71)18.
    2. Включите по крайней мере 500 bp оружия гомологии с каждого конца. Разделите шаблон донора на 2 сегмента фрагментов гена gBlocks (см. gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" и gBlock-2-клетка-мутант "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") и собрать их в PCR Blunt вектор с использованием клонирования Gibson в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: gblock-2 содержит ароматические остатки (Y365) в клетке EED, что важно для взаимодействия с H3K27me312. gBlock-2-Wt содержит остатки дикого типа, в то время как gblock-2-клетка-мутант содержит клетку-мутант EED (Y365A), неспособную связываться с H3K27me3. Индуцируемое спасение WT EED обозначается как i-WT-r и индуцируемая клетка-мутант EED спасения обозначается как i-MT-r для удобства.
  4. В 6-колодцном формате пластины, трансфект 2 х 105 mESCs с 1 мг гРНК (EED-gRNA-индуцированных) и 1 мг шаблонов донора (i-WT-r или i-MT-r) с использованием трансфекционного реагента и изолировать G положительные клетки с помощью FACS.
  5. Выполните шаги 2.3-2.11, чтобы изолировать отдельные колонии, готовые к генотипированию для успешного таргетинга.
  6. Используйте генотипии праймеры Inducible-Genotype-FW-1 и Inducible-Genotype-REV-1, которые охватывают вставленную кассету и выполняют генотипирование ПЦР с помощью полимеразы Taq ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность таргетинга для CRISPR составляет около 10%.
    1. Подтвердите правильную интеграцию кассеты ПЦР с использованием Индуцируемого генотипа-FW-2 и индуцируемого генотипа-REV-2 праймеров, которые находятся за пределами оружия гомологии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гомозиготная интеграция кассеты необходима для эффективного спасения EED. Обратите внимание, что клетки с гомозиготной интеграции будет производить один большой продукт ДНК по сравнению с WT EED, который будет производить короткий продукт.
  7. Подтвердите интеграцию кассеты секвенированием Сэнгера.
  8. Подтвердите листать кассеты и выражение EED и других компонентов PRC2 ядра (например,, E'H2 и SU12) на 4-OHT администрации западного blotting.
  9. Подтвердите выражение T2A-GFP и процент флип по течению цитометрии. Обратите внимание, что выражение GFP свидетельствует о переворачивании кассеты и выражении EED.

4. После нуклеации и распространения активности КНР2 на хроматин

  1. Подтвердите, что i-WT-r и i-MT-r mESCs не имеют вытекающей экспрессии GFP по цитометрии потока. В случае вытекающей экспрессии GFP, изолировать GFP-отрицательные ячейки FACS перед началом эксперимента.
  2. Расширьте i-WT-r и i-MT-r mESCs на пять 15 см пластин (5x 106 ячеек на тарелку).
  3. Индуцировать экспрессию WT или клетки-мутанта EED путем введения 0.5 mM 4-OHT для 0 h, 12 h, 24 h, 36 h и 8 дней (одна пластина 15 сантиметров в условии). Изменение носителя после 12 ч для лечения дольше, чем 12 ч. Изолировать успешно рекомбинированных клеток FACS с помощью GFP. Отрегулируйте время лечения так, чтобы все условия были собраны сразу.
  4. Выполните ChIP-seq для H3K27me2, H3K27me3, чтобы исследовать их височные осаждения хроматина в ответ на повторное выражение WT или клетки-мутант EED. Используйте протокол ChIP-seq, включая подготовку библиотеки, подробно описанные в Oksuz et al., 201715.
  5. Используйте контроль с шипами в каждой выборке, чтобы обеспечить количественное сравнение между различными точками времени19.
    1. Для контроля шипов, используйте хроматин из Drosophila melanogaster (в соотношении 1:50 к chromatin, полученным mESC), а также drosophila специфические антитела H2Av (1 Л антител H2Av на 4 мкг дрозофилы хроматина в соответствии с инструкции производителя) в каждом образце.
    2. Подготовка хроматина из Дрозофилы таким же образом, как от mESCs с использованием протокола, подробно описанного в Oksuz и др., 201715.
  6. Карта последовательности читает для ChIP-seq к mm10 геном а также Bowtie 2 с использованием параметров по умолчанию20.
  7. Нормализация мыши ChIP-seq читает шип в Drosophila читать рассчитывает21. Рассчитайте коэффициент нормализации с шипами, используя следующую формулу: 1 x 106/уникальная дрозофила считывает. Ожидать, чтобы получить около 1 х 106Drosophila читать рассчитывает и 20 х 106 мышь читать рассчитывает за эксперимент.
    1. Не включайте дрозофила хроматин при секвенировании входных образцов.
  8. Используйте инструмент genomecov от bedtools для преобразования файла бам в bedgraph22. Далее, преобразовать кровать в Bigwig файл с помощью bedGraphToBigWig инструмент от USCS23,24. Смотрите следующий сценарий:
    gen'"путь к геному mm10"
    chr'"путь к мм10 хромосомразмерных размеров"
    inp'bam'"путь к вхотвому файлу бам "
    умножить »вычислить фактор нормализации шипа в»
    bedtools genomecov-bg-scale $multiply -ibam $inp'bam -g $gen
    сортировка -k1,1 -k2,2n output.bedGraph
    bedGraphToBigWig output'sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Визуализируйте ChIP-seq читать плотности, загрузив Bigwig файлы на браузере генома USCS24.

5. Мониторинг появления и роста очагов H3K27me3 в ядрах mESC

  1. Плита 1x 104 mESCs в 8-колодцкамеры слайды предварительно покрытием с 0,1% желатина.
  2. На следующий день начните выполнять последовательные индукции 4-OHT (0,5 мм), чтобы собрать клетки, выражающие EED для указанных временных точек (0 ч, 12 ч, 24 ч и 36 ч). Изменение носителя после 12 ч для лечения дольше, чем 12 ч.
  3. Исправьте mESCs с 4% параформальдегидом в фосфатно-буферном сольнике (PBS) при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин.
  4. Пермяки клетки с PBS/0.25% Тритон X-100 на RT в течение 30 мин.
  5. Блокклетки с PBS/5% сыворотки осла / 0,1% Тритон X-100 (блокирующий буфер) на RT в течение 30 минут.
  6. Разбавить H3K27me3 первичного антитела 1:500 в блокирующем буфере и добавить на клетки.
  7. Инкубировать клетки с первичными антителами на ночь при 4 градусах Цельсия.
  8. На следующий день выполните 3 смая с PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Разбавить вторичные антитела (Alexa fluor 595) 1:1000 в блокирующем буфере и добавить на клетки.
    1. Выполните все инкубационные работы в темноте в следующих шагах, как вторичные антитела, спряженные с Alexa Fluor светочувствительны.
  10. Инкубировать вторичное антитело в течение 2 ч на RT.
  11. Выполните 3 ямы с PBS/0.1% Triton X-100.
  12. Разбавить DAPI (1 мг/мл) 1:4000 с PBS/0,1% Triton X-100 и добавить на клетки.
  13. Инкубировать клетки с DAPI в течение 10 минут на RT.
  14. Смонтировать клетки с aqua горе.
  15. Изображение клеток с конфокальной микроскопией при увеличении 63X.
  16. Процесс и псевдо-цвет изображения с помощью распределения ImageJ, Фиджи25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общая схема условной спасательной системы
На рисунке 1 показана схема таргетинга для условного спасения клеток EED KO с помощью WT или клетки-мутанта (Y365A) EED, который выражается в эндогенном локусе EED. После выбивания EED, основной подразделение PRC2, что имеет важное значение для его стабильности и ферментативной деятельности, кассета в интрон следующие экзон 9 EED вводится (Рисунок 1). Кассета состоит из оставшейся 3'cDNA последователь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мощный подход к пониманию механистических деталей во время формирования данного домена хроматина, заключается в том, чтобы сначала нарушить домен, а затем отслеживать его реконструкцию в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время во время реконструкции, чтобы детально проанализировать происходящие события. Предыдущие исследования по области хроматина не могли разрешить такие события, поскольку они проводились в условиях стабильного состояния (например, сравнение дикого типа и генного нокаута). Здесь мы намеч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Д.Р. является соучредителем Constellation Pharmaceuticals и Fulcrum Therapeutics. Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Л. Валеса, Д. Озата и Х. Моу за пересмотр рукописи. D.R. Lab поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза и Национальными институтами здравоохранения (R01CA199652 и R01NS100897).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(Z)-4-гидрокситамоксифен (5 мг)SigmaH7904-5MGДля индукции экспрессии ЭДК
16% Параформальдегидный водный раствор (10x10 мл)Электронная микроскопияSciences 15710Для иммунофлуоресценции
2-меркаптоэтанолLifeTechnologies21985-023Для культуры мЭСК
2% раствор желатинаSigmaG1393-100млДля мЭСК культура
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech/FISHERAT 104-500Для культуры mESCs
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152Для иммунофлуоресценции
Aqua-Mount Mounting MediumFISHER/VWR41799-008Для иммунофлуоресценции
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKДля иммунофлуоресценции
DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) - 10 мгLife TechD1306Для иммунофлуоресценции
ингибитор ERK, PD0325901Stemgent04-0006Для культуры mESCs
Рекомбинантный мышиный белок LIFMillipore/FisherESG1107Для культуры mESCs стволовые
клетки FBS QualifiedAtlantaS10250Для культуры mESCs
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LДля донорской матрицы клонирование
ингибитора GSK3, CHIR99021Stemgent04-0004Для mESCs культуры
H3K27me2 (D18C8) кролика mABCell Signaling9728SАнтитело для ChIP-seq
H3K27me3Cell Signaling9733SАнтитело для ChIP-seq
Histone H2Av антитело (pAb)Активный мотив39715Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018Для культуры mESCs
L-глутаминSigmaG7513Для культуры mESCs
Lipofectamine 2000LifeTech11668019Для трансфекции
MangoTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21079Для генотипирования ПЦР
Нормальная ослиная сыворотка (10 мл)Jackson ImmunoResearch017-000-121Для иммунофлуоресценции
Пенициллин-стрептомицинSigma/RocheP0781Для культуры мЭСК
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Для клонирования гРНК
QuickExtract DNA Extraction растворLucigenQE0905Tдля генотипирования ПЦР Triton
X-100SigmaT8787-250ML
Набор для клонирования ПЦР Zero BluntThermo FisherK270020Для клонирования донорских шаблонов
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1Последовательность: ctctggctactactgtcaactag. гРНК объединяются для нокаута EED в C57BL/6 ESCs для систем i-WT-r и i-MT-r.
Последовательность EED-KO-gRNA-2: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. гРНК объединяются в пары для нокаута EED в C57BL/6 ESCs для систем i-WT-r и i-MT-r.
EED-gRNA-индуцируемаяпоследовательность: atggcaccccgaaattagaa. гРНК и донор для создания системы i-WT-r на фоне EED-KO.
i-WT-r Донорhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. гРНК и донор для создания системы i-WT-r в фоновом режиме EED-KO.
EED-gRNA-индуцируемаяпоследовательность: atggcaccccgaaattagaa. гРНК и донор для создания системы i-WT-r на фоне EED-KO.
i-MT-r Донорhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. гРНК и Донор для генерации системы i-MT-r на фоне EED-KO.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1Последовательность: ctgtaggctgccatctgtga. Аллель дикого типа позволит получить продукт размером 1,9 кб. Нокаутный аллель будет давать продукт в 200.н.
Gnt-EED-KO-REV-1Последовательность: agccagggctacacagagaa. Аллель дикого типа позволит получить продукт размером 1,9 кб. Нокаутный аллель будет давать продукт в 200.н.
Inducible_Genotype-FW-1Последовательность: tgcagtgaaacaaatttggaa. Когда казет вставлен, капсюли будут производить 1863.о. Аллель дикого типа будет производить продукт в ~200.о.
Inducible_Genotype-REV-1Последовательность: gagaggggtggcactgtaaa. Когда казет вставлен, капсюли будут производить 1863.о. Аллель дикого типа будет производить продукт в ~200.о.
Inducible_Genotype-FW-2Последовательность: ccccctctct. Когда кассета вставлена, капсюли будут производить 3200.о. Аллель дикого типа будет давать продукт в 1560.о.
Inducible_Genotype-REV-2Последовательность: atgcctgggtgaatgaaaaa. Когда кассета вставлена, капсюли будут производить 3200.о. Аллель дикого типа будет давать продукт в 1560.о.

Ссылки

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Формирование хроматиновых доменовхроматин под воздействием PRC2нокаут CRISPR-Cas9анализ методом проточной цитометриианализ ChIP-seqфлуоресцентная микроскопияэмбриональные стволовые клетки мышиделеция гена EEDиндукция 4-гидрокситамоксифеномдепонирование H3K27me3
Метод изучения де Ново Формирование хрометинов доменов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.