Этот метод предназначен для последующего формирования PRC2-опосредованных доменов хроматина в клеточных линиях, и метод может быть адаптирован ко многим другим системам.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод изучения де Ново Формирование хрометинов доменов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Организация и структура доменов хроматина уникальны для отдельных клеточных линий. Их неправильное регулирование может привести к потере клеточной идентичности и/или болезни. Несмотря на огромные усилия, наше понимание формирования и распространения хроматина по-прежнему ограничено. Хроматин домены были изучены в условиях стабильного состояния, которые не способствуют после первоначальных событий во время их создания. Здесь мы представляем метод индуцирования хроматинов доменов и следовать их реформированию как функции времени. Хотя, сперва приложенное к случаю PRC2-опосредованного репрессивного образования домена chromatin, оно смогло легко быть приспособлено к другим доменам хроматина. Модификация и/или сочетание этого метода с геномикой и технологиями визуализации предоставит бесценные инструменты для детального изучения создания доменов хроматина. Мы считаем, что этот метод произведет революцию в нашем понимании того, как хроматины образуют и взаимодействуют друг с другом.
Введение
Эукариотические геномы хорошо организованы и изменения в доступностихроматина непосредственно контролируют транскрипцию генов 1. Геном содержит различные типы хроматиновых доменов, которые коррелируют с транскрипционной активностью и сроками репликации2,3. Эти хроматиндометы варьируются в размерах от нескольких килобаз (кб) до более чем 100 кб и характеризуются обогащением в различных модификациях гистона4. Главные вопросы: как формируются эти области и как они распространяются?
Один из наиболее хорошо охарактеризованных хроматина доме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Поколение индуцируемого EED спасательных mESCs
1. Культура клеток
- Используйте feeder-free C57BL/6 мыши эмбриональных стволовых клеток (mESCs), обладающих застойно интегрированных TransERT2 трансген, который может перемещаться в ядро при администрации 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
- Выращивайте mESCs в обычной среде ESC14,15, дополненный 1000 U/mL LIF, 1 ингибиторОМ ERK PD0325901 и 3 ингибитором ММ GSK3 CHIR99021. Для обычной среды ESC используйте нокаутD-MMEM, содержащий 15% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Общая схема условной спасательной системы
На рисунке 1 показана схема таргетинга для условного спасения клеток EED KO с помощью WT или клетки-мутанта (Y365A) EED, который выражается в эндогенном локусе EED. После выбивания EED, основной подразделение PRC2, что имеет важное значение для его стабильности и ферментативной деятельности, кассета в интрон следующие экзон 9 EED вводится (Рисунок 1). Кассета состоит из оставшейся 3'cDNA последователь.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мощный подход к пониманию механистических деталей во время формирования данного домена хроматина, заключается в том, чтобы сначала нарушить домен, а затем отслеживать его реконструкцию в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время во время реконструкции, чтобы детально проанализировать происходящие события. Предыдущие исследования по области хроматина не могли разрешить такие события, поскольку они проводились в условиях стабильного состояния (например, сравнение дикого типа и генного нокаута). Здесь мы намеч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Д.Р. является соучредителем Constellation Pharmaceuticals и Fulcrum Therapeutics. Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы благодарим д-ра Л. Валеса, Д. Озата и Х. Моу за пересмотр рукописи. D.R. Lab поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза и Национальными институтами здравоохранения (R01CA199652 и R01NS100897).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| (Z)-4-гидрокситамоксифен (5 мг) | Sigma | H7904-5MG | Для индукции экспрессии ЭДК |
| 16% Параформальдегидный водный раствор (10x10 мл) | Электронная микроскопия | Sciences 15710 | Для иммунофлуоресценции |
| 2-меркаптоэтанол | LifeTechnologies | 21985-023 | Для культуры мЭСК |
| 2% раствор желатина | Sigma | G1393-100мл | Для мЭСК культура |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | Для культуры mESCs |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | Для иммунофлуоресценции |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | Для иммунофлуоресценции |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | Для иммунофлуоресценции |
| DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) - 10 мг | Life Tech | D1306 | Для иммунофлуоресценции |
| ингибитор ERK, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Для культуры mESCs |
| Рекомбинантный мышиный белок LIF | Millipore/Fisher | ESG1107 | Для культуры mESCs стволовые |
| клетки FBS Qualified | Atlanta | S10250 | Для культуры mESCs |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Для донорской матрицы клонирование |
| ингибитора GSK3, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Для mESCs культуры |
| H3K27me2 (D18C8) кролика mAB | Cell Signaling | 9728S | Антитело для ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Антитело для ChIP-seq |
| Histone H2Av антитело (pAb) | Активный мотив | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | Для культуры mESCs |
| L-глутамин | Sigma | G7513 | Для культуры mESCs |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | Для трансфекции |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | Для генотипирования ПЦР |
| Нормальная ослиная сыворотка (10 мл) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Для иммунофлуоресценции |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma/Roche | P0781 | Для культуры мЭСК |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Для клонирования гРНК |
| QuickExtract DNA Extraction раствор | Lucigen | QE0905T | для генотипирования ПЦР Triton |
| X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Набор для клонирования ПЦР Zero Blunt | Thermo Fisher | K270020 | Для клонирования донорских шаблонов |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Последовательность: ctctggctactactgtcaactag. гРНК объединяются для нокаута EED в C57BL/6 ESCs для систем i-WT-r и i-MT-r. | ||
| Последовательность EED-KO-gRNA-2 | : TAGGCTATGACGCAGCTCAG. гРНК объединяются в пары для нокаута EED в C57BL/6 ESCs для систем i-WT-r и i-MT-r. | ||
| EED-gRNA-индуцируемая | последовательность: atggcaccccgaaattagaa. гРНК и донор для создания системы i-WT-r на фоне EED-KO. | ||
| i-WT-r Донор | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. гРНК и донор для создания системы i-WT-r в фоновом режиме EED-KO. | ||
| EED-gRNA-индуцируемая | последовательность: atggcaccccgaaattagaa. гРНК и донор для создания системы i-WT-r на фоне EED-KO. | ||
| i-MT-r Донор | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. гРНК и Донор для генерации системы i-MT-r на фоне EED-KO. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Последовательность: ctgtaggctgccatctgtga. Аллель дикого типа позволит получить продукт размером 1,9 кб. Нокаутный аллель будет давать продукт в 200.н. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Последовательность: agccagggctacacagagaa. Аллель дикого типа позволит получить продукт размером 1,9 кб. Нокаутный аллель будет давать продукт в 200.н. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Последовательность: tgcagtgaaacaaatttggaa. Когда казет вставлен, капсюли будут производить 1863.о. Аллель дикого типа будет производить продукт в ~200.о. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Последовательность: gagaggggtggcactgtaaa. Когда казет вставлен, капсюли будут производить 1863.о. Аллель дикого типа будет производить продукт в ~200.о. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Последовательность: ccccctctct. Когда кассета вставлена, капсюли будут производить 3200.о. Аллель дикого типа будет давать продукт в 1560.о. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Последовательность: atgcctgggtgaatgaaaaa. Когда кассета вставлена, капсюли будут производить 3200.о. Аллель дикого типа будет давать продукт в 1560.о. |
Ссылки
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
