Методическая статья

Поколение вентрикулярно-как HiPSC-производные кардиомиоциты и высококачественные клеточные препараты для обработки кальция характеристика

DOI:

10.3791/60135

⸱

17 января 2020 г.

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем и проверяем метод последовательного создания надежных антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов и характеризуют их функции. Эти методы могут помочь в развитии механистического понимания сигнальных путей, обеспечить платформу для крупномасштабного скрининга наркотиков и надежно моделировать сердечные заболевания.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs) обеспечивают ценный источник человека для изучения фундаментальной науки кальция (Ca2 ")обработки и сигнализации пути, а также высокой пропускной способностью скрининга наркотиков и токсичности анализы. В этом виде мы предоставляем подробное описание методологий, используемых для создания высококачественных iPSC-CMs, которые могут последовательно воспроизводить молекулярные и функциональные характеристики в различных клеточных линиях. Кроме того, описан метод для надежной оценки их функциональной характеристики путем оценки свойств обработки Ca2. Низкий уровень кислорода (O2) условия, выбор лактата и длительное время в культуре производят высокую чистоту и высококачественные желудочковые кардиомиоциты. Подобно изолированным взрослым крысиным кардиомиоцитам (ARCMs), 3-месячный iPSC-CMs обладают более высокой амплитудой Ca2,, более быстрой скоростью повторного отправления Ca 2 '(decay-tau), и положительной люситропной реакцией на адренергическую стимуляцию по сравнению с 30 iPSC-CMs. Стратегия технически проста, экономична и воспроизводима. Она обеспечивает надежную платформу для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний и для крупномасштабного скрининга наркотиков для целевой Ca2 "обработки белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs) являются привлекательной человеческой основе платформы для моделирования большого разнообразия сердечных заболеваний в пробирке1,2,3,4,6,7,8. Кроме того, iPSC-CMs могут быть использованы для прогнозирования реакции пациентов на новые или существующие препараты, для проверки хит соединений, а также разработать новые персонализированные препараты9,10. Однако, несмотря на значительный прогресс, при использовании iPSC-CMs11необходимо учитывать ряд ограничений и проблем. Следовательно, методы улучшения протоколов дифференциации сердца, повышения эффективности и созревания iPSC-CMs, а также создания специфических подтипов кардиомиоцитов (желудочковые, предсердий и узлов) были интенсивно изучены и уже привели к многочисленным культурным стратегиям преодоления этих препятствий12,13,14,15.

Несмотря на надежность этих протоколов, основной проблемой для использования iPSC-CMs является воспроизводимость длительных и сложных процедур для получения высококачественных кардиомиоцитов, которые могут обеспечить такую же производительность и воспроизводимые результаты. Воспроизводимость имеет решающее значение не только при сравнении клеточных линий с различными генетическими фонами, но и при повторении клеточных и молекулярных сравнений одной и той же клеточной линии. Вариабельность клеток, такие как хорошо к колодцу различия в плотности iPSCs, может повлиять на дифференциацию сердца, генерации низкой урожайности и некачественных кардиомиоцитов. Эти клетки все еще могут быть использованы для проведения экспериментов, которые не требуют чистой популяции CMs (например, при выполнении переходных измерений Ca2'). Действительно, при выполнении электрофизиологического анализа, не-CMs не будет бить, ни спонтанно, ни под электрической стимуляции, так что будет легко исключить их из анализа. Однако, из-за низкого качества, iPSC-CMs могут показать измененные электрофизиологические характеристики (например, нерегулярные Ca2 "переходный, низкий Ca2" амплитуда), которые не из-за их генетического состава. Поэтому, особенно при использовании iPSC-CMs для моделирования сердечной болезни, важно не путать результаты некачественного СМ с фенотипом заболевания. Необходимы тщательные процессы скрининга и исключения до начала электрофизиологических исследований.

Этот метод включает в себя оптимизированные протоколы для создания высокой чистоты и высококачественных кардиомиоцитов и оценки их функции путем проведения переходных измерений Ca2 с использованием системы приобретения и анализа кальция и контрактности. Этот метод является простым, но мощным способом различать высокую эффективность и низкую эффективность подготовки iPSC-CM и обеспечить более физиологически релевантную характеристику человека iPSC-CMs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты с использованием взрослых кардиомиоцитов крыс в этом исследовании были проведены с утвержденными институциональных животных уход и использование комитета (IACUC) протоколов Icahn школы медицины на горе Синай. Взрослые крысы кардиомиоцитов были выделены из Sprague Dawley крысы сердца Лангендорф основе метода, как ранее описано16.

1. Подготовка средств массовой информации

  1. Подготовьте hiPSC-носители.
    1. Уравновесить добавку и базальную среднюю и комнатную температуру (RT). Убедитесь, что добавка полностью разморозилась. Смешайте 400 мл базальной среды и 100 мл добавки и процедите с помощью вакуумного фильтра, управляемого 0,22 мкм. Храните при 4 градусах По Цельсию и уравновешивать RT перед использованием.
  2. Подготовьте RPMI и B27.
    1. Уравновешивать B27 дополнения и базальной среде (RPMI 1640) на RT. Убедитесь, что дополнение размораживаются полностью. Смешайте 490 мл базальной среды и 10 мл 50-x добавки и процедите с помощью вакуумного фильтра 0,22 мкм. Храните при 4 градусах По Цельсию и уравновешивать RT перед использованием.
  3. Приготовьте rpMI и B27 (-) инсулин.
    1. Уравновешивать B27 (-) инсулин адобавка и базальной среды (RPMI 1640) на RT. Убедитесь, что дополнение разморожено полностью. Смешайте 490 мл базальной среды и 10 мл 50-x добавки и процедите с помощью вакуумного фильтра 0,22 мкм. Храните при 4 градусах По Цельсию и уравновешивать RT перед использованием.
  4. Подготовьте подборку мультимедиа (RPMI (-) глюкоза B27 и лактат).
    1. Уравновешивать B27 дополнения и базальной среды (RPMI 1640 (-) глюкозы) на RT. Убедитесь, что дополнение разморожено полностью. Смешайте 490 мл базальной среды и 10 мл 50-x добавки, добавьте лактат натрия 4 мм, образуя в стерильной воде, и процедите с помощью вакуумного фильтра 0,22 мкм. Храните при 4 градусах По Цельсию и уравновешивать RT перед использованием.
  5. Подготовка RPMI 20.
    1. Приспособите базальную среду (RPMI 1640) к RT. Mix сыворотки крупного рогатого скота (FBS) (20% конечной концентрации) и RPMI. Фильтр с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранить при 4 градусах Цельсия. Равновесие к RT перед использованием.
  6. Подготовка проходя средств массовой информации, добавив Rho-связанных, скручиваемые катушки, содержащие ингибитор белка киназы (ROCK) ингибитор (2 ММ конечной концентрации) в HIPSC средств массовой информации.
  7. Подготовьте D0-носители, добавив ингибитор ГСК-3, CHIR 99021 в RPMI и B27 (-) инсулиновые носители (10 км финала).
  8. Подготовьте D3 и D4 медиа путем смешивания RPMI b27 (-) инсулина сми с IWR-1 (5 мКм окончательный).
    ПРИМЕЧАНИЕ: D1 и D5 СМИ состоит из RPMI B27 (-) инсулина. D7 сми состоит из RPMI и B27.
  9. Подготовьте блокирующий буфер (2% булборда сыворотки крупного рогатого скота, 2% FBS, 0,05% NP-40 в фосфатно-буферном солине (PBS): В коническую трубку 50 мл добавьте 1 г BSA, 1 мл FBS, 49 мл PBS и 250 л NP-40. Смешайте до полного растворения.

2. Подготовка человека эмбриональной стволовой клетки (hESC) квалифицированных Матрица покрытием пластин и крышки

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги под стерилизованный капюшон культуры ткани.

  1. Оттепель hESC-квалифицированный матричной фондовой раствор ночь на льду при 4 градусах Цельсия. Обратитесь к листу спецификации продукта, чтобы определить соответствующие объемы aliquot, поскольку это может варьироваться в зависимости от запасов. Храните эти aliquots при -20 градусах по Цельсию в микроцентрифуговых трубках 1,5 мл.
  2. Для того, чтобы использовать матрицу для покрытия пластин или стеклянных покрывалок, сначала оттаивать аликвот ы на матрицу с квалификацией hESC при 4 кв. м в течение 30 мин.
  3. Aliquot 24 мл холодной Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM): питательная смесь F-12 (DMEM/F:12) средства массовой информации в 50 мл конической трубки.
  4. Смешайте холодные DMEM/F:12 с 2 мл стеклянной пипетки для того, чтобы охладить поверхность пипетки.
  5. Используя ту же пипетку, возьмите примерно 500-700 л холодных DMEM/F:12 и смешайте с квалифицированным матричной аликотом hESC в самой микроцентрифуговой трубке.
  6. После правильного смешивания, передача раствора в 50 мл конической трубки, содержащей холодный DMEM /F:12 и снова перемешать.
  7. Для стандартной 6 хорошо пластины, добавить 1 мл этой смеси для каждого колодца. Убедитесь, что скважина полностью покрыта. Оставьте пластины на RT под капотом культуры ткани, по крайней мере 30 минут. При желании храните при 4 градусах Цельсия сразу после покрытия в течение 1 недели и уравновешивают RT в течение 30 минут до использования.
  8. Для того, чтобы использовать пластины, аспирировать матрицу и заменить соответствующими носителями. Используйте немедленно.
  9. Храните стеклянные крышки в стерильной среде (например, внутри стерильного капюшона культуры тканей).
  10. Перед покрытием протрите каждый отдельный покрывало 70% этанола. Как только coverslip высохнет, поместите его в колодец стерильной 6 хорошо пластины.
  11. Возьмите 250-300 л матричного раствора hESC и тщательно распределите его прямо на центр стеклянного покрывала. Оставьте крышки на RT под капотом культуры ткани, по крайней мере 30 минут перед использованием.

3. Подготовка малых молекул

ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановить все небольшие молекулы и Модуляторы Wnt в DMSO, если не указано иное.

  1. Подготовьте 10 мМ aliquots по 25 л каждый из IWR-1 и CHIR 99021 и храните при -20 градусов по Цельсию.
  2. Восстановите 10 мМ аликвоты по 50 л каждый из тиазовивина (ингибитор ROCK) и храните при -20 градусов по Цельсию.

4. Обслуживание и пропускирование iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги под стерильным капюшоном культуры тканей.

  1. Поддерживайте iPSCs в стандартных 6 скважинах и выполняйте все шаги в стерильных условиях. Поддерживайте ячейки с 2 мл hiPSC средств массовой информации в скважине. Меняйте средства массовой информации через день. Держите клетки на 37 градусов по Цельсию, 6% O2,5% CO2. Проход ячеек, когда они между 70-80% слияния.
  2. Равновесие PBS без Ca2 "и Mg2" на RT.
  3. Чтобы начать процесс прохождения, добавьте 1 мл PBS без Ca2 "и Mg2" к колодцу, который должен быть пройдено. Инкубировать на RT в течение 7'10 мин. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что лечение PBS не привело к полной диссоциации монослой.
  4. Удалить PBS и заменить 1 мл проходных носителей. Используйте подъемник клетки, чтобы аккуратно соскребать и поднять клетки с поверхности колодца.
  5. Механически разъединяют клетки с помощью стерильной стеклянной пипетки 2 мл. Повторяйте до тех пор, пока клетки хорошо разобщены равномерно в небольшие колонии, когда наблюдается под микроскопом.
  6. После того, как клетки были достаточно разобщены, добавьте 5 мл проходяных носителей, чтобы разделить ячейки 1:6. Отрегулируйте количество перехисабливающих носителей, которые будут добавлены в соответствии с предпочтительным соотношением разделения.
  7. Аспирировать hESC-квалифицированных матрицы из hESC квалифицированных матричного покрытия пластины и заменить 1 мл проходных носителей на скважину. Добавьте 1 мл разъединенных ячеек на скважину.

5. Дифференциация кардиомиоцитов

  1. Используйте линии hiPSC, которые хорошо зарекомендовали себя (более 20 проходов) и проявляя однородную морфологию перед началом сердечной дифференциации.
  2. Убедитесь, что iPSCs составляют около 70-80% слива.
  3. Вымойте клетки 1x в PBS без Ca2 "и Mg2".
  4. Добавьте 2 мл d0 носителей (шаг 1,7) на скважину и перенесите клетки обратно в инкубатор.
  5. После 24 ч, заменить 3 мл D1 средств массовой информации на хорошо для 48 ч.
  6. На 3-й день, заменить средства массовой информации с 2 мл D3 средств массовой информации на скважину. Повторите с D4 СМИ на 4-й день.
  7. На 5-й день замените средства массовой информации 3 мл носителей D5 на скважину.
  8. На 7-й день замените носитель 3 мл носителей D7 на скважину и перенесите в инкубатор с 37 градусами По Цельсию, 5% CO2и нормальной концентрацией O2. Заменяйте средства массовой информации D7 (RPMI и B27) каждые 2 дня.

6. Процедура отбора и диссоциация iPSC-CM

  1. За десять дней до выполнения переходных измерений Ca2 или любого функционального анализа замените медиа-носителю RPMI и B27 3 мл подбора носителей на скважину в течение 48 ч.
  2. Замените носители на 3 мл средств отбора еще на 48 ч.
  3. Замените носители на 2 мл RPMI и B27 носителей в колодец для 24 ч.
  4. Пальто стандартные 6 хорошо пластин, как описано в разделе 2.
  5. Добавьте 1 мл стерильных 0,25% трипсина с EDTA к каждой скважине. Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
  6. Используя пипетку объемом 1000 л, механически разъединяют клетки, чтобы одиночные клетки можно было увидеть при наблюдении под микроскопом.
  7. Перенесите клетки в стерильную коническую трубку 15 мл и добавьте 2 мл RPMI 20 носителей на скважину. Центрифуга в течение 5 мин при 800 х г.
  8. Аспирируй супернатант и resuspend клетки в RPMI B27 сми. Приготовьте матрицу с квалификацией hESC из пластин и замените 1 мл носителей RPMI и B27.
  9. Используя наконечник пипетки 1000 мл, механически разъединяйте клеточные гранулы до тех пор, пока раствор не окажется однородным.
  10. Перенесите примерно 500 000 ячеек в каждую скважину. Перевод в инкубатор на 24 ч.
  11. Замените носители с 3 мл выбора средств массовой информации на хорошо для 48 ч.
  12. Замените носители 3 мл RPMI и B27 на скважину. Поддерживайте ячейки в носителях D7 (RPMI и B2, меняющие среду каждые 2 дня, пока не будут готовы к функциональному анализу.

7. Подготовка iPSC-CMs для цитометрии потока

  1. После того, как клетки имеют желаемый возраст и прошли метаболический отбор (раздел 6), мыть клетки с PBS без Ca2 "и Mg2 ".
  2. Добавьте 1 мл на колодец трипсина 0,25% и инкубировать в течение 5-7 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Pipette смесь 5'10x с p1000 наконечник для сингулярности клеток, и передать в 15 мл трубки, содержащие 2 мл RPMI 20.
  4. Спин клетки на 600 х г в течение 5 мин.
  5. Добавьте 100 злификационных растворов (4% PFA) в клеточные гранулы. Добавьте раствор dropwise с непрерывным, нежным вихрем, а затем установите на лед в течение 15 минут.
  6. Добавьте 1,5 мл PBS. Соберите клетки центрифугированием и аспирируйте супернатант.
  7. Для каждого эксперимента, включают один неокрашенный контроль на фиксацию / условие пермяки.
  8. Повторное действие ячеек в 500 qL блокирующего раствора (2% FBS/2% BSA в PBS с 0,1% NP-40) в течение 30 мин на RT.
  9. Не удаляя блокирующий раствор, добавьте первичное антитело MLC2V/MLC2A (5 мг/мл) и инкубируйте 45 мин на РТ.
  10. Промойте с блокирующим буфером. Собирайте клетки центрифугированием и аспирным раствором.
  11. Добавьте вторичное антитело Alexa Fluor 555/488 (1:750), разбавленное в блокирующем буфере в течение 45 минут на RT или на ночь при 4 градусах Цельсия.
  12. Добавьте 1,5 мл PBS. Собирайте клетки центрифугированием и аспирным раствором.
  13. Повторное отемки клеток в 250–300 л PBS. Используйте пипетку P1000 для дезагрегирования ячеек.
  14. Подготовка круглых нижних труб с 35 мкм нейлоновой сетки ячейки ситечко крышка. Предварительно смочите клеточный ситечко с 50 Зл ТБС и установите трубку на льду.
  15. Перенесите раствор с дезагрегированными клетками в круглые нижние трубки с крышками ситечко. Разрешить клеточному раствору стечь естественным путем или нажмите дно трубки против плоской поверхности, по мере необходимости, чтобы обеспечить полный дренаж и сбор клеток в трубку. Убедитесь в том, чтобы установить трубку обратно на лед как можно скорее.
  16. Промыть клеточный ситечко с 250 Л Л PBS для восстановления любых остаточных клеток.
  17. Поддерживайте трубки на льду и накройте алюминиевой фольгой до анализа цитометрии потока.

8. Покрытие кардиомиоцитов на стеклянные крышки

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги в стерильной среде.

  1. Подготовьте стеклянные крышки, как описано в шагах 2.10 и 2.11.
  2. После того, как iPSC-CM были выбраны и имеют желаемый возраст, выполните шаги 6.5-6.7, чтобы разъединить iPSC-CMs.
  3. Аспирировать супернатант и resuspend клетки в достаточном количестве RPMI 20 средств массовой информации, чтобы иметь примерно 300000 клеток на 250 КЛ.
  4. Используя стеклянную пипетку 2 мл, механически разъединяйте клеточные гранулы до тех пор, пока раствор не окажется однородным.
  5. Аспирируй матрицу с квалификационной матрицы hESC из капота.
  6. Используя пипетку мощностью 1000 л, смешайте и вытяните 250 л раствора из конической трубки 15 мл.
  7. Медленно распределяйте 250 л раствора на стеклянные крышки, проявляя дополнительную осторожность, чтобы добавить только в область, где присутствует матричного покрытия, квалифицированное hESC.
  8. Перенесите тщательно в инкубатор и оставьте на ночь, заботясь, чтобы не встряхнуть или распространить клетки на крышки. На следующее утро, осторожно добавить 2 мл D7 (RPMI B27) средств массовой информации для каждого хорошо с крышкой. Изменение средств массовой информации после 24 ч и каждые 2 дня после этого.

9. Фиксация клеток

  1. Убедитесь, что достаточное количество PBS с Ca2 и Mg 2 "уравновеш— до 4 градусов по Цельсию.
  2. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) раствор, разбавленный в PBS с Ca2 и Mg2 и уравновешивательный до 4 градусов по Цельсию.
  3. После того, как iPSC-CMs имеют соответствующий возраст, прошли метаболический отбор (раздел 6), и были покрыты на крышки (раздел 8), мыть клетки 3x с 1 мл холодного PBS с Ca2 "и Mg2" в скважине.
  4. Добавьте 1 мл холодного 4% PFA и оставьте клетки на RT под капотом в течение 15 минут.
  5. Вымойте клетки с холодной PBS, чтобы удалить избыток PFA.
  6. Добавьте 2 мл PBS с Ca2 и Mg2 и храните при 4 градусах Цельсия.

10. Иммунофлуоресценция окрашивание

  1. Удалить PBS из фиксированных ячеек и добавить 1 мл блокирующего буфера. Инкубировать 1 ч на RT.
  2. Удалить блокирующий буфер и добавить первичные антитела (5 мг/мл), разбавленные в блокирующем буфере. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  3. Вымойте 3x в PBS с Ca2 "и Mg2" в течение 5 минут каждый.
  4. Добавьте вторичные антитела, разбавленные в блокирующем буфере 1:1,000.
  5. Обложка пластины с алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света и инкубировать в течение 45 минут на RT. Держите алюминиевую фольгу для следующих шагов.
  6. Вымойте 3x в PBS с Ca2 "и Mg2", 5 мин каждый.
  7. Добавьте достаточное количество рабочего раствора DAPI, чтобы полностью покрыть клетки и инкубировать на RT в течение 10 минут.
  8. Вымойте образец тщательно с PBS с Ca2 "и Mg2" для удаления избытка DAPI.
  9. Возьмите новые стеклянные слайды и добавить каплю монтажа носителя в середине. Используйте капельница, чтобы равномерно распределить монтажные носители. Положите крышки с клетками лицом вниз на слайдах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться в течение 30 дней, если они защищены от света.

11. Оценка внутриклеточных Переходных Веществ Ca2

  1. После того, как iPSC-CMs, по крайней мере 3 месяцев, прошли метаболический отбор (раздел 6), и были покрыты на крышки, лечить их с 2 Зл Фура-2, AM (окончательная концентрация: 1 ММ) и инкубировать при 37 кс в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Fura-2 светочувствительный. Выполняйте все погрузочные процедуры и эксперименты в темноте.
  2. Подготовьте систему приобретения и анализа кальция и контрактности.
    1. Включите систему, гарантируя, что дуговая лампа инициируется(Рисунок 1B).
    2. Поместите камеру на систему и подключить трубки от насоса к соответствующим входе и розетки и электрический провод от стимулятора к камере, как показано на рисунке 1C.
    3. Заполните перфузийную трубку, которая проходит через жидкий влинейный нагреватель с 37 градусов по Цельсию предварительно разогретый раствор Tyrode.
    4. Отрегулируйте камеру и обрамление размеров диафрагмы, чтобы свести к минимуму фоновую область.
  3. Установите стеклянную крышку с iPSC-CMs в камеру и закрепите.
  4. Добавьте 500 л раствора Tyrode непосредственно на верхней части крепежного стеклянного покрытия мягко и начните проникать в камеру (1,5 мл/мин) раствором Tyrode.
  5. Pace iPSC-CMs с 1 Гц стимуляции поля с использованием электрического стимулятора (10 V, 4 мс).
  6. Инкубируйте iPSC-CMs в камере со стимуляцией не менее 3–5 мин, чтобы клетки мыли краситель Fura-2 и адаптировались к окружающей среде и промывают флуоресцентный краситель.
  7. Отрегулируйте смотровое окно в левую верхнюю часть стеклянной крышки.
  8. Начните запись.
  9. После сбора согласованного потока пиков 5–10, нажмите Pause, чтобы временно прекратить запись.
  10. Обеспечение того, чтобы ни фокус, ни размеры окна просмотра не изменялись, перемещая сцену микроскопа в прилегающую область, двигаясь к противоположному концу, и возобновляя запись.
  11. Повторите шаги 11.9 и 11.10 для сканирования через coverslip, сначала двигаясь влево, затем вниз в зигзагообразной моды, чтобы покрыть всю область покрытия. Она состоит из 80-100 измерений на крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничить общее время измерения до 10 минут, как вторичные факторы вызывают уменьшение Ca2 "переходных.
  12. После того, как переходные каши Ca2 "приобретены, проанализируйте данные с помощью программного обеспечения анализа следов флуоресценции в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный на рисунке 1А, генерировал очень чистые кардиомиоциты, которые приобретают желудочковый/взрослый фенотип со временем в культуре. По оценке иммунофлуоресценции окрашивания для предсердий и желудочков миозина регулятивной световой цепи 2 изоформы (MLC2A и MLC2V, соответственно), большинство клеток, генерируемых этим протоколом были MLC2A-положительный на 30 день после индукции сердечной дифференциации, в то время как MLC2V был выражен в гораздо меньших коли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги для использования человека iPSC-CMs в качестве экспериментальных моделей: 1) генерации высококачественных кардиомиоцитов (КМ), которые могут обеспечить последовательную производительность и воспроизводимые результаты; 2) позволяет клеткам созревать в культуре, по крайней мере 90 дней, чтобы адекватно оценить их фенотип; 3) проведение электрофизиологических исследований, например, преходящих измерений кальция (Ca2)для обеспечения физиологически релевантной функциональной характеристики iPSC-CMs...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано AHA Научное развитие Грант 17SDG33700093 (F.S.); Премия ученых с ифтами kl2 в маунт-Синай за клиническое и трансляционное исследование развития карьеры KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 и AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-актин, α-антитела к гладким мышцам, мышиный моноклональныйSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 козий анти-мышиныйInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 козий анти-кроликInvitrogenA21428
B27 ДобавкаGibco17504-044
B27(-) инсулин ДобавкаGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI ядерное окрашиваниеThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-глютамин + 15mM HepesGibco11330-032
Двусторонний клеточный подъемник, плоское лезвие и J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 лунокCorning 353046
Жидкостный встроенный нагревательLive Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-квалифицированная матрицаCorning354277Matrigel Matrix
hPSC mediaGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Камера для визуализации живых клетокИнструмент для живых клетокEC-B25
MLC-2A, моноклональные антитела мышиСинаптические системы311011
миоцитарного кальция и система сократимостиIonoptixISW-400
Миозиновая легкая цепь 2 антитела, кролик поликлональный (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Стерильные одноразовые фильтрующие установки с мембранойPESThermoFisher124-0045
PBS с кальцием и магниемCorning 21-030-CV
PBS без кальция и магнезияCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI среда 1640 (-) D-глюкоза (1X)Gibco11879-020
RPMI среда 1640 (1X)Gibco11875-093
L-лактат натрияSigma AldrichL7022
Добавка StemFlexGibcoA33492-01
ТиазовивинТокрис3845
Трипсин-ЭДТА (0,25%)ThermoFisher25200056
раствор TyrodeBoston BioproductsBSS-355wОтрегулируйте pH на уровне 7,2. Добавьте 1,2 мМ хлорида кальция

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12(2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17(2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010(2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50(2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fura 2 AMMLC2

Похожие статьи