Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Свиная Корнел Эндотелиальная модель органной культуры с использованием сплит-корневых кнопок

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60171

⸱

6 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE), 2University Eye Hospital, Center For Ophthalmology, University Hospital Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен пошаговой протокол для приготовления и выращивания свиных роговицы. Поскольку эта органо-типично культивируемая модель культуры органов показывает показатели смертности клеток в течение 15 дней, сопоставимые с роговицами донора человека, она представляет собой первую модель, позволяющую долгосрочное культивирование нечеловеческих роговиц без добавления токсичных декрен.

Аннотация

Экспериментальные исследования эндотелиальных клеток роговицы связаны с несколькими трудностями. Роговицы донора человека являются скудными и редко доступны для экспериментальных исследований, поскольку они обычно необходимы для трансплантации. Эндотелиальные клеточные культуры часто не очень хорошо переводятся в ситуации in vivo. Из-за биоструктурных характеристик нечеловеческих роговиц, стромальный отек во время выращивания вызывает значительную потерю эндотелиальных клеток роговицы, что затрудняет культивирование в течение длительного периода времени. Для противодействия этому ответу используются деозавуированные агенты, такие как декек. Тем не менее, они также вызывают значительную потерю эндотелиальных клеток. Таким образом, была создана модель культуры культуры ex vivo, не требующая деотечных агентов. Свиньи глаза из местной скотобойни были использованы для подготовки раскол роговицы кнопки. После частичного трефинации роговицы внешние слои роговицы (эпителий, слой лукмана, части стромы) были удалены. Это значительно снижает потери эндотелиальных клеток роговицы, вызванные массивным стромальным отеком и мембраной Десцемета, складывающейся в течение более длительных периодов культивирования, и улучшает общее сохранение эндотелиального клеточного слоя. Последующее полное трифинирование роговицы последовало удаление раскол апогея кнопки из оставшейся луковицы глаза и выращивания. Плотность эндотелиальных клеток оценивалась в период ы наблюдения до 15 дней после приготовления (т.е. дней 1, 8, 15) с помощью световой микроскопии. Используемый метод подготовки позволяет лучше сохранить эндотелиальный слой клеток, включенный менее стромальным отеком тканей, что приводит к медленному и линейному снижению в сплит-кнопках роговицы, сопоставимых с роговицами донора человека. Поскольку эта стандартизированная органо-типично культивируемая исследовательская модель впервые позволяет стабильно культивироваться в течение по крайней мере двух недель, она является ценной альтернативой кукурузе донора человека для будущих исследований различных внешних факторов в отношении их оказывает влияние на эндотелий роговицы.

Введение

Процедуры трансплантации корневой трансплантации являются одними из наиболее часто выполняемых трансплантаций во всем мире1. Как существует острая нехватка человеческих доноров роговицы, экспериментальные исследования решения роговицы эндотелиальных клеток в роговицы человека трудно выполнить1. Однако внедрение оросительных растворов и других веществ, используемых в глазу, офтальмологических вязкоупругих устройств, а также хирургических инструментов и методов (например, инструменты и методы факоэмульсификации, ультразвуковая энергия) требует действительные и обширные исследования относительно их воздействия на эндотелий роговицы перед клиническим использованием.

Немногие альтернативы донорской роговицы человека существуют для исследований. Модели исследований на животных очень ценны, но в то же время очень ресурсоемкие и все более под сомнение этически. Основным недостатком культур клеток in vitro является их ограниченный перевод человеческому глазу. Результаты, полученные из клеточных культур может быть несовместимы с условиями in vivo, потому что клетки могут претерпеть эндотелиальный мезенхимальный переход (EMT), в результате чего фибробластоподобная морфология вызвана потерей клеточной полярности и изменениями в форме клеток и гене выражение2.

В то время как предыдущие модели ex vivo сообщили периоды выращивания до всего 120 ч, новый метод подготовки к созданию свиной роговицы эндотелиальной модели культуры органов путем культивирования свежей свиной роговицы, по крайней мере 15 дней был недавно введен3 ,4,5,6. Если эпителий роговицы и части стромы удаляются (всего около 300 мкм) из роговицы до культивирования, отек стромы уменьшается в разделенных кнопках роговицы, что приводит к меньшей эндотелиальной потере клеток и ухоженной эндотелиальной клеточный слой после 15 дней, в то время как не расщепленные кнопки роговицы показывают значительную эндотелиальную потерю клеток из-за неравномерного стромального отека и образования складок Десцемета. Глаз банки обычно используют осмотические деоретные агенты, такие как декек, чтобы уменьшить отек роговицы до трансплантации. Тем не менее, эти агенты были показаны, чтобы вызвать увеличение эндотелиальной потери клеток7,8,9.

Эта статья направлена на визуализацию этой стандартизированной модели исследования ex vivo в подробном пошаговом протоколе, чтобы позволить будущим следователям проводить исследования по эндотелию роговицы с помощью сплит-кнопок роговицы. Эта модель представляет собой простой метод для тестирования веществ и методов, используемых в глазу, таких как офтальмологические вязкоупругие устройства, оросительные растворы, и ультразвуковой энергии, или другие процедуры, где эндотелий роговицы представляет интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол соответствует этическим принципам нашего учреждения. В соответствии с уставом комитета по этике нашего учреждения до начала экспериментов не должно было быть получено никакого этического утверждения, так как все свиные роговицы были получены с местной скотобойни.

1. Органная культура

  1. Приготовьте свиные глаза.
    1. С местной скотобойни, получить свиньи глаза, которые были удалены вскоре посмертно, но до термической обработки. Транспорт глаза в лабораторию и обрабатывать их в течение нескольких часов. Во время транспортировки держите глаза при комнатной температуре (примерно 21 градусов по Цельсию) перед обработкой.
    2. Удалите все орбитальные прижима (глазные мышцы, конъюнктива, жировую ткань) до дезинфекции с помощью ножниц для глаз и щипцы колибри. Отделить и отбросить все глаза с очевидной травмой, внешним иронизом (например, разрез ножом) или видимой непрозрачностью роговицы.
    3. Подготовьте 5% йод-PBS-раствор (1:20) в стерильной чашке, добавив 3 мл 7,5% повидона йода до 57 мл фосфатного буферного солей (PBS). Также приготовьте отдельную стерильную чашку, содержащую 60 мл чистого PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество использованного йода-PBS-решения и размер чашки зависит от количества роговицы, которые должны быть вскрыты. От пяти до шести глаз требуется примерно 60 мл 5%-йод-PBS-решение, чтобы быть дезинфицированы должным образом.
    4. Положите пять-шесть глаз в 5%-йод-PBS раствор в общей сложности 5 мин, чтобы правильно дезинфицировать поверхность глаза. Тщательно перемешать каждую минуту, чтобы убедиться, что поверхность глаза полностью погружена в воду и полностью дезинфицируется в растворе йода.
    5. После 5 минут, передача дезинфицированных глаз в подготовленную чашку заполнены чистым PBS. Опять же, тщательно перемешать, чтобы обеспечить йод-PBS-раствор смывается с поверхности глаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг на чистой скамейке, чтобы предотвратить загрязнение дезинфицированных глаз.
  2. Подготовка пластин клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги на чистой скамейке с постоянным ламинарным потоком воздуха.
    1. Оттепель 2 мл сыворотки плода теленка (FCS). Заполните шприц (5 мл) с FCS с помощью тупой канюли. Опорожните шприц через фильтр шприца (0.22 мкм) для предотвращения возможного бактериального загрязнения FCS в 80 мл декрен-свободной среды культуры I (минимальная необходимая среда «MEM» с солями Эрла, пенициллин/стрептомицин, L-глутамамин (200 мМ), амфотерицин B (250 мкг/мл), буфер hepes (1 М) (50x), NaHCO3и дистиллированная вода). Агитировать смесь, чтобы обеспечить равномерное распределение субстрата.
    2. Заполните каждый колодец 12 хорошо пластины культуры клеток с 3 мл субстратной смеси.
  3. Выполните вскрытие и инкубацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг на чистой скамейке. Не прикасайтесь к эндотелию роговицы с помощью каких-либо инструментов.
    1. Передача глазной луковицы из чашки с PBS в держатель луковицы для глаз с роговицы вверх и поместите его под офтальмологический хирургический микроскоп. Используйте шприц заполнены 0,9% NaCl слегка применить некоторые всасывания в глаза над держателем луковицы для глаз, чтобы зафиксировать глаз в положении для вскрытия.
    2. Используйте трефин (7,5 мм), содержащий стандартизированную инкрустированную, которая гарантирует, что глубина трефином не превысит 300 мкм, чтобы нарезать поверхностно центральную роговицу(рисунок 1А).
    3. Используйте щипцы колибри и одноразовый скальпель с треугольным лезвием, чтобы вырезать и удалить частично тройной части роговицы горизонтально через стромы. Откажитесь от разделенной части роговицы, состоящей из эпителия роговицы, слоя лукмана и части стромы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Строго поддерживать горизонтальное направление резки, чтобы получить ровную толщину оставшейся стромы.
    4. Поверхностно поместите 10-0 шов (10-0 полиамид 6) в стромы, чтобы иметь возможность дифференцировать эндотелиал от стромальной стороны во время экспериментов (Рисунок 1B). Предотвратить проникновение эндотелия роговицы. Откажитесь от глазной лампы, если эндотелий проник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проникновение роговицы эндотелия с швов ойильной иглой будет видно, как жидкость из передней глазной камеры будет просачиваться через шовный канал.
    5. Используйте трефин без инкрустировки для продвижения трефинированного разреза на полную глубину до тех пор, пока не будет достигнута передняя глазная камера(рисунок 1C). Отчетливое падение сопротивления и утечки жидкости из передней глазной камеры может быть воспринято после полного проникновения роговицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте хоккейный нож, если кнопка раскола роговицы остается прикрепленной на одной стороне кнопки раскола роговицы после трефинации.
    6. Передача полученных раскол роговицы кнопку, в настоящее время состоящий из части стромы (Рисунок 2), мембраны Descemet, и роговицы эндотелия, в среде культуры (культура среднего I И FCS, см. раздел 1.2) в 12 хорошо пластины культуры клеток с помечены стороны вниз, так что роговицы эндотелий лицом вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эндотелиальная сторона обращена вниз, эндотелий может получить повреждения.
    7. Назначьте индивидуальный номер каждой кнопке разделенной роговицы для идентификации во время последующих взлетов и пометьте колодцы на пластине клеточной культуры соответственно.
    8. Инкубировать заполненные пластины культуры клеток в инкубаторе при стандартных условиях при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и относительной влажности воздуха 95%. Измените среду культуры (культурная среда I и FCS) на 8-й день, если инкубационный период составляет 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура инкубации с использованием сплит-кнопок роговицы была проверена на срок до 15 дней.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Рассечение свиной роговицы для получения сплит-кнопок роговицы. ( )После трефинации роговицы с помощью трефина с инкрусом, чтобы разрезать на глубину 300 мкм и удаление эпителия и частей стромальной ткани, (B) шов помещается поверхностно в строму без проникновения роговицы эндотелий для последующей идентификации стромальной стороны. (C) Полное трефинирование оставшейся роговицы сопровождается (D) удаление полученной кнопки раскол роговицы из глазной луковицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Микроскопия и исследование эндотелия

  1. Выполните незапятнанное обследование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неокрашенные экзамены могут быть выполнены несколько раз (например, на еженедельных последующих исследующих на день 1, 8 и 15). Однако неокрашенный подсчет позволяет только оценивать плотность эндотелиальных клеток, а не морфологические параметры.
    1. Заполните 3 мл гипотонического сбалансированного солевого раствора (hBSS, см. композицию в таблице материалов) в каждом колодце 12 хорошо пластины культуры клеток. Тщательно поместите одну кнопку раскол роговицы в hBSS, чтобы вызвать отек роговицы эндотелиальных клеток и улучшить видимость клеток для подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эндотелиальная сторона обращена в направлении микроскопа. Если используется перевернутый фазовый контрастный микроскоп, эндотелиальная сторона должна быть обращена вниз. В то время как на месте, культурная плита не должна быть перемещена, чтобы предотвратить повреждение эндотелиальных клеток.
    2. Пусть клетки набухают в течение 1-2 минут, прежде чем сфотографировать эндотелий с камерой, прикрепленной к микроскопу. Сделайте по крайней мере три фотографии по крайней мере трех различных областей, чтобы получить репрезентативное впечатление о фактическом состоянии эндотелия роговицы. Добавьте панель масштаба с истинной для масштабирования длиной 100 мкм для последующего анализа плотности эндотелиальных клеток и морфологических параметров.
    3. Для предотвращения повреждения осмотическими, удалите сплит-кнопку роговицы из hBSS после максимум5 мин и перенесите ее обратно в среду культуры3.
  2. Выполните окрашенные экспертизы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание прекращает эксперименты, так как используемые окрашивающие сятоксические вещества являются цитотоксическими. Поэтому окрашивание может быть выполнено только в конце периода наблюдения для оценки морфологических параметров (фигуры реформирования, розетки, ализарин красные окрашенные клетки).
    1. Подготовьте раствор 0.25 trypan голубой и 0.2% ализарин красный S разрешение для процедуры окрашивания.
      1. Для 0,25% trypan синий раствор, разбавить 0,4% trypan синий раствор с 0,9% NaCl раствор.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для получения 20 мл раствора 0,25% трипан синий, разбавить 12,5 мл 0,4% трипан синий раствор с 7,5 мл 0,9% NaCl раствор. Синий раствор trypan может храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель или месяцев.
      2. Для получения 0,2% ализарин красный Раствор S растворяют 100 мг ализарин красного S порошок в 50 мл 0,9% NaCl раствор при постоянном перемешивании и нагревадой до 50 градусов по Цельсию на магните, помешивая пластины с функцией нагрева. Чтобы удалить возможные осадки, отфильтруйте полученное решение. Отрегулируйте рН ализарин красный S раствор рН 4.2, добавив гидроксид натрия или соляной кислоты соответственно.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым применением ализарин красный S решение убедитесь, что рН исправлена до 4,2 и что Есть нет осадков в растворе. Раствор может храниться при комнатной температуре. Не храните раствор дольше 4 недель.
    2. Поместите разделенные кнопки роговицы в чашках Петри с эндотелиальной стороной, обращенной вверх, чтобы запятнать эндотелиальные клетки. Используйте пипетку, чтобы медленно капать 0,25% trypan синий раствор капля за каплей на роговицы эндотелия в течение 90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трипан синий позволяет идентификации поврежденных клеток роговицы с проницаемой мембраной, потому что это пятна их ядра.
    3. Тщательно промыть раскол роговицы кнопку 3x в 0,9% NaCl в небольшом стакане. Опять же, используйте пипетку, чтобы медленно капать 0,2% ализарин красный S раствор капля за каплей на роговицы эндотелия в течение 90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ализарин красный S пятна мембраны Descemet, который помогает выделить клеточные границы в неповрежденных роговицы эндотелиальных клеток и выделить разрушенные клетки, когда мембрана descemet становится видимым. Кроме того, это позволяет легко идентифицировать более крупные разрушенные районы.
    4. Для изучения окрашенных роговицы эндотелия следовать шаги объяснил для неокрашенных подсчета в разделе 2.1.

3. Анализ плотности эндотелиальных клеток роговицы и морфологических параметров

  1. Проект подсчета квадратов на картинках с помощью программного обеспечения для редактирования графики (Таблица материалов).
    1. Откройте программное обеспечение и откройте изображение эндотелия роговицы, выбрав файл Открыто (ru) Выберите.
    2. Проект квадрата с истинной для масштабирования боковой длины 100 мкм на изображении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги раздела 3.1.2 могут быть проигнорированы, если программное обеспечение для просмотра позволяет проецировать подсчет квадратов на картинку. Длина стороны квадрата зависит от разрешения изображений, сделанных с помощью камеры микроскопа, и может быть рассчитана с помощью панели масштаба.
      1. Обрезать шкалу бар с фотографией, сделанной с микроскопом: выберите прямоугольный инструмент Marquee на панели инструментов или нажмите M, затем границы шкалы бар, а затем выберите Edit Урожай или нажмите Ctrl x.
      2. Нажмите файл (ru) Новое (или нажмите Ctrl n). В предстоящем окне выберите Clipboard в списке выпадающих типов документов. Количество показанных пикселей — это длина стороны квадрата подсчета. Обратите внимание на соответствующие пиксели для других фотографий и нажмите OK.
      3. Выберите файл Новое (или Ctrl n). Вставьте ширину и длину (в пикселях) квадрата подсчета в предстоящем окне в зависимости от длины панели шкалы. Выберите фоновый цвет белый,затем нажмите OK.
      4. Нажмите Выберите Выберите все (или Ctrl и A). Выбрать Edit Копировать (или Ctrl и C).
      5. Выберите изображение эндотелия роговицы, открытого в шаге 3.1.1. Выбрать Edit Вставить (или Ctrl и V),чтобы вставить квадрат на фото роговицы эндотелия.
      6. Выберите слой квадрата и отрегулируйте прозрачность. Выберите Слой Стиль слоя (англ.) Варианты смешивания (англ.) Установите непрозрачность до 30% OK.
      7. Сохранить изображение с проецируемой площади с истинной для масштабирования боковой длины 100 мкм. Повторите с другими изображениями, необходимыми для анализа.
  2. Оцените плотность эндотелиальных клеток и морфологические параметры.
    1. Откройте изображения с проецированными квадратами в ImageJ (версия 1.50i) и используйте PlugIn CellCounter для подсчета ячеек в квадрате. Открыть ImageJ, выберите Файл Открыто (или Ctrl и O) Выберите изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ и CellCounter PlugIn являются бесплатно доступны для скачивания в Интернете.
    2. Выберите плагины Сотовый счетчик Счетчик ячеек Инициализация. Подсчитайте эндотелиальные клетки и запишите результат. С двух сторон квадрата подсчитайте ячейки, которые вырезаны краем квадрата. Не считайте вырезанные клетки с двух сторон.
    3. Проанализируйте по крайней мере шесть квадратов на роговицу из разных областей (например, три картинки, два квадрата на картинку) и определите среднюю плотность эндотелиальных клеток на квадрат (100 мкм2). Экстраполировать плотность эндотелиальных клеток на 100 мкмот 2 до 1 мм2, умножая на 100.
  3. Для оценки морфологических изменений, подсчет показателей реформирования (совместное собрание 4 клеток/клеточных границ вместо трех), розетовые образования (характерный розовый вид, пять или более радиорасположенных клеток, окружающих разрушенную клетку ), или ализарин красные области (уничтоженные клетки) в прогнозируемых квадратов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, может быть полезно использовать большие квадраты (например, 200 х 200 мкм2)для морфологического анализа в хорошо сохранившихся образцах для получения более репрезентативных результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленный метод вскрытия подразумевает частичное удаление стромальной ткани, в результате чего более тонкий образец роговицы и, таким образом, менее стромальный отек(рисунок 1 и рисунок 2). Менее стромальный отек вызывает меньше сдвига и щепотку сил, которые оказывают негативное влияние на эндотелий роговицы, тем самым вызывая более низкие показатели эндотелиальной потери клеток6. Сплит роговицы кнопк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предоставляет метод для подготовки свиной сплит роговицы кнопки, которая представляет собой стандартизированные и недорогие ex vivo роговицы эндотелиальной модели культуры органов для исследовательскихцелей 6. Свиной раскол роговицы кнопки показали снижение плотности эндотелиальной клеток сопоставимы с эндотелиальных потерь клеток наблюдается в донорской роговицы человека культивируется в глазных банках в течение двух недель6,10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Создание представленной исследовательской модели было поддержано КМУ-инноваторив (ФКЗ: 13GW0037F) федерального министерства образования и научных исследований Германии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Subject
Pig eyeslocal abbatoir
Substances
Alizarin red SSigma-Aldrich, США
Culture Medium 1, #F9016Biochrom GmbH, Германия
Dulbecco's PBS (1x)Gibco,
Фетальная сыворотка теленкаBiochrom GmbH, Германия
Раствор соляной кислоты (HCl)собственного производства
Гипотонический сбалансированный раствор солисобственного производствана 1 л H2O: NaCl 4,9 г; KCl 0,75 г; CaCl x H2O 0,49 г; MgCl2 x H2O 0,3 г; Ацетат натрия x 3 H2O 3,9 г; Цитрат натрия x 2 H2O 1,7 г
Повидон йод 7,5%, BraunolB. Braun Melsungen AG, Германия
Хлорид натрия (NaCl) 0,9%B. Braun Melsungen AG, Германия
Раствор гидроксида натрия (NaOH)собственного производства
Трипановый синий 0,4%Sigma-Aldrich, США
<прочные>Материалы и Инструменты
Accu-jet proBrand GmbH, Германия
Beaker Glass 50 млSchott AG, Германия
Тупой канюля вкл. фильтр (5 &; m) 18GBecton Dickinson, США
Клеточная культуральная пластина (12 лунок)Corning Inc., США
Щипцы ColibriGeuder AG, Германия
Роговичные ножницыGeuder AG, Германия
Eppendorf пипеткаEppendorf AG, Германия
Держатель глазной луковицыL. Klein, Германия
Глазные ножницыGeuder AG, Германия
Складной фильтр ø 185 ммВатман, США
Хоккейный ножGeuder AG, Германия
Лаборатория Стеклянная бутылка с крышкой 100 млSchott AG, Германия
Магнитная мешалкаCarl Roth GmbH & Co. KG, Германия
Фильтр MillexGV (5 & микро; m)Merck Millopore Ltd., США
ИглодержательGeuder AG, Германия
Чашки ПетриVWR International, США
Наконечники для пипетокSarstedt AG & Co., Германия
Скальпель (одноразовый), треугольное лезвиеAesculap AG & Co. KG, Германия
Серологическая пипетка 10 млSarstedt AG & Co., Германия
Серологическая пипетка 5 млSarstedt AG & Co., Германия
Стерильные чашкиGreiner Bio-One, Ö sterreich
Стерильные перчаткиPaul Hartmann AG, Германия
Стерильная хирургическая простыняPaul Hartmann AG, Германия
Ножницы для швовGeuder AG, Германия
Шовный материал Ethilon 10-0 Polyamid 6Ethicon Inc., США
Шприц (5 мл)Becton Dickinson, США
Трепан и Ослэш; 7,5 ммсобственного производства
Щипцы для обвязкиGeuder AG, Германия
Бумага для взвешиванияneoLab Migge GmbH, Германия
Equipment & Программное обеспечение
бинокулярный хирургический микроскопCarl Zeiss AG, Германия
Камера, установленная на микроскопеOlympus, Япония
CellSens Entry (программное обеспечение)Olympus, Япония
Источник холодного светаSchott AG, Германия
ИнкубаторHeraeus GmbH, Германия
Инвертированный фазово-контрастный микроскопOlympus GmbH, Германия
Магнитная мешалка с функцией нагреваIKA-Werke GmbH & Co. KG, Германия
pH-метр pHenomenalVWR International, США
Photoshop CS2Adobe Systems, США
Прецизионный масштабOhaus Europe GmbH, Швейцария
США

Ссылки

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Эндотелиальные клетки роговицыуменьшение отека стромыплотность эндотелиальных клетокоценка методом световой микроскопиигипотонический сбалансированный солевой растворокрашивание трипановым синимокрашивание ализариновым красным Sинкубация клеточных культур
Свиная Корнел Эндотелиальная модель органной культуры с использованием сплит-корневых кнопок
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.