Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

6.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60172

⸱

2 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Cognate J-домен белки сотрудничать с Hsp70 сопровождающего, чтобы помочь в множество биологических процессов, начиная от белка складывания к деградации. Здесь мы описываем на месте перевязки перевязки, которая позволяет мониторинг этих преходящее сяоченное машиностроения в бактериальных, дрожжей и человеческих клеток.

Аннотация

Белки J-домена (JDP) образуют самую большую и разнообразную семейство со-чаперонов в эукариотических клетках. Недавние результаты показывают, что конкретные члены семьи JDP могут образовывать переходные гетерокомплексы в эукариотах для тонкой настройки подложки для 70 kDa теплового шока белка (Hsp70) на основе сопровождающих протеинов дезагрегазы. Комплексы JDP нацелены на острый/хронический стресс, индуцированный агрегированными белками, и, предположительно, помогают собрать дезагрегазы, набирая несколько Hsp70 на поверхность белковых агрегатов. Степень сети контроля качества белка ( P'C), образованная этими физически взаимодействующими JDPs, остается в значительной степени нехарактерной in vivo. Здесь мы описываем на основе микроскопии на основе на месте белка взаимодействия анализ называется близость перевязки анализ (PLA), который способен надежно захватить эти преходяще ежило сформированных комплексов сопровождающего в различных клеточных отсеков эукариотических клеток. Наша работа расширяет занятость НОАК от человеческих клеток до дрожжей(Saccharomyces cerevisiae) и бактерий (Escherichia coli), таким образом, что делает важным инструментом для мониторинга динамики переходно сформированных белковых сборок в обоих прокариотических и эукариотических клеток.

Введение

Огромное количество геномной информации остается неистолималомируемым из-за нашего неполного понимания клеточных interactomes. Обычные методики обнаружения взаимодействия белка и белка, такие как белок, совместно ездовые с/без химического перекрестного соединения и колокализации белка, хотя и широко используется, представляют собой ряд недостатков. Некоторые из основных недостатков включают плохую количественную оценку взаимодействий и потенциальное введение неместных обязательных событий. Для сравнения, новые методы, основанные на близости, обеспечивают альтернативу и мощный подход к захвату белковых взаимодействий в клетках. Анализ перевязки близости (PLA)1, теперь доступен как собственный комплект, использует антитела специально целевых белковых комплексов, основанных на близости взаимодействующих подразделений.

НОАК инициируется формированием эшафота, состоящего из первичных и вторичных антител с небольшими днк-тегами (зондами НОАК) на поверхности целевого белкового комплекса(рисунок1, шаги 1-3). Далее, определяется близость днк-меток, круговая молекула ДНК генерируется путем гибридизации с разъемом олигонуклеотидов(Рисунок 1, шаг 4). Формирование круговой ДНК завершается шагом перевязки ДНК. Вновь сформированный круговой кусок ДНК служит шаблоном для последующего усиления подвижного круга (RCA) на основе полимеразы цепной реакции (ПЦР) загрунтовать одним из конъюгированных олигонуклеотидов метки. Это генерирует одноцепочечную конкатемерную ДНК-молекулу, прикрепленную к белковому комплексу через эшафот антител(рисунок1, шаг 6). Конкатемерная молекула ДНК визуализирована с помощью флуоресцентно помеченных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с несколькими уникальными последовательностями, разбросанными по усиленной ДНК(Рисунок1, шаг 7)2. Сгенерированный сигнал PLA, который выглядит как флуоресцентная точка(рисунок1, шаг 7), соответствует расположению целевого белкового комплекса в клетке. В результате анализ мог обнаружить белковые комплексы с высокой пространственной точностью. Техника не ограничивается просто захвата белковых взаимодействий, но также может быть использован для обнаружения отдельных молекул или белков изменения на белки с высокой чувствительностью1,2.

Hsp70 образует весьма универсальную систему сопровождающего фундаментально важно для поддержания клеточного белка гомеостаза, участвуя в массиве домашнего хозяйства и связанных со стрессом функций. Деятельность по ведению домашнего хозяйства системы Hsp70 включает складывание белка de novo, перенос белка через клеточные мембраны, сборку и разборку белковых комплексов, регуляцию белковой активности и увязку различных сворачиваний белков/ машины контроля качества3. Та же система сопровождающего также сбрасывает неправильно сложенные/развернутые белки, предотвращает агрегацию белка, способствует дезагрегированию белка и сотрудничает с клеточными протеазами, чтобы деградировать неизлечимо неправильно сложенные/поврежденные белки для облегчения клеточного ремонта после протеотоксические напряжения4,5. Для достижения этого функционального разнообразия, Hsp70 сопровождающий опирается на партнерские со-chaperones семьи JDP и нуклеотидных обменных факторов (NEFs), которые тонкой настройки Hsp70 в ATP-зависимый аллостерный контроль субстрата связывания и релиз3, 6. Кроме того, со-сопровождающие JDP играют жизненно важную роль в выборе субстратов для этой универсальной системы сопровождающего. Члены этой семьи подразделяются на три класса (A, B и C) на основе их структурной гомологии к прототипу JDP, E. coli DnaJ. JDPs класса A содержит N-терминальный J-домен, который взаимодействует с Hsp70, богатым глицином-фенилаланином, областью связывания субстрата, состоящей из цинкового пальца, похожего на область (ЗФЛР) и двух доменов с стволом, а также с доменом димеризации C-терминала. JDPs с N-терминал J-домен и глицин-фенилаланин богатый регион, но не хватает ЗФЛР, попадают в класс B. В целом, члены этих двух классов участвуют в сопровождающих функций. Члены, подпадающие под catchall класса C, который содержит JDPs, которые разделяют только J-домен4, набирать Hsp70s для выполнения различных функций, не связанных с сопровождающим. Важная роль JDPs как взаимозаменяемого распознавания субстрата "адапторы" системы Hsp70 находит свое отражение в расширении членов семьи в процессе эволюции. Например, люди имеют более 42 различных членов JDP4. Эти JDPs функции мономеров, гомодимеры и / или гомо / гетеро олигомеров4,5. В последнее время функциональное сотрудничество через переходное комплексное образование между классом А (например, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) и класс B (например, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotic JDPs, как сообщается, способствует эффективному распознаванию аморфных белковых агрегатов in vitro7,8. Эти комплексы смешанного класса JDP предположительно собираются на поверхности агрегированных белков для облегчения образования Hsp70- и Hsp70-Hsp100-протеиновых дезагрегаз7,8,9, 10. Критические доказательства в поддержку существования этих переходно сформированных смешанных комплексов JDP в эукариотических клетках были предоставлены PLA8.

НОАК все чаще используется для оценки белковых взаимодействий в метазоах, в первую очередь в клетках млекопитающих. Здесь мы сообщаем об успешном расширении этой техники для мониторинга переходно сформированных комплексов сопровождающего в эукариотических и прокариотических одноклеточных организмах, таких как подающий надежды дрожжи S. cerevisiae и бактерия E. coli. Важно отметить, что это расширение подчеркивает потенциальное использование НОАК в обнаружении и анализе микробов, которые инфицируют клетки человека и животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клетки HeLa

  1. Подготовьте следующие материалы: PBS (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мм КХ2PO4),рН 7,4; DMEM, дополненный 10% FCS и 1% Pen-Strep; 4% параформальдегида в PBS; 0,5% Тритон-X100 в PBS; TBS-T (150 мМ NaCl, 20 мм Трис, 0.05% Tween), рН 7,4; 0,0001% стерильный поли-l-лизинный раствор; 10-ну хорошо диагностические слайды; влажная камера; бумага ткани; и Коплин слайд-окрашивания банки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимальной эффективности фиксации, параформальдегидные растворы должны быть подготовлены свежими перед каждым экспериментом.
  2. Подготовка влажной камеры, покрывая дно закрытой коробки с мокрыми тканями. Поместите влажную камеру при температуре 37 градусов по Цельсию перед началом эксперимента, чтобы обеспечить температуру камеры на уровне 37 градусов по Цельсию при инкубации ферментативных реакций.
  3. Культура HeLa клетки в T25 колбы, в 5 мл DMEM (Высокая глюкоза, глутамат и натрий Pyruvate дополняется) дополнены 10% FCS и 1% Pen-Strep, в 37 C CO2 инкубатор, содержащий 5% CO2. Диссоциативные клетки адептов, используя 0,05% трипсин-ЭДТА. После добавления свежего DMEM для разъединения клеток, подсчитайте клетки с помощью камеры подсчета клеток и растете на диагностических слайдах внутри влажной камеры.
  4. Стерилизовать диагностические слайды с помощью УФ-облучения в стерильной культуре клеток капот в течение 30 минут.
  5. Добавьте 100 л стерильного фильтрованного 0,0001% поли-л-лизина к каждой скважине, необходимой для эксперимента. Инкубировать в течение 30 мин. Смойте избыток поли-L-лизин, промывая каждый колодец 3x с 50 л ультрачистой воды.
  6. Попробуйте клетки HeLa и добавить около 15000 клеток к каждой скважине. При необходимости разбавить клетки, по крайней мере, до 30-50 л DMEM на скважину.
  7. Выращивайте клетки во влажной камере в пределах инкубатора CO2 37 градусов по Цельсию 5% для приблизительно 24 ч. Клетки должны быть 60%-80% сливочные до начала PLA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком высокая выпуклость уменьшает поглощение реагентов, уменьшая полученный сигнал в конце протокола.
  8. Удалите среду, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте скважины 3x с 50 Л Л PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут отделяться, когда жидкости добавляются жестко. Это можно предотвратить, не давая скважины полностью высохнуть, прежде чем добавлять новую жидкость и, добавив новую жидкость осторожно к краю скважины.
  9. Исправьте клетки, добавив 50 л свежеприготовленного 4% параформальдегида в PBS к каждому колодцу. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  10. Вымойте слайды 3x в PBS. Выполните стирки в слайд-окрашивание банку Коплин, содержащий 100 мл PBS. Для каждой стирки, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без тряски.
  11. Permeabilize клеточной мембраны путем погружения слайдов в 100 мл 0,5% Triton-X100 в PBS в Коплин слайд-окрашивания банку. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре без тряски.
  12. Вымойте слайды 3x в TBS-T. Выполните стирки в слайд-окрашивной банке Коплина, содержащей 100 мл TBS-T. Для каждой стирки, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без тряски.
  13. После последней стирки удалите лишний буфер с помощью бумажной бумаги. На данный момент ячейки готовы к протоколу проверки близости, который будет обсуждаться в разделе 4.

2. S. cerevisiae Подготовка клеток

  1. Подготовьте следующие материалы: 100 мМ KPO4, pH 6.5, именуемый Wash Buffer; 37% формальдегида; 4% параформальдегид в 100мМ КПО 4, рН 6,5; 1,2 м сорбитола в 100мМ КПО 4, рН 6,5; литикасный раствор (500 мкг/мл литикса, 20 мм-меркаптоэтанол, 100 мМ КПО4,рН 6,5); 0,0001% поли-L-лизинового раствора; 1% Тритон-X100 в 100мМ КПО 4, рН 6,5; 10-ну хорошо диагностические слайды; влажная камера (подготовлена как в шаге 1.2); бумага ткани; и Коплин слайд-окрашивания банки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимальной эффективности фиксации, параформальдегидные растворы должны быть подготовлены свежими перед каждым экспериментом.
  2. Выращивайте ночную культуру в неселективном дрожжевом экстракте, Пептоне и Декстрозе (YPD) при 30 градусах Цельсия во время встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных требований S. cerevisiae клетки могут быть выращены в синтетических Полный (SC) среды или селективного синтетического минимального (SM) среды вместо.
  3. Разбавить стационарную культуру доOD 600 из 0,1 в среде 20 мл. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия, пока встряхнись, пока OD600 не достигнет 0,5.
  4. Перенесите культуру 20 мл на центрифугу 50 мл. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Приготовьте клетки в 5 мл свежей среды.
  5. Исправить клетки, добавив 550 л 37% формальдегида в культуру. Инкубировать при комнатной температуре 15 мин.
  6. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Отдохните гранулы в 1 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида в Wash Buffer. Инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
  7. Во время инкубации подготовьте диагностические слайды, добавив 100 л из 0,01% поли-л-лизинового раствора к каждой скважине. Инкубировать горки в течение 30 минут при комнатной температуре.
  8. После 30 минут смойте излишки поли-L-лизин ультрачистой водой и дайте горки высохнуть. Сухие горки готовы к использованию.
  9. Вымойте клетки дважды с 1 мл мытья буфера. Выполните моет центрифугирование клеток при 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант и resuspend клетки в мытье буфера.
  10. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Приостановите действие клеток в 1 мл 1,2 М сорбитола в wash Buffer.
  11. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Приостановите гранулы в 250 л свежеподготовленного раствора Lyticase для переваривания клеточной стенки. Инкубировать клетки в растворе Lyticase в течение 15 мин при 30 градусах По Цельсия во время встряхивания.
  12. После пищеварения, мыть клетки 3x центрифугирование на 665 х г в течение 3 мин и удалить супернатант. Приостановите действие клеток в 250 зл 1,2 М сорбитола в стиральном буфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что клетки хрупкие после переваривания стенки клетки, resuspend их очень тщательно, чтобы не повредить клетки.
  13. Добавьте 20 зл и подвесных клеток к поли-L-лизинпокрытие покрытые слайды. Разрешить им прикрепить к слайдам в течение 30 мин. Смойте неприсоединения клеток путем мытья скважин 3x с 50 Зл мыть буфера.
  14. Пермяки клетки мембраны путем мытья 3x с 50 зл и 1% Triton-X в мытье буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент ячейки готовы к протоколу перевязки близости, который будет обсуждаться в разделе 4.

3. E. coli Cell Preparation

  1. Подготовьте следующие материалы: PBS-T (140 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 8 мМ K2HPO4, 1,5 мМ КХ2PO4, 0.05% Tween-20), pH 7.4; раствор лизозима (2 мг/мл lysozyme, 25 мм Tris-HCl pH 8.0, 50 мМ Глюкоза, 10 мм EDTA); 0,0001% поли-L-лизинового раствора; 99% ледяного метанола; 99% комнатной температуры метанола; 99% ацетона; 10-ну хорошо диагностические слайды; влажная камера (подготовлена как в шаге 1.1.1); бумага ткани; и Коплин слайд-окрашивания банки.
  2. Выращивайте ночную культуру в средней среде Лурия-Бертани (LB) при 30 градусах по Цельсию во время встряхивания.
  3. Разбавить стационарную культуру до OD600 0.02 в свежем носителе LB. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия, пока встряхнись, пока OD600 не достигнет 0,4 для клеток фазы журнала.
  4. Приблизительно 15 минут, прежде чем клетки достигнут OD600 из 0,4, подготовить поли-L-лизин покрытием слайды, добавив 100 зл и 0,0001% поли-L-лизин к каждой скважине. Инкубировать горки в течение 30 минут при комнатной температуре.
  5. После 30 минут смыть излишки поли-L-лизин с ультрачистой водой и дайте горки воздух ассоциироваться. Сухие горки готовы к использованию.
  6. Когда клетки достигают OD600 из 0,4, перенесите 1 мл культуры в стерильную микроцентрифуговую трубку и клетки гранул при 2650 х г в течение 2 мин.
  7. Повторное действие клеток в 50 злителе среды LB.
  8. Исправить клетки, добавив 1 мл ледяного 99% метанола. Смешайте очень осторожно вручную. Инкубировать клетки в течение 30 мин при -20 градусах Цельсия.
  9. После фиксации добавьте 20 злиц ячеек к поли-L-лизин покрытием слайдов. Пусть горки воздух ассоциируется в течение 30 минут.
  10. Добавьте 50 зл свежеприготовленного раствора лиззима к каждому колодцу, чтобы переварить клеточную стенку. Инкубировать во влажной камере в течение 30 мин при 25 градусах Цельсия.
  11. Удалите раствор лизозима из колодцев, добавив бумажную к краю колодца. Вымойте слайды 3x в 100 мл PBS-T. Выполните каждую стирку в коплин слайд-окрашивания банку для 30 с, без тряски.
  12. Удалите буфер стирки со слайдов, нажав слайды на бумажную ткань.
  13. Пермяки клетки мембраны, добавив 50 зл 99% метанола к каждой скважине. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  14. Удалить метанол, поместив бумагу на краю колодца.
  15. Добавьте 50 л из 99% ацетона к каждому колодцу. Инкубировать 1 мин.
  16. Удалите лишний ацетон, поместив бумагу на край колодца. Разрешить слайды воздух ассоциироваться. На данный момент ячейки готовы к протоколу перевязки близости, который будет обсуждаться в разделе 4.

4. Проверка лиги

  1. Подготовьте следующие материалы: Блокирование буфера; Буфер разбавления антител; Мойка буфера 'A' - (10 мм Трис, 150 мм NaCl, 0.05% Tween-20) рН 7.4; Мыть буфер 'B' - (200 мм Трис, 100 мм NaCl) рН 7,4; Анти-Кролик Вторичное Антитело PLUS; Анти-мышь Вторичное Антитело МИНУС; 5x Ligation Buffer; лигаза; 5x Усиление Буфер (оранжевый: йex 554 нм;em 576 нм); полимераза; ультрачистая вода; и монтаж среды, содержащей DAPI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты обнаружения PLA также доступны в вариантах Зеленый (Noex 495 нм;й ет 527 нм), Красный (ex 594 нм;й 624 нм), FarRed (Ex 644 нм;м 669 нм) или Брайтфилд (хиндаиш пероксидаза (HRP) конъюгированный).
  2. Блокируйте ячейки, добавляя каплю блокирующего буфера к каждому колодцу. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию во влажной камере.
  3. Подготовка антител решения путем разбавления запасов антител в антитела разбавления буфера. Для каждой скважины требуется 40 л антитела.
  4. Удалите блокирующий буфер, поместив бумагу на краю скважины. Добавьте 40 л антител, разбавленных в буфере разбавления антител к каждому колодцу. Инкубировать в течение 60 минут во влажной камере при 37 градусах Цельсия или на ночь при 4 градусах Цельсия.
  5. Удалить раствор антител из скважин, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'A' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 5 минут, без тряски.
  6. Во время мытья шаги, разбавить 5x вторичных зондов антитела, анти-кроличьи PLUS и анти-мышь MINUS (видовспецифика зондов зависит от первичных используемых антител), в антитела разбавления буфера. Приготовьте 40 л раствора антител на скважину.
  7. Добавьте 40 qL вторичного раствора антитела к каждому хорошо. Инкубировать в течение 60 мин при 37 градусах по Цельсию во влажной камере.
  8. Удалите вторичный раствор антитела из колодцев, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'A' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 5 минут, без тряски.
  9. Во время стирок приготовьте 40 л перевязочной смеси на скважину, смешивая 8 зл и 5-х лигации буфера, 31 л ультрачистой воды и 1 зл лигации.
  10. Добавьте 40 qL перевязочной смеси к каждому колодцу. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию во влажной камере.
  11. Удалите перевязочную смесь из колодцев, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'A' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 2 минут, без тряски.
  12. Во время стирок приготовьте 40 ql смеси усиления на скважину, путем смешивания 8 злификации раствора 5x, 31,5 л ультрачистой воды и 0,5 л полимеразы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Усилитель 5x содержит флуоресцентные зонды. Защитите эту смесь от света. Кроме того, защитить слайды от света во время каждого из следующих шагов. При использовании полупрозрачных Коплин слайд-окрашивания банки и влажные камеры, оберните их в алюминиевую фольгу.
  13. Добавьте 40 qL смеси усиления в скважину. Инкубировать в течение 100 мин при 37 градусах По Цельсию во влажной камере.
  14. Удалите смесь усиления из колодцев. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'B' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 10 минут без тряски.
  15. Вымойте слайды в 100 мл мыть буфера 'B' разбавленной 1:100 в ультрачистой воде в Коплин слайд-окрашивания банку для 30 с.
  16. Добавьте к слайдам 20 КЛ DAPI, содержащий монтажную среду на скважину. Закройте слайды с крышкой и уплотнения слайды с лаком для ногтей.
  17. Если изображение, немедленно инкубировать DAPI, содержащий монтаж среды в течение 10-15 мин, в то время как защищены от света. Если нет, храните горки при -20 градусов по Цельсию в течение 1 недели, защищенные от света.

5. Обнаружение

  1. Используйте конфокальную микроскопию для получения изображений клеток HeLa, S. cerevisiae и E. coli с 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA и 100x/1.4 NA Plan Apochromat целей, соответственно. Возбуждайте ОКРАШЕННЫй ДНК DAPI с помощью импульсного диодного лазера площадью 405 нм. Для сигнала PLA (для этого изучения) excite с лазером твердого тела 561 nm.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наши предыдущие исследования in vitro с использованием очищенных белков показали, что подмножество человеческого класса А и класса B JDPs образуют переходные комплексы смешанного класса JDP для эффективного таргетирования широкого спектра агрегированных белков и, возможно, облегчает сборку Hsp70 на основе белковые дезагрегаты7. Мы использовали PLA, чтобы определить, являются ли смешанные комплексы jDP класса (AB) в клетках рака шейки матки (HeLa). Человеческие JDPs DNAJA2 (класс A) и DNAJB1 (класс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В качестве давних методов для характеристики белковых сборок использовались подходы, основанные на социопротеии и локализации. Обнаружение переходно сформированных конкретных комплексов сопровождающего является серьезной проблемой при таких традиционных методах, и в результате предыдущие выводы в значительной степени ограничиваются качественными интерпретациями. Методы совместного иммунопрецитирования на основе лизиса на основе клеток часто требуют перекрестного соединения для стабилизации белково-белковых взаимодействий...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

NBN поддерживается специальным грантом на набор персонала из Университета Монаш факультета медицины медсестер и медицинских наук при финансировании со стороны правительства штата Виктория и австралийского правительства. Мы благодарим Бернда Букау (МБХ, Гейдельбергский университет, Германия) и Харм Х. Кампинга (Департамент биомедицинских наук клеток и систем, Университет Гронингена, Нидерланды) за их неоценимую поддержку и обмен реагентами, Хольгер Лоренц (КмБХ) Imaging Facility, Гейдельбергский университет, Германия) за поддержку с конфокальной микроскопии и обработки изображений, и Клэр Херст (ARMI, Университет Монаша, Австралия) для критического чтения рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
37% формальдегидMerck103999
ацетонSigma-Aldrich32201
антитело против DNAJA2Abcamab157216
антитело против DNAJB1Enzo Life SciencesADI-SPA-450
антитело против DnaKв доме
антитело против mCherryAbcamab125096
анти-Sis1 антителоCosmo Bio CorpCOP-080051
анти-Ydj1 антителоStressMarq Biosciences  SMC-150,
анти-YFP антителаВнутри дома
Баночка для окрашивания предметного стекла CoplinSigma-AldrichS5516
Диагностические стеклаMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink Реагенты для обнаружения in situ OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Монтажная среда для промежуточного монтажа + DAPISigma-AldrichDUO82040
DuoLink Зонд In Situ PLA Anti-Mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink In Situ Wash Буферы, флуоресцентныеSigma-AldrichDUO82049
сыворотка для телятплода Thermo-Fischer10082147
ЛизоцимСигма-Олдрич62971
МетанолСигма-Олдрич32213
ПараформальдегидСигма-ОлдричP6148
Пенициллин/стрептомицинТермо-Фишер15070063
поли-L-лизинСигма-ОлдричP47-07
СорбитСигма-ОлдричS7547
Triton-X100Merck108643
ТрипсинТермо-Фишер25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolase 100T / / LyticaseUnited States BiologicalZ1004

Ссылки

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679(2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод анализа лигации по близоститранзиторные белковые взаимодействияJ-доменные белкишаперон Hsp70контроль качества белковклеточный протеостазсубклеточная локализацияспецифичность антителпокрытие поли-L-лизиномпереваривание клеточной стенки дрожжей
В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.