Методическая статья

Наноскопическое изображение секций тканей человека с помощью физического и изотропного расширения

DOI:

10.3791/60195

⸱

25 сентября 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2QPathology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наноразмерная визуализация образцов клинических тканей может улучшить понимание патогенеза болезни. Расширение патологии (ExPath) является версия расширения микроскопии (ExM), модифицированный для совместимости со стандартными клиническими образцами ткани, для изучения наномасштабной конфигурации биомолекул с помощью обычных дифракционных ограниченных микроскопов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В современной патологии оптическая микроскопия играет важную роль в диагностике заболеваний, выявляя микроскопические структуры клинических образцов. Однако фундаментальный предел физической дифракции предотвращает допрос наномасштабной анатомии и тонкие патологические изменения при использовании обычных оптических подходов к визуализации. Здесь мы описываем простой и недорогой протокол, называемый патологией расширения (ExPath), для наномасштабного оптического изображения общих типов клинических образцов первичной ткани, включая как фиксированные замороженные или формалин-фиксированный парафин встроенные (FFPE) ткани Разделы. Этот метод обходит предел оптической дифракции путем химического преобразования образцов тканей в гибрид ткани-гидрогеля и физически расширяя их изотрополено через несколько масштабов в чистой воде. Благодаря расширению, ранее неразрешимые молекулы отделяются и, таким образом, могут наблюдаться с помощью обычного оптического микроскопа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование молекулярной организации тканей в трехмерном (3D) контексте может дать новое понимание биологических функций и развития болезней. Тем не менее, эти наноразмерные среды выходят за рамки возможностей разрешения обычных дифракционных ограниченных микроскопов (200–300 нм), где минимальное разрешимое расстояние, d определяется d q /NA. Здесь длина волны света и NA является численной диафрагмы (NA) системы визуализации. В последнее время прямая визуализация флуоресцентно маркированных молекул стала возможной благодаря недавно разработанным методам визуализации суперразрешения1,2,3,включая стимулирующее истощение выбросов (STED), фотоактивированная микроскопия локализации (PALM), стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и структурированная иллюминация микроскопии (SIM). Хотя эти методы визуализации произвели революцию в понимании биологической функции на наноуровне, на практике они часто полагаются на дорогостоящее и/или специализированное оборудование и этапы обработки изображений, могут иметь более медленное время приобретения по сравнению с обычные оптические изображения, требуют флюорофоров с конкретными характеристиками (например, возможность переключения фотографий и / или высокой фотостабильности). Кроме того, остается сложной задачей для выполнения 3D-супер-разрешение изображения на образцах тканей.

Микроскопия расширения (ExM), впервые введенная в 20154,обеспечивает альтернативное средство визуализации наноразмерных объектов (Злт;70 нм) путем физического расширения сохранившихся образцов, встроенных в набухаемый полиэлектролитовый гидрогель. Здесь ключевые биомолекулы и/или этикетки закреплены на месте в полимерной сети, которая может быть изотопно расширена после химической обработки. Поскольку физическое расширение увеличивает общее эффективное разрешение, молекулы, представляющие интерес, могут быть решены с помощью обычных систем визуализации с ограниченной дифракцией. С момента публикации оригинального протокола, где пользовательские синтезированные флуоресцентные этикетки были закреплены на полимерной сети4, новые стратегии были использованы для непосредственного якоря белков (задержка белка ExM, или proExM)5, 6,7,8,9 и РНК9,10,11,12 к гидрогелю, и увеличить физическое увеличение через итеративные расширение13 или адаптации гель химии8,14,15.

Здесь мы представляем адаптированную версию proExM, называемую патологией расширения (ExPath)16, которая была оптимизирована для форматов клинической патологии. Протокол преобразует клинические образцы, в том числе формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE), гематоксилин и эозин (H и E) окрашенных, и свежезамороженных человеческих тканей образцов, установленных на стеклянных слайдах, в состояние, совместимое с ExM. Белки затем прикрепляется к гидрогелю и выполняется механическая гомогенизация(рисунок 1)16. С 4-кратным линейным расширением образцов, многоцветные супер-разрешение (70 нм) изображения могут быть получены с помощью обычного конфокального микроскопа, имеющего только разрешение в 300 нм, а также могут быть объединены с другими методами визуализации супер-разрешения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка фондовых реагентов и решений

  1. Приготовьте компоненты раствора гелеобразующего.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Концентрация раствора приведена в g/mL (w/v процент).
    1. Сделать следующие фондовые решения: 38% (w/v) акрилат натрия (SA), 50% (w/v) акриламид (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), и 29.2% (w/v) хлорид натрия (NaCl). Растворите соединения в двойной деионизированной воде (ddH2O). Используйте суммы в таблице 1 в качестве эталона; подготовленные решения могут быть масштабированы вверх или вниз по объему по мере необходимости. Например, чтобы сделать 10 мл из 38% (w/v) SA раствор, добавьте 1,9 г SA к цилиндру 10 мл и добавьте ddH2O в объем 5 мл.
    2. Приготовьте 9,4 мл мономерного раствора при концентрации 1,06x, как показано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к концентрации 1x после добавления инициатора, ускорителя и ингибитора. Запас мономеров может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 месяцев или при -20 градусов для длительного хранения.
    3. Подготовьте следующие стоковые растворы отдельно в ddH2O: 0,5% (w/v) ингибитора 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпипилипидин-1-оксил (4HT), который ингибирует гелеобразуцию, чтобы позволить диффузию раствора гелегеля в ткани, 10% (v/v) инициатор тетраметилэтиленедиамиамин (TEMED), который ускоряет радикальное выработку аммония persulfate (APS), и 10% (w/v) APS, который инициирует процесс гелегелинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы 4HT и TEMED могут быть подготовлены в 1 мл aliquots и храниться при -20 градусов по Цельсию в течение не менее 6 месяцев. Было установлено, что APS теряет эффективность после длительного хранения и лучше всего готовить в небольших количествах (0,1 мл) непосредственно перед гелеобразующей.
  2. Подготовка пищеварения буфера (50 мМ Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0,5% "W/v" неионический сурфактант, 0,8 М NaCl) путем объединения 25 мл 1 M Tris pH 8 (3,03 г базы Tris в 25 мл ddH2O), 25 мл EDTA (0,5 м. , 2,25 г неионического сурфактанта и 23,38 г NaCl. Добавьте ddH2O общим объемом 500 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение можно масштабировать вверх или вниз по мере необходимости и храниться при 4 градусах Цельсия. Протеиназа K (ProK) будет добавлена непосредственно перед шагом пищеварения.
  3. Приготовьте 20 мМ натриевого цитрата раствора, объединив 2,941 г трибазового дигидрата натрия с 500 мл дДГ2О и регулировав рН до 8,0 при комнатной температуре (RT). Масштабируйте объем запасов по мере необходимости.
  4. Подготовка стокового раствора 6-((акрилоил)аминокислоты, синцимидилового эфира (акрилоил-Х, SE; AcX), якорь соединения. Растворите AcX в 500 л ангидроусового диметилсульксида (DMSO) для конечной концентрации 10 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться в высохшой среде при -20 градусов по Цельсию в 20 аликотах.
  5. Если не использовать коммерчески доступные буферы для иммуно-пятна, подготовьте блокирующий буфер. Используйте блокирующий буфер в размере 5% (v/v) нормальной сыворотки животных и 0,1% (w/v) нонионического сурфактанта в 1x фосфатно-буферизированном сольнике (PBS) и выберите сыворотку на основе животного-хозяина вторичных антител. Например, чтобы подготовить 500 мл блокирующий буфер для антител, поднятых у козы, смешайте 25 мл козьей сыворотки, 0,45 г нонионического сурфактанта и 1x PBS на объем 500 мл.

2. Подготовка архивных и свежеподготовленных клинических тканей слайды для ExPath

  1. Преобразуйте ткань в совместимый формат ExPath. Выберите один из четырех следующих шагов (2.1.1-2.1.4) на основе того, как был подготовлен образец: слайды FFPE, окрашенные слайды FFPE, или нефиксированные или фиксированные замороженные слайды ткани в оптимальном решении температуры резки (OCT).
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Они основаны на стандартных шагах восстановления образцов патологии и не являются специфическими для протокола ExPath.
    1. Клинические образцы FFPE
      1. Приготовьте 30 мл 95% этанола, 70% этанола и 50% этанола. Измерьте 30 мл ксилена, 100% этанола и ddH2O.
      2. Поместите слайд с образцом в 50 мл конического с помощью щипки и добавить 15 мл ксилена. Крышка трубки и поместите его горизонтально на орбитальный шейкер примерно на 60 об / мин и инкубировать на RT в течение 3 минут для каждого решения. Повторите с остальными 15 мл ксилена.
      3. Повторите шаг 2.1.1.2 со 100% этанолом, 95% этанолом, 70% этанолом, 50% этанолом и ddH2O вместо ксилена.
    2. Запятнанные и установленные постоянные горки
      1. Поместите горку в 100 мм чашку Петри и накройте ксиленом. Аккуратно удалите крышку с помощью лезвия бритвы. Если крышка не легко удалить, верните слайд к силену до тех пор, пока крышка не ослабит.
      2. Процесс с использованием шагов для образцов FFPE (шаги 2.1.1.1-2.1.1.3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В случае H и E окрашенных слайдов, пятна устраняются в процессе расширения.
    3. Нефиксированные замороженные ткани в растворе OCT
      1. Зафиксировать ткань в ацетоне при -20 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
      2. Вымойте образцы с 1x PBS решение 3 раза в течение 10 минут каждый на RT.
    4. Ранее фиксированные, замороженные клинические слайды ткани
      1. Инкубировать слайды в течение 2 мин на RT, чтобы расплавить раствор OCT.
      2. Вымойте образец с 1x PBS решение 3 раза в течение 5 минут каждый на RT.
  2. Выполните тепловую обработку для поиска антигена на всех образцах после преобразования формата.
    1. Добавьте 20 мМ цитрат раствор (pH 8 на RT) в термостойком контейнере, например, в банку для окрашивания слайдов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там должно быть достаточно раствора для покрытия ткани, установленной на слайде (50 мл для стандартной слайд окрашивания банку).
    2. Нагрейте раствор цитрата до 100 градусов по Цельсию в микроволновой печи и поместите слайд в раствор. Немедленно перенесите контейнер в инкубационную камеру и инкубацию при 60 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Слайды могут быть помещены в чашках Петри и покрыты 1x PBS и храниться при 4 градусах Цельсия.
  3. Пятно образца с использованием стандартных иммунофлуоресценции (IF)/иммуногистохимии (IHC) окрашивания протоколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Специфические концентрации первичных и вторичных антител и длительность окрашивания зависят от концентраций, предложенных производителем, или от оптимизации для конкретного эксперимента.
    1. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг ткани раздела (ы) на слайде, чтобы свести к минимуму объем раствора, необходимого для покрытия ткани. Поместите слайд в блюдо достаточно большой, чтобы соответствовать слайд. Для стандартной 3-дюймовой горки используйте 100-мм чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофобная ручка не мешает полимеризации образца и процессу пищеварения.
    2. Инкубировать ткань с блокирующим буфером на 1 ч при 37 градусах По кв.м., 2 ч на РТ или на 4 градуса Цельсия на ночь, чтобы уменьшить неспецифические связывания.
    3. Разбавить первичные антитела к желаемой концентрации в соответствующем количестве подготовленного блокирующего буфера (или другого предпочтительного буфера окрашивания). Инкубировать ткани с основным раствором антитела, по крайней мере 3 ч на RT или 37 градусов по Цельсию, или на ночь при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть помещены в увлажненный контейнер (например, чашка Петри с влажной салфеткой), чтобы предотвратить высыхание тканей. Как правило, антитела были разбавлены до 1:100-1:500 в 200-500 л буфера, в зависимости от размера ткани и используемых антител.
    4. Вымойте ткань с подготовленным блокирующим буфером (или другим предпочтительным буфером для мытья) 3 раза в течение 10 минут на RT.
    5. Разбавить вторичные антитела (и 300 nM 4 ",6-диамидино-2-фенилинола »DAPI» при желании), в подготовленном блокирующем буфере (или другом предпочтительном буфере окрашивания) до концентрации приблизительно 10 мкг/мл. Инкубировать ткани во вторичном растворе антитела, по крайней мере 1 ч на RT или 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки могут быть скорректированы в зависимости от используемых антител и толщины ткани. Вторичные антитела, содержащие красители цианина (Cy3, Cy5, Alexa 647), не совместимы с протоколом ExM при применении предварительной полимеризации. Предлагаемые красители включают Alexa 488 (зеленый), Alexa 546 (оранжевый/красный), и Atto 647N или CF633 (далеко-красный). DAPI должен быть повторно применен после расширения, так как он смывается в процессе расширения.
    6. Вымойте ткань с подготовленным блокирующим буфером (или другим предпочтительным буфером для мытья) 3 раза в течение 10 минут каждый на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Слайды могут быть помещены в чашках Петри и покрыты 1x PBS и храниться при 4 градусах Цельсия.
    7. Выполняйте флуоресцентную визуализацию с помощью обычного широкоугольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по выбору.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для определения биологической длины с использованием фактора расширения путем сравнения изображений до и после расширения. Для облегчения изображения после расширения следует отбирать легко идентифицируемые области, представляющие интерес, и собирать изображения как при низком, так и при высоком увеличении.

3. На ситу полимеризация образцов

  1. Инкубировать образец в якорном растворе.
    1. Подготовьте якорный раствор (обычно 250 л достаточно, чтобы покрыть секцию тканей) путем разбавления раствора acX в 1x PBS до концентрации 0,03 мг/мл для образцов, зафиксированных неальдегидными фиксаторами или 0,1 мг/мл для образцов, зафиксированных альдегидными фиксаторами , которые имеют меньше свободных аминов доступны реагировать с AcX.
    2. Поместите слайд в 100 мм Чашка Петри и пипетка якорь решение над тканью. Инкубировать не менее 3 ч на RT или на ночь при 4 градусах Цельсия.
  2. Инкубировать образцы в растворе гелеобразующего.
    1. Приготовьте не менее 100-кратного избыточного объема раствора гелеобразующего. На 200 кЛ, объедините следующее, в порядке: 188 л мономерного раствора, 4 л 0,5% 4HT биржевого раствора (1:50 разбавления, конечная концентрация: 0,01%), 4 л 10% стокового раствора TEMED (1:50 разбавления, конечная концентрация 0,2%) и 4 л 10% apS- разбавления, конечная концентрация 0,2%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор gelling следует сделать непосредственно перед использованием. Раствор должен быть на уровне 4 градусов по Цельсию и APS раствор должен быть добавлен последним, чтобы предотвратить преждевременное gelling.
    2. Удалите лишний раствор из ткани и поместите слайд в 100 мм чашку Петри. Добавьте свежий, холодный раствор гелеобразующего к образцу и инкубировать смесь на ткани в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы позволить диффузии раствора в ткани.
  3. Постройте камеру на слайде вокруг образца(Рисунок 2А), не нарушая раствор гелеобразующего.
    1. Сделать прокладки для гелеобразующей камеры тонко резки куски крышки стекла с помощью алмазного ножа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения расширения изображения после, прокладки должны быть близко по толщине к образцу ткани, чтобы уменьшить количество чистого геля над тканью. Стекло номер 1,5 может быть использовано для стандартных клинических образцов (5–10 мкм). Обложка стекла части могут быть уложены для более толстых образцов.
    2. Защищайте прокладки по обе стороны ткани, используя капли воды (10 евро).
    3. Тщательно поместите крышку крышки крышки крышки над слайдом, убедившись, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха над тканью(Рисунок 2B).
  4. Инкубировать образец при 37 градусах Цельсия в увлажненной среде (например, закрытое блюдо Петри с влажной салфеткой) в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Слайд-камера может храниться внутри запечатанной чашки Петри при 4 градусах Цельсия.

4. Образец пищеварения

  1. Снимите крышку гелеобразующей камеры, аккуратно раздвижной лезвием бритвы под крышкой и медленно поднимая крышку с поверхности геля. Обрезать пустой гель вокруг ткани, чтобы свести к минимуму объем. Вырезать гель асимметрично отслеживать ориентацию геля после гомогенизации, так как образец станет прозрачным.
    1. Разбавить ProK на 1:200 в буфере пищеварения (окончательная концентрация 4 U/mL) перед использованием. Подготовьте достаточное решение, чтобы полностью погрузить гель; один колодец из четырех колодцев пластиковой пластины культуры клеток требует по крайней мере 3 мл на скважину.
    2. Инкубировать образец в закрытом контейнере, содержащем буфер пищеварения в течение 3 ч при 60 градусах Цельсия. Если образец не отсоединяет от слайда во время пищеварения, используйте лезвие бритвы, чтобы аккуратно удалить образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть полностью погружен в буфер пищеварения, чтобы предотвратить высыхание образца и помещен в крытый контейнер (маленькая слайд-бокс, пластиковая скважина, чашка Петри и т.д.), которая может быть запечатана пленкой.

5. Расширение образцов и визуализация

  1. Используйте мягкую кисть для переноса образца в 1x PBS в контейнере, совместимом с желаемой системой визуализации и достаточно большой, чтобы вместить полностью расширенный гель. Убедитесь, что ткань помещается с образца стороне вниз, если изображение на перевернутой системы или вверх, если изображение на вертикальной системе, чтобы свести к минимуму расстояние от цели изображения к образцу. При необходимости переверните гель с помощью мягкой кисти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Боковое освещение от светодиода может быть использовано, чтобы сделать их видимыми в жидкости. Стандартная 6-хорошая пластина может вместить образцы, которые имеют предварительно расширенный диаметр менее 0,6 см. Стеклянная нижняя пластина должна использоваться для визуализации на перевернутой системе.
  2. Вымойте образцы в 1x PBS на RT в течение 10 мин. При желании повторно пятно образца с 300 нм DAPI, как процесс пищеварения смейт DAPI пятно. Удалите PBS и пятно с 300 нм DAPI разбавленной в 1x PBS в течение 20 минут на RT, а затем 10 мин мыть с 1x PBS на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть покрыты 1x PBS и храниться при 4 градусах Цельсия, прежде чем перейти к следующему шагу.
  3. Чтобы расширить образцы, заменить PBS и мыть с избыточным объемом ddH2O (по крайней мере 10x окончательный объем геля) 3-5 раз в течение 10 минут каждый, на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После3-й или4-й стирки расширение образца должно начать наплато. Для хранения, чтобы предотвратить рост бактерий, ddH2O может быть дополнен 0,002% -0,01% азида натрия (NaN3). В этом случае конечный коэффициент расширения реверсивно снижается на 10%.
  4. Выполняйте флуоресценцию с помощью обычного широкоугольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по выбору.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения дрейфа гелей излишнюю жидкость можно удалить из скважины. Гели также могут быть обездвижены с агарозой с низким плавным газом на 1,5–2%. Приготовьте в воде низкорасплавленную агарозу в 2,4 раза больше объема раствора. Разогрейте раствор на водяной бане 40 градусов или в микроволновой печи в течение 10–20 с, чтобы растопить раствор. Пипетка расплавленная агароза по краям геля. После того, как агарозза затвердеть на RT или 4 кС, добавить воду в образец, чтобы предотвратить обезвоживание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Если протокол был успешно выполнен(рисунок 1), образцы будут отображаться как плоский и прозрачный гель после механической гомогенизации(рисунок 3A) и может расшириться в 3-4,5x в воде(рисунок 3B), обеспечение эффективного разрешения 70 нм в зависимости от конечного фактора расширения и системы визуализации используется5,16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол ExPath16, вариант proExM5, который может быть применен к наиболее распространенным типам клинических образцов биопсии, используемых в патологии, в том числе FFPE, H и E окрашенных, и свежезамороженных образцов на стеклянных слайдах. Преобразование формата, извлечение антигена и иммуностоирование образцов следуют общепринятым протоколам, которые не являются специфическими для ExPath. В отличие от оригинального протокола proExM...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y z и OB являются двумя из изобретателей, которые подали и получили патентную защиту на подмножестве технологий, описанных здесь (патенты США US20190064037A1, WO2018157074A1, и WO2018157048A1).

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана юридическим фондом университета Карнеги-Меллона (Y) и премией директора NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 в Y).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-гидрокси-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141Ингибитор
6-луночный стеклянный дно пластины (#1.5 покровное стекло)CellvisP06-1.5H-N
АцетонFischer ScientifcA18-500
АкриламидSigma AldrichA8887
Акрилоил-X, SE (AcX)InvitrogenA20770
AgaroseFischer ScientifcBP160-100
Персульфат аммония (APS)Sigma AldrichA3678Initiatior
Anti-ACTN4 антитело производится у кроликаSigma AldrichHPA001873
Anti-Collagen IV антитело производится у мышейSanta Cruz Biotechsc-59814
Антитело против виментина производится у курицыAbcamab24525
Aqua Hold II Гидрофобная ручкаНаучное устройство980402
Тканевая матрица для лечения распространенных заболеваний молочной железыAbcamab178113
DAPI (1 мг/мл)Thermo Scientific62248Алмазный нож для ядерного окрашивания
No 88 CMGeneral Tools31116
ЭтанолPharmco111000200
Этилендиаминтетрауксусная
кислота (ЭДТА) 0,5 М		VWRBDH7830-1
FFPE Образец почкиUSBiomaxHuFPT072
щипцы
козы против курицы IgY (H+L), высокоадсорбированный CF488ABiotium20020
козий антикуриный IgY (H+L), высокоадсорбированный CF633Biotium20121
Козий анти-кролик IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции Alexa Fluor 546InvitrogenA11010
MAXbind Окрашивающая средаActive Motif15253Может быть заменен на некоммерческий стаинговый буфер по выбору.
MAXblock Blocking MediumActive Motif15252Может быть заменен на некоммерческий буфер блокировки по выбору.
MAXwash Моющая средаActive Motif15254Может быть заменена на некоммерческий буфер для стирки по выбору.
Микрокрышка Стекло #1 (24 мм x 60 мм)VWR48393 106
Микрокрышка Стекло #1.5 (24 мм x 60 мм)VWR48393 251
N,N,N′-
Тетраметилэтилендиамин (TEMED)		Sigma AldrichT9281Ускоритель
N,N′-МетиленбисакриламидSigma AldrichM7279
Нормальная козья сывороткаJackson Immunoresearch005-000-121Для приготовления блокирующего буфера. Зависит от животного-хозяина вторичных антител.
Nunclon 4-луночный x 5 мл MultiDish Чашка для клеточных культурThermo Fisher167063Многолуночная пластиковая чашка для культивирования
Nunclon 6-луночная чашка для клеточных культурThermo Fisher140675
Nunc 15 мл  Коническийтермофишер339651
Nunc 50 мл  Конический Thermo Fisher339653
Орбитальный шейкер
Кисть
pH-метр
Фосфатный буферный раствор (PBS), 10x РастворFischer ScientifcBP399-1
Пластиковая чашка Петри (100 мм)Fischer ScientifcFB0875713
протеиназа K ( Класс молекулярной биологии)Thermo ScientificEO0491
Бритвенное лезвиеFischer Scientifc12640
Safelock Микроцентрифужные пробирки 1,5 млThermo Fisher3457
Safelock Микроцентрифужные пробирки 2,0 млThermo Fisher3459
Акрилат натрияSigma Aldrich408220
Хлорид натрияSigma AldrichS6191
Цитрат натрия трехосновной дигидратSigma AldrichC8532-1KG
Tris BaseFischer ScientifcBP152-1
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Агглютинин зародышей пшеницы, меченный CF640RBiotium29026
XylenesSigma Aldrich214736
для рисования

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165(2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

KFFPE

Похожие статьи