Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Массовая витрификация капель для первичного сохранения гепатоцитов

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60250

⸱

25 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

В этой статье

Краткое содержание

Данная рукопись описывает метод криоконсервации для больших количеств крысиных гепатоцитов, при котором первичные клетки предварительно инкубируются криопротекторными агентами при низкой концентрации и отрифицируются в крупных каплях.

Аннотация

Витрификация является перспективной безледной альтернативой классической медленной заморозке (приблизительно при температуре 1 кв/мин) криоконсервации биологических образцов. Витрификация требует чрезвычайно быстрых скоростей охлаждения для достижения перехода воды в стеклянную фазу, избегая при этом вредного образования льда. Хотя прединкубация криопротекторными средствами (CPA) может снизить критическую скорость охлаждения биологических образцов, высокие концентрации, как правило, необходимы для обеспечения свободного ото льда криоконсервации путем витрификации. В результате, витрификация затрудняется токсичностью CPA и ограничивается небольшими образцами, которые могут быть охлаждены быстро. Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения могут быть преодолены путем витрификации капель. Используя этот новый метод, клетки сначала предварительно инкубируются с низкой внутриклеточной концентрацией CPA. Используя быстрое осмотическое осмотическое обезвоживание, внутриклеточная CPA концентрируется непосредственно перед витрификации, без необходимости полностью уравновесить токсичные концентрации CPA. Обезвоживание клеток осуществляется в жидком устройстве и интегрируется с непрерывным высоким генерикцией больших размеров капель, которые витрифицированы в жидком азоте. Этот метод криоконсервации без оледочного льда с минимальной токсичностью CPA подходит для больших количеств клеток и приводит к повышению жизнеспособности гепатоцитов и метаболической функции по сравнению с классической медленной замораживанием криоконсервации. В данной рукописи подробно описаны методы успешного витрификации капель.

Введение

Потеря жизнеспособности клеток и метаболической функции после криоконсервации гепатоцитов по-прежнему является серьезной проблемой, которая ограничивает клинические применения1,2,3. Эталонным методом криоконсервации гепатоцитов является медленное замораживание, которое осуществляется путем предварительного инкубации гепатоцитов cpA (диметилсульфид (DMSO), глюкозы и альбумина) и последующего контролируемого замораживания скорости (приблизительно при температуре 1 кВ/мин) до криогенные температуры4,5. Несмотря на многие сообщения об оптимизации, токсичность CPA вместе с вредными осмотическими дисбалансами во время замораживания и механическим напряжением образования льда остаются фундаментальными недостатками медленного замораживания6,7.

Vitrification предлагает преимущество над медленным замораживанием в том ушибе из-за образования льда вполне во избежание сразу переходом участка воды в положение стекла6. Однако, чтобы достичь температуры перехода стекла чистой воды (-137 градусов по Цельсию), вода должна охлаждаться со скоростью порядка одного миллиона градусов по Цельсию в секунду (т.е. критическая скорость охлаждения), чтобы избежать образования льда над температурой перехода стекла8 . Добавление CPA может снизить критическую скорость охлаждения и увеличить температуру перехода стекла aqueous решений9. Однако, даже при высокой концентрации CPA (например, 40% v/v DMSO или выше) быстрые скорости охлаждения, тем не менее, необходимы для успешного витрификации8,9.

Требуемые темпы охлаждения и высокая концентрация CPA приводят к двум основным недостаткам витрификации. Во-первых, для обеспечения быстрого охлаждения образцы должны иметь низкую тепловую массу. Во-вторых, для достижения высоких концентраций CPA, избегая при этом осмотических травм, CPAs должны быть медленно введены и полностью уравновешивать между внутри- и внеклеточными отсеками6. Это увеличивает время воздействия клеток на токсичные CPAs. Вместе это делает витрификацию громоздким процессом, который ограничивается несколькими небольшими образцами (микролитрами) за один раз. Витрификация droplet была предложена в качестве потенциального решения этих ограничений. Путем подвергать подвергать действию миниатюрные клетк-нагруженные капли (нанолитры) к жидкому азоту скорость охлаждения значительно увеличена, которая следовательно позволяет значительно уменьшение в концентрации CPA10,11,12 ,13,14. Хотя несколько высокочастотных капель генерирующих сопла потенциально могут быть использованы одновременно, очень небольшой размер капли ограничивает пропускную мощность до микролитров в минуту10, что исключает эффективное стеклоизацию больших клеток объемы с величинами более высокие темпы обработки на порядок миллилитров в минуту.

Недавно было продемонстрировано, что эти присущие ограничения витрификации могут быть преодолены с помощью объемной витрификации капель15. Этот новый метод использует быстрое осмотическое обезвоживание, чтобы сконцентрировать внутриклеточную концентрацию CPA 7,5% v/v этиленгликоль и DMSO непосредственно предшествующие витрификации, устраняя необходимость полного равновесия токсичных концентраций CPA. Клеточное обезвоживание осуществляется в жидком устройстве путем краткого воздействия гепатоцитов на высокую внеклеточное концентрацию CPA. Хотя это воздействие вызывает быстрое осмотическое обезвоживание, это слишком короткий для высокой концентрации CPA, чтобы диффундировать в клетки. Сразу после обезвоживания клетки загружаются в капли, которые непосредственно витрифицированы в жидком азоте. Этот метод устраняет необходимость полного внутриклеточного поглощения высоких концентраций CPA, в то время как высокая внеклеточное концентрация CPA позволяет витрификации крупных размеров капель, в результате чего высокие объемы пропускной способностью с минимальной токсичностью CPA.

Капля витрификация улучшает прямую и долгосрочную жизнеспособность после сохранения, а также морфологию и метаболическую функцию первичных крысиных гепатоцитов по сравнению с классической криоконсервацией путем медленного замораживания15. Данная рукопись содержит методологические детали для оплошной витрификации первичных крысиных гепатоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Первичные изоляции гепатоцитов для этого протокола были выполнены Cell Resource Core (CRC) в Массачусетской больнице общего профиля, Бостон, штат Массачусетс, США. Протокол о животных (#2011N000111) был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля.

1. Массовая витрификация капель

  1. Подготовьте решения для витрификации.
    1. Добавьте 40 мг бычьего сывороточки (BSA) в раствор 17,0 мл раствора Университета Висконсина (UW), чтобы сделать стеклоификационный раствор 1 (V1). Стерильный фильтр V1 раствор с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: UW является широко используемым решением сохранения органов. Содержит 50 г/л гидроксиэтил крахмала, 35,83 г/л лактобионической кислоты, 3,4 г/л моноосновных, 1,23 г/л магния сульфат гептагидрат, 17,83 г/л раффиноза пентагидрат, 1,34 г/л аденозин, 0,136 г/л аллопуринол, 0,992 г/л общий клейтатион, 5,61 г глютятиона, 5,61 г глютятиона, 5,61 г. /L гидроксид калия и гидроксид натрия для регулировки рН до 7,4.
    2. Комбинат 7,0 мл UW, 6,5 мл DMSO, 6,5 мл этиленгликоль (EG), 40 мг BSA, и 5,48 г сахарозы, чтобы сделать стекловидное решение 2 (V2). Стерильный фильтр V2 раствор с помощью фильтра 0,22 мкм. Загрузите 3,5 мл стерильного фильтрованного раствора V2 в шприц объемом 3 мл и храните при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения роспуска CPA, решения готовятся в больших количествах, чем требуется.
  2. Подготовьте объемкапли витрификационный аппарат.
    1. Для подготовки смешивания иглы, сначала вырезать вдоль одной стороны внешнего серого рукава микширования иглы, а затем согните рукав открытым, чтобы удалить его из микширования иглы.
    2. Сдвиньте две 25-мм силиконовые трубки разделов над входами микширования иглы и закрепите их положение клеем(рисунок 1A).
    3. Разрежьте иглу до длины 20 мм (т.е. длина внутренней сракаки), как показано на рисунке 1А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина иглы смешивания пропорциональна объему внутри иглы и поэтому может быть изменена для контроля времени воздействия гепатоцитов к высокому раствору концентрации CPA.
    4. Вставьте выход отсечки иглы смешивания в 20 G инъекционной иглы(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер иглы впрыска влияет на размер капли.
    5. Стерилизовать смешивания иглы сборки с помощью автоклавирования.
    6. Заполните стерильный Dewar жидким азотом. Стерилизовать за пределами Dewar с изопропанола до размещения Dewar в стерильных ламинарных клеточных клеток капот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнение является важным фактором при непосредственном воздействии капель на жидкий азот. Хотя в текущем протоколе не было загрязнения с использованием нестерилизованного жидкого азота, жидкий азот может быть отфильтроваемым или облученным, чтобы принеобходимостиобеспечить стерильность.
    7. Вставьте воронку с тем же внешним диаметром, что и внутренний диаметр жидкого азота Dewar, в коническую трубку мощностью 50 мл для создания устройства сбора капель(рисунок 1СиE).
    8. Погрузите устройство сбора капель в жидкий азот, медленно нажимая его в своем окончательном вертикальном положении с помощью больших щипц. Убедитесь, что коническая трубка лежит в вертикальном положении в нижней части Dewar (Рисунок 1DиE).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воронка должна оставаться вставленной и опираться на коническую трубку. Уровень жидкого азота должен быть на 1 см ниже высоты впускной воронки, как показано на рисунке 1D.
    9. Установите шприц насос атакжем в вертикальном положении на стене капота клеточной культуры, связывая строку с ног шприца насоса к винтам, выступающим от стены капота клеточной культуры.
    10. Поместите жидкий азот Dewar с устройством сбора капель под вертикально установленный шприц насос(рисунок 1E).
  3. Предварительно инкубировать с CPAs.
    1. После получения свежеисзолев крысиных гепатоцитов, подсчитайте концентрацию запасов трипансиний исключение и принять 40 миллионов жизнеспособных гепатоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нежная обработка гепатоцитов в подвеске имеет решающее значение для предотвращения смерти клеток.
    2. Центрифуга при 50 х г в течение 5 мин без тормоза.
    3. Приготовьте супернатант и отрепримите гепатоциты в 3,4 мл раствора V1.
    4. Инкубировать на льду 3 мин.
    5. Добавьте 150 кЛ ДМСО и 150 л ЭГ к гепатоцитам и аккуратно перемешайте.
    6. Инкубировать на льду 3 мин.
    7. Опять же, добавить 150 л ДМСО и 150 л EG к гепатоцитов и аккуратно перемешать.
    8. Загрузите 3,5 мл шприца 3 мл.
  4. Выполните витрификацию.
    1. Вставьте шприц с предварительно инкубированными гепатоцитами и шприцы раствора V2 на адаптер шприца.
    2. Прикрепите две женщины Luer замок шланг колючка адаптеры для шприцев и слайд силиконовые трубки смешивания иглы сборки над колючка фитинги (Рисунок 1F).
    3. Поместите всю сборку в шприц насос(Рисунок 1E).
    4. Через три минуты после последнего добавления DMSO и EG к гепатоцитам, запустите насос на 2 мл/мин.
    5. Остановить насос после того, как все гепатоциты были добавлены в жидкий азот.

2. Криогенное хранение

  1. Прокол 10 небольших отверстий в крышке конической трубки 50 мл с использованием иглы 20 G и оберните внешнюю крышку гибкой пленкой, как показано на рисунке 1B. Это создает клапан, который позволяет избежать испарения остатков жидкого азота.
  2. Для сбора витрифицированных капель гепатоцитов сначала удалите воронку из жидкого азота Dewar. Далее, используйте длинные щипцы, чтобы взять коническую трубку, которая содержит высыхает из жидкого азота и медленно вылить избыток жидкого азота из конической трубки.
  3. Закройте коническую трубку проколотой крышкой и непосредственно поместите закрытую коническую трубку с унциями витрифицированного гепатоцита обратно в жидкий азот Dewar.
  4. Перенос конической трубки из жидкого азота в криотанк паров жидкого азота.

3. Регрев капель взвития гепатоцитов

  1. Подготовьте решение для разогрева.
    1. Растворите 17,13 г сахарозы в 100 мл средств массовой информации культуры гепатоцитов DMEM, чтобы сделать решение для разогрева. Стерильный фильтр разогрева раствора с помощью фильтра 0,22 мкм и прогрейте до 37 градусов по Цельсию.
  2. Разогрейте гепатоциты.
    1. Возьмите коническую трубку с витрофифицированными гепатоцитами из криотака и транспортите ее в жидком азоте Dewar в капот клеточной культуры.
    2. Слегка ослабить крышку и положить конические трубки обратно в жидкий азот.
    3. Добавить витрифицированные капли гепатоцитов в пустой стакан, мгновенно добавить теплый (37 градусов по Цельсию) разогревающий раствор, и сразу же перемешать в течение 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно работать быстро, чтобы избежать замораживания во время повторногопотепления. В зависимости от требований к исследованию, несколько всех витрифицированных капель могут быть разогреты одновременно.
  3. Разгрузите раствор разогрева.
    1. Разделите раствор для разогрева гепатоцитами на две конические трубки 50 мл.
    2. Centrifuge две конические трубки в течение 2 мин при 100 х г при 4 градусах без тормоза.
    3. Прибавьте супернатант, чтобы оставить общий объем 12,5 мл, используя градационную отметку конической трубки в качестве эталона и добавить 12,5 мл ледяного льда DMEM на коническую трубку, чтобы разбавить раствор разогрева до 50%.
    4. Отдохните гепатоциты и инкубировать на льду в течение 3 мин.
    5. Добавьте 25 мл ледяного DMEM на коническую трубку, чтобы разбавить раствор разогрева до 25%.
    6. Центрифуга в течение 5 мин при 50 х г при 4 градусах без тормоза.
    7. Аспирировать супернатант и resuspend гепатоцитов в 2 мл желаемой среды культуры для использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование градиента плотности может быть использовано для удаления мертвых гепатоцитов из клеточной подвески при желании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Свежеизолированные первичные гепатоциты из пяти различных крысиных печени были использованы для прямого сравнения витрификации капель к классической криоконсервации с использованием выдающихся протоколов медленного замораживания, о которых сообщается в литературе4, 5. Короче говоря, гепатоциты были приостановлены в UW дополнены BSA (2,2 мг/мл), глюкозы (333 мм) и DMSO (10% v/v) и заморожены с помощью морозильной камеры контролируемой скорости. После хранения при...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Криоконсервация гепатоцитов путем медленного замораживания приводит к снижению жизнеспособности и метаболической функции. Витрификация предлагает перспективную альтернативу классической криоконсервации, так как замораживания травмы полностью избежать9. Тем не менее, предварительной инкубации с CPAs требуется для снижения критической скорости охлаждения8. Следовательно, витрификация затрудняется токсичностью CPA17 и ограничивается небольшими объемами ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют о конкурирующих финансовых интересах. Доктора де Врис, Венг, Тонер, Тессье и Уйгун имеют предварительные патентные заявки, имеющие отношение к данному исследованию. Д-р Uygun имеет финансовый интерес в Organ Solutions, компании, специализирующейся на разработке технологии сохранения органов. Все интересы исследователя управляются MGH и Partners HealthCare в соответствии с их политикой конфликта интересов.

Благодарности

Финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения США (R01DK096075, R01DK107875 и R01DK114506) и Министерства обороны США (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) является весьма признанным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BD Одноразовые шприцы 3 мл с наконечниками Luer-LokFisher Scientific14-823-435
BeakerSigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW Cold Storage SolutionBridge to LifeBUW-001
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" низкопрофильная полужесткая трубка Barb, PPCole-ParmerEW-45508-12
Криогенный строажный танк / CryotankChart IndustriesMVE 800
ДиметилсульфоксидSigma-AldrichD8418
DMEM, порошок, высокий уровень глюкозы, пируватLife Technologies12800-082
ЭтиленгликольSigma-Aldrich107-21-1
Сверхдлинные щипцыFisher Scientific10-316C
Fisherbrand Высокоскоростной легкий считыватель пластиковых центрифужных трубок - плоская крышкаFisher Scientific06-443-18
ЛескаStrenSOFS4-15
Жидкий азотВоздушный газ7727-37-9
Masterflex L/S Платиновая силиконовая трубка, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
Насадки для смешивания, для использования с 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene Полипропиленовый порошок ВоронкаThermoFisher4252-0100
Игла 20 гаBecton Dickinson (BD)305175
Парапленка M - гибкая пленкаSigma-AldrichP7793-1EA
Лезвие бритвыFisher Scientific12-640
ШпательКоул-ПармерEW-06369-18 
Стерильный фильтр SteriflipFisher ScientificSE1M179M6
сахарозы (кристаллическая/сертифицированная ACS)Fisher ScientificS5-500
New Era Pump Systems Inc.NE-1000
Термоколба Настольный контейнер для жидкогоазота ThermoFisher2122
Шприцевой насос

Ссылки

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530(2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Массовая витрификация капель для первичного сохранения гепатоцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.