Здесь представлен протокол для производства и заднего CRISPR/Cas9 генома нокаут электрической рыбы. Изложены в деталях являются необходимые молекулярной биологии, селекции, и животноводство требования как для gymnotiform и mormyrid, и инъекционные методы для производства Cas9 индуцированных indel F0 личинок.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Молчание Spark: CRISPR/Cas9 Редактирование генома в слабо электрической рыбы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру. Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. За 50 лет, прошедших с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться, растущее сообщество ученых получило огромное понимание эволюции развития, систем и схем нейронауки, клеточной физиологии, экологии, эволюционной биологии и поведения. В последнее время наблюдается распространение геномных ресурсов для электрической рыбы. Использование этих ресурсов уже способствовало получению важных сведений о связи между генотипом и фенотипом этих видов. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики. Мы сообщаем здесь полный протокол для выполнения CRISPR/Cas9 мутагенеза, который использует эндогенные механизмы репарации ДНК в слабо электрических рыб. Мы демонстрируем, что этот протокол одинаково эффективен как в мормиридных видах Brienomyrus brachyistius, так и в gymnotiform Brachyhypopomus gauderio с помощью CRISPR/Cas9 для целевой indels и точечных мутаций в первом экзоне натриевый канал гена scn4aa. Используя этот протокол, эмбрионы обоих видов были получены и генотипированы, чтобы подтвердить, что прогнозируемые мутации в первом экзоне канала натрия scn4aa присутствовали. Плей-аут успеха фенотип был подтвержден с записями, показывающими снижение электрических амплитуды разряда органов по сравнению с невведенным размером соответствующих элементов управления.
Введение
Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Две линии телеостных рыб, остеоглоссиформы и силуриформы, развивались электроприем параллельно, и пять линий телеост (гимназии, мормириды, и род Астроскопус, Малаптерурус, и Synodontis) развивался электрогенез параллельно. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру1,2,3.
Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнот....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Мичиганского государственного университета.
1. Выбор целей sgRNA
ПРИМЕЧАНИЕ: Предусмотрен протокол ручного проектирования сгРНВ в шаге 1.1. Это было использовано для выбора цели scn4aa. Для облегчения этого процесса (шаг 1.2) предусмотрен дополнительный протокол с помощью веб-портала EFISHGENOMICS. Рекомендуется, чтобы пользователи выбрали протокол 1.2, который включает в себя несколько автоматизированных "проверок", чтобы обеспечить успех в разработке sgRNAs для пользовател....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Целевые объекты сгРНК были определены в пределах exon 1 scn4aa в обоих B. gauderio и B. brachyistius, как описано в разделе 1. СГРН были созданы, как описано в разделе 2. После успешного отбора и синтеза сгРНК(Рисунок 1),декольте в пробирке было протестировано(рисунок 2). SgRNAs демонстрируя в пробирке резки были затем выбраны для одноклеточных микроинъекций.
Взрослые рыбы были обусловлены для размножения (р.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Фенотипическое богатство слабоэлектрической рыбы, наряду с недавним распространением ресурсов геномики, мотивирует острую потребность в функциональных геномных инструментах в слабо электрической модели рыб. Эта система особенно привлекательна из-за конвергентной эволюции многочисленных фенотипических признаков в параллельных линиях рыб, которые легко хранятся в лаборатории.
Описанный здесь протокол демонстрирует эффективность метода CRISPR/Cas9 в линиях слабо электрических рыб, которые развива.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы признают героические усилия Моники Лукас, Кэтрин Шоу, Райана Тейлора, Джареда Томпсона, Николь Робишо и Хоуп Хили за помощь в размножеству рыб, сборе данных и разработке раннего протокола. Мы также хотели бы поблагодарить трех рецензентов за их предложения по рукописи. Мы считаем, что конечный продукт будет лучшего качества после рассмотрения их замечаний. Эта работа была профинансирована за счет поддержки Со стороны Национального научного фонда #1644965 и #1455405 JRG, а также Грант Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям DG для VLS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 20 мг/мл РНК класса Гликоген | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50.н. Лестница ДНК | NEB | N3236L | |
| Боросиликатный стеклянный капилляр с нитью | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (Наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,58 мм, длина 10 см) |
| Белок Cas9 с NLS; 1 мг/мл | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Набор для салфеток | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Микроинъектор | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Наконечники для пипеток | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Шприц Hamilton | Fisher | Scientific 14-824-654 | именуется как «прецизионный стеклянный шприц» в протоколе |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | упоминается как «деликатная задача стирания» в протоколе |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | используется для анализа расщепления in vitro |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel США | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | упоминается как "агент нереста" в протоколе |
| Парапленка | Fisher | Scientific S37440 | упоминается как "термопластик" в протоколе |
| Пипетка | puller WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Многоразовая игла- требуется настройка | Fisher Scientific | 7803-02 | Настройка до 0,7 дюйма в длину; точка типа 4 и угол 25 |
| Т4 ДНК-полимераза | NEB | M0203L | Использование с 10-кратным буфером NEB, который входит в состав |
| инструментов с тефлоновым покрытием | bonefolder.com | Т-SPATULA4PIECE | называемый в протоколе «политетрафторэтеном» |
Ссылки
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
