3D кинематический анализ для функциональной оценки в Крыса Модель Сиатический нерв Давка травмы

Сиатический функциональный индекс (SFI) является эталонным методом для проведения функциональных седалитарных нервов оценки¹. SFI был широко принят и часто используется в различных функциональных исследований оценки крысситов нервных травм^2,3,4,5,6. Несмотря на свою популярность, есть несколько проблем с SFI, в том числе автомутация^7,совместный контрактный риск, и мазок следов⁸. Эти проблемы серьезно влияют на его прогностичное значение⁹. Таким образом, в качестве замены SFI требуется альтернативный, менее подверженный ошибкам метод.

Одним из таких альтернативных методов является кинематический анализ. Это включает в себя всеобъемлющий анализ походки с использованием маркеров слежения, прикрепленных к костлявым ориентирам или суставам. Кинематический анализ все чаще используется для функциональных оценок^9. Этот метод постепенно признается в качестве надежного и чувствительного инструмента для функциональной оценки¹⁰ без недостатков, приписываемых SFI^11,12.

В этом протоколе мы описываем серию кинематический анализ, которые используют 3D аппарат захвата движения, состоящий из беговой дорожки, четырех 120 Гц заряженных камер совместного устройства (CCD) и программного обеспечения для обработки данных (см. Таблица материалов). Этот метод кинематический анализ отличается от общего видео ходьбы или походки анализа^13,14. Две камеры расположены в разных направлениях для записи задних движений конечностей с одной стороны. Впоследствии, 3D цифровая модель задней конечности построен с помощью компьютерной графики⁹. Мы можем вычислить обозначенные углы сустава, такие как бедро, колено, лодыжка и сустав, путем тщательного повторения фактических размеров конечностей. Кроме того, мы можем определить различные параметры, такие как длина шага/шага и отношение фазы позиции к фазе качели. Эти реконструкции основаны на полностью реконструированных 3D-цифровой модели задних конечностей, генерируемой на основе данных, передаваемых двумя наборами камер. Даже воображаемый центр тяжести (CoG) траектории может быть рассчитан автоматически.

Мы использовали этот 3D аппарат захвата движения для введения и оценки нескольких кинематических параметров, которые показывают функциональные изменения с течением времени в контексте крысы седалищного нерва раздавить травмы модели травмы.

Протокол был одобрен комитетом по экспериментам на животных Киотского университета, и все протокольные шаги были выполнены в соответствии с Руководящими принципами Комитета по экспериментам на животных, Киотского университета (номер одобрения: MedKyo17029).

1. Знакомство крыс с беговой дорожкой ходьбы

1. Установите два прозрачных пластиковых листа по обе стороны беговой дорожки, чтобы 12-недельный самец Льюис крысы ходить в прямом, переднем направлении, а затем включить электрошоковую сетку.
2. Поучите каждую крысу ходить по беговой дорожке. Постепенно разгоняйте беговую дорожку до нужной скорости (20 см/с или 12 м/мин) и дайте крысе нормально ходить на такой скорости в течение 5 мин. После каждой ходьбы сессии, обеспечить 1-2 мин отдыха. Повторите этот процесс 3x в день, 5 дней в неделю, в течение 1 недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начните беговую дорожку пешком за 1 неделю до шага 2.
3. Дом крыс в группах по три в клетке с 12 ч светло-темный цикл и кормить их коммерческой крысиной пищи и водопроводной воды объявление libitum.

2. Выполнение травмы седаличьего нерва давки

1. Поместите крысу в индукционную камеру анестезии и введите 5% изолюранового ингаляционного раствора.
2. Обеспечить интраперитонеальную инъекцию комбинированного анестетика, приготовленного с 0,15 мг/кг гидрохлорида мететомидина, 2 мг/кг мидазолама и 2,5 мг/кг батрата для крысы. Проверьте отсутствие педалей рефлексов. Затем побрить области от левого большеtrochanter до середины бедра с электрической бритвой.
3. Разложите кусок асептической ткани, поместите крысу на нее, и он лежит в левом боковом положении. Поместите стерильные хирургические инструменты на ткань, а также.
4. Создайте прямой разрез от большого трохантера до середины бедра с хирургическим лезвием No 10. Затем выполнить тупой вскрытие между четырехглавой фемориса и бицепс а мородис с помощью хирургического гемостата подвергать седалищу.
5. Отсоедините седалирный нерв от окружающей ткани двумя парами микрофорсидов и раздавите седалищее нерв на 10 с, используя стандартный хирургический гемостат, чтобы создать 2 мм длинной травмы давки на участке непосредственно под ягодичной туберозностью.
6. Выполните 9-0 нейлоновый эпиневральный стежок на проксимальном конце травмы с помощью пары микроусилитов, а затем закрыть мышцы и кожу с 4-0 нейлоновых швов.
7. Обеспечить интраперитонеальный инъекцию анестезиолога, приготовленного с 0,3 мг/кг гидрохлорида атипамезола к крысе, чтобы разбудить ее в течение 10 минут. После того, как крыса оправляется от анестезии, наблюдайте за движениями левого ножа, в то время как крыса подвешена основанием хвоста. Если нос не распространяется на всех, операция была успешной.
8. Дом крыс индивидуально после операции с 12 ч светло-темный цикл и кормить их коммерческой крысиной пищи и водопроводной воды объявление libitum.

3. Прикрепление маркеров

1. Поместите обученную крысу в индукционную камеру анестезии и введите 5% изофрурановый ингаляционный раствор. Проверьте отсутствие педали рефлекс, щипать нос.
2. Разрешить крысе постоянно анестезируется с помощью анестезируемой маски (2% изофруранового ингаляционного раствора). В то время как крыса получает стабильную анестезию, брить области от нижней части спины к двусторонним malleoli с помощью электрической бритвы.
   ВНИМАНИЕ: Чтобы предотвратить подвергая исследователей утечки изофлюран, убедитесь, что маска плотно покрывает голову и лицо крысы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить травму крысы, сбрить волосы как можно мягче.
3. Поместите крысу в положение лежа. Используйте черную маркерную ручку, чтобы отметить следующие костные ориентиры на бритой коже: линия через спинные процессы от поясничных до сакральных позвонков, передние превосходные подвздошные ключи, больше trochanters, коленные суставы, боковые malleoli, пятый metatarsophalangeal суставов, и кончик четвертого пальца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линия через спинносые процессы используется для определения того, являются ли двусторонние маркеры аксиально симметричными.
4. Используйте жидкий клей, чтобы прикрепить маркеры полушария к этим костным ориентирам, за исключением линии через спинные процессы от поясничного отдела до крестцовых позвонков, и кончик четвертого пальца. Используйте различные цвета для любой другой ориентир, чтобы избежать путаницы. Кончик четвертого пальца ног отмечен розовыми чернилами.
   ВНИМАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не капать клей на обнажённую кожу оператора.
5. После размещения всех маркеров, положить крысу обратно в клетку. Не кладите крысу на беговую дорожку, пока она полностью не оправится от наркоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение сознания может серьезно влиять на нормальную ходьбу, если крыса не полностью оправиться от анестезии.

4. Калибровка и настройка программного обеспечения

1. Установите два прозрачных пластиковых листа с обеих сторон беговой дорожки и поместите калибровочную коробку в середине беговой дорожки. Откройте программное обеспечение для записи, а затем нажмите на значок калибровки изображения на дисплее(Дополнительный файл 1).
2. Нажмите значок записи, чтобы записать 1-2 с видео с четырех направлений с помощью 120 Гц CCD камер. Нажмите на значок записи еще раз, чтобы остановить запись.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Видео будет сохранено автоматически, как только запись останавливается.
3. Откройте видео файл в программном обеспечении для расчета. Нажмите и перетащите характерные точки калибровочной коробки 3D-моделей в правом нижнем углу экрана к соответствующим маркерам на четырех картинках, которые автоматически трансформируются из видео в шаблон калибровки(Дополнительный файл 2). Затем нажмите на значок Сохранить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не меняйте положение камер после завершения калибровки.

5. Запись ходьбы

1. Возьмите калибровочная коробка из беговой дорожки, включите электрошоковую сетку и поместите полностью бодрствуя крысу на беговой дорожке. Откройте программное обеспечение для записи и введите основную информацию о крысе, включая ее серийный номер, скорость ходьбы и имя основного оператора.
2. Включите беговую дорожку и установите скорость до 20 см/с. После крысы адаптируется к скорости и может ходить нормально, нажмите значок записи на дисплее для записи ходячих крыс с четырьмя камерами. После того, как достаточно шагов записаны (No gt;10), нажмите на значок еще раз, чтобы остановить запись, и выключить беговую дорожку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Видео будет сохранено автоматически, как только запись останавливается.
3. Положите крысу обратно в индукционную камеру анестезии для анестезии. В то время как крыса находится под непрерывной анестезией (введение через анестезиологическую маску), удалите маркеры полушария.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите маркеры как можно мягче, чтобы избежать причинения боли крысе.
4. В назначенное время (например, 1 неделя, 3 недели или 6 недель после операции) выполняйте кинематические измерения на крысе, повторяя шаги 3.1-5.3. Сделайте кинематические измерения только один раз, в начале эксперимента, для крыс, которые не получили хирургии (т.е. контрольной группы).

6. Отслеживание маркеров

1. Откройте программное обеспечение для вычислений и откройте видеофайл на интерфейсе.
2. Нажмите и перетащите двустороннюю панель управления на панели прогресса видео, чтобы убедиться, что отображается только 10-ступенчатая беговая дорожка ходьба запись(Дополнительный файл 3). Нажмите и перетащите каждую характерную точку от 3D-модели в правом нижнем углу экрана к соответствующему маркеру на каждом из четырех первоначальных фотографий видео, которые были сделаны камерами(Дополнительный файл 4).
3. Нажмите на значок автоматической трассировки, чтобы начать процесс автоматического отслеживания маркеров(Дополнительный файл 5, Дополнительный файл 6). Если система не точно проследить маркер, нажмите на значок Ручной digitize, чтобы перейти к режиму ручного отслеживания(Дополнительный файл 7), нажмите на отслеживание характерной точки в 3D-модели, а затем на ответный маркер на картинке.
4. После нажатия маркера убедитесь, что картинка переключается на следующий кадр видео. Теперь непрерывно нажимайте на маркер до завершения процесса отслеживания маркера. После завершения нажмите на значок Сохранить.

7. Кинематический анализ

1. Откройте программное обеспечение для анализа, а затем откройте обработанный видеофайл на интерфейсе.
2. Нажмите на значок настройки и выберите и добавьте обозначенные параметры, такие как угол лодыжки, угол ножа и сдвиг таза (X и оси) в список отображения в всплывающем окне справа(Дополнительный файл 8). Нажмите на OK,чтобы кривые, представляющие изменения значения параметров, отображались на интерфейсе.
3. Нажмите на значок измерения и выберите плавную обработку в его выдвижном меню. Введите 20 Гц во всплывающем окне, чтобы удалить частоты больше, чем 20 Гц в пределах кривых(Дополнительный файл 9).
4. Убедитесь, что на интерфейсе есть пять панелей: ходячее видео крысы, динамическая 3D-модель, кривые, представляющие изменения стоимости параметров из 10-ступенчатого цикла, кривые, которые представляют собой изменения среднего значения параметров, и гистограммы и схемические диаграммы, которые представляют соотношение позиции и фазы качели(Дополнительный файл 10).
5. Нажмите правой кнопкой панели для кривых, представляющих среднее значение изменений параметров и выберите выход данных в выдвижной меню(Дополнительный файл 11). Это позволит производить средние значения задних уголков сустава конечностей, в том числе лодыжки и носка углы, тазовые сдвиг, и любые другие желаемые параметры в 10-ступенчатый цикл периодов.

Мы выбрали четыре параметра для изучения функциональных изменений с течением времени в модели травмы седалищного нерва крысы. Это были отношение позиции к качели фазы, центр тяжести (CoG) траектории, лодыжки углы, и нос углы в "откинул" фазы9. Двадцать четыре крысы были случайным образом назначены в одну из четырех групп: контрольная группа (C), крысы на первом (1w), третий (3w), и шестой (6w) неделю после травмы левого седалищного нерва давки.

С помощью 3D кинематический анализ, среднее соотношение позиции или фазы качели в 10-ступенчатом цикле автоматически вычисляется и представлено на интерфейсе(рисунок 1A-D). Мы обнаружили, что соотношение позиции к качели фазы был восстановлен после операции.

CoG является виртуальной точкой, которая может быть прослежена с помощью виртуального маркера с помощью 3D аппарата захвата движения. Он расположен в поперечном пункте из двух линий, соединяющих любой из двух передних превосходных подвздошных шипов с их контралатеральными большими трохантерами. Таким образом, сдвиг таза в реальном времени в корональной плоскости (X и осей) приводит к одновременному смещению CoG, как 3D построента тазовая модель используется. Этот сдвиг также может быть автоматически измерен. Траектория CoG описывается как изменяющаяся кривая среднего значения сдвига таза в осях X и No 10-ступенчатого цикла. Нормальная форма траектории CoG напоминает знак бесконечности (Я). Мы обнаружили, что форма траектории CoG не вернуться к примерно нормальной форме до 6 недель после операции(Рисунок 2A-D).

Нормальные лодыжки и ног углы в "ног от" фазы достичь максимального значения во время терминальной позиции шаг цикла15, но эти параметры могут быть ложно сообщили, если крыса получила хирургии. Тем не менее, 3D кинематический анализ позволил нам определить углы в фазе "отноготе-", ссылаясь на видео. Среднее значение угла голеностопного или носового угла в фазе "отключать" было рассчитано из 10-ступенчатого цикла. Результаты показали, что лодыжки и ног углы, в "ног от" фазы улучшилось в восходящем направлении после операции. (Рисунок 3A-B).

Рисунок 1: Двусторонняя позиция и фаза качели. Правые качели (пурпурные), правая позиция (красная), левая качели (лазурная) и левая позиция (синие) фазы представлены их соответственно цветными полосами. желтые полосы символизируют двойные фазы поддержки. Панели A-D показывают каждую двустороннюю позицию и фазу качели в 10-ступенчатых циклических периодах для контрольной группы(A),1w (B), 3w (C, и 6w (D) групп. C - контроль; 1w - 1 неделя после операции; 3w - 3 недели после операции; 6w и 6 недель после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Траектории КоГ. Панели A-D показывают репрезентативные средние траектории CoG в течение 10-ступенчатого цикла периодов для контрольной группы(A), 1w (B), 3w (C, и 6w (D) групп. C - контроль; 1w - 1 неделя после операции; 3w - 3 недели после операции; 6w и 6 недель после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Углы лодыжки и носик. Панели A и B показывают изменения с течением времени в лодыжке и носу углы в 10 "сниснуть" фазы для контрольной группы, 1w, 3w, и 6w групп (зп lt; 0.01, по сравнению с контрольной группой, q' p lt;0.01, по сравнению с соседней группой. Бары ошибок - стандартная ошибка среднего значения (SEM); C - контроль; 1w - 1 неделя после операции; 3w - 3 недели после операции; 6w и 6 недель после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Дополнительный файл 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл.

Авторам нечего раскрывать.