Система отслеживания динамики поведения социальных предпочтений у малых грызунов

Summary

Описана здесь новая автоматизированная экспериментальная система, которая предлагает альтернативу трехкамерному тесту, а также решает несколько оговорок. Эта система поставляет несколько поведенческих параметров, которые позволяют тщательный анализ малых грызунов поведенческой динамики во время социальных предпочтений и социальной новизны предпочтения испытаний.

Abstract

Изучение нейробиологических механизмов социального поведения требует поведенческих тестов, которые могут быть применены к моделям животных беспристрастным и независимым наблюдателем образом. С начала тысячелетия трехкамерный тест широко используется в качестве стандартной парадигмы для оценки коммуникабельности (социальных предпочтений) и предпочтений в области социальной новизны у мелких грызунов. Однако этот тест страдает от многочисленных ограничений, включая его зависимость от пространственной навигации и небрежность поведенческой динамики. Представлена и проверена здесь новая экспериментальная система, которая предлагает альтернативу трехкамерного испытания, а также решение некоторых из его предостережений. Система требует простого и доступного экспериментального аппарата и общедоступной системы анализа с открытым исходным кодом, которая автоматически измеряет и анализирует несколько поведенческих параметров на индивидуальном уровне и уровне населения. Это позволяет детально проанализировать поведенческую динамику мелких грызунов во время любого теста социальной дискриминации. Мы демонстрируем эффективность системы в анализе динамики социального поведения во время социальных предпочтений и социальных тестов предпочтений новизны в исполнении взрослых мышей и крыс мужского пола. Кроме того, мы проверяем способность системы выявлять измененную динамику социального поведения у грызунов после манипуляций, таких как обрезка усов. Таким образом, система позволяет тщательно исследуют социальное поведение и динамику в небольших моделях грызунов и поддерживает более точное сравнение штаммов, условий и методов лечения.

Introduction

Выявление биологических механизмов, лежащих в основе нейроразвития расстройств (NDDs) является одной из основных проблем в области неврологии¹. Для решения этой задачи требуются поведенческие парадигмы и экспериментальные системы, которые охарактеризовывают поведение грызунов стандартным и беспристрастным образом. Влиятельное исследование, опубликованное более десяти лет назад Мой и его коллеги² представил трехкамерный тест. С тех пор этот тест широко используется для исследования социального поведения в моделях грызунов НДД. Этот тест оценивает две врожденные тенденции грызунов: 1) оставаться в непосредственной близости от социального стимула над объектом (коммуникабельность, также называется социальными предпочтениями ,SP), и 2), чтобы предпочесть близость нового социального стимула над знакомым (социальная новинка предпочтения »SNP)^3,4. Несколько последующих исследований предложили методы автоматизированного анализа трехкамерного теста с использованием компьютеризированных методов^5,6.

Этот тест по-прежнему страдает от нескольких оговорок. Во-первых, он главным образом рассматривает социальные предпочтения место, а не мотивация субъекта непосредственно взаимодействовать с социальным стимулом, хотя некоторые группы также измеряют обонятельное исследование (нюхать) время, либо вручную⁷ или с использованием коммерческих компьютеризированных систем^8,9,10. Во-вторых, трехкамерный тест в основном используется для измерения общего времени, затраченного субъектом в каждой камере, и он пренебрегает поведенческой динамикой. Наконец, он опирается только на один аспект социального поведения, которое время, проведенное субъектом в каждой камере (или нюхать время, если измеряется).

Здесь мы представляем новую и доступную экспериментальную систему, которая является альтернативой трехкамерным аппаратам. Это также позволяет производительность же поведенческие тесты при решении вышеупомянутых оговорок. Представленная поведенческая система автоматически и непосредственно измеряет следственное поведение грызуна по отношению к двум раздражителям. Кроме того, он анализирует поведенческую динамику в независимом от наблюдателя манере. Кроме того, эта система измеряет несколько поведенческих параметров и анализирует их как на индивидуальном уровне, так и на уровне населения; Таким образом, он поддерживает строгий анализ социального поведения и его динамики во время каждого теста. Кроме того, случайное перепозиционирование камер в противоположных углах арены во время различных этапов тестирования нейтрализует любые эффекты пространственной памяти или предпочтений. Эта система может также использоваться для других тестов на дискриминацию, таких, как дискриминация по признаку пола. Пользовательский аппарат прост в производстве, а система анализа является общедоступной в качестве кода с открытым исходным кодом, что позволяет использовать ее в любой лаборатории. Мы демонстрируем способность этой системы измерять несколько параметров социального поведения у грызунов штаммов с различными цветами меха во время социальных предпочтений и социальной новизны предпочтения испытаний. Мы также проверяем способность системы выявлять измененную динамику социального поведения у грызунов после манипуляций, таких как обрезка усов.

TrackRodent программное обеспечение: три алгоритма были написаны в MATLAB (2014a-2019a) для отслеживания экспериментальной темы и его взаимодействия со стимулами. Все алгоритмы были депонированы в GitHub, найдены на lt;https://github.com/shainetser/TrackRodent.gt;.gt. Основной целью всех четырех алгоритмов является отслеживание контуров тела субъекта для обнаружения любого прямого контакта с областями стимулов.

Алгоритм на основе тела: этот алгоритм имеет три версии, которые отслеживают контуры непроводной темной мыши на белом фоне (BlackMouseBodyBased), белой мыши на темном фоне (WhiteMouseBodyBased), или белой крысы на темном фоне (WhiteRatBodyBased ). Графический пользовательский интерфейс (GUI) программного обеспечения требует, чтобы экспериментатор выбирает эксперимент с использованием мышей или крыс, а затем выбирает правильный код. Для каждой версии алгоритма есть два дополнительных кода: один, который представляет процесс отслеживания на экране во время выполнения анализа, и тот, который не выполняет (отсюда, он работает быстрее и называется "быстрый"). Например, имена соответствующих кодов для алгоритма BlackMouseBodyBased: "BlackMouseBodyBased23_7_14" и "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Все алгоритмы, заканчивающиеся "быстрым", не отображают отслеживание в Режиме онлайн, и пользователи должны непосредственно сохранять данные в файле результатов (файл.mat). Все алгоритмы на основе тела требуют установления единого порога ("низкий порог" в ГРАФИЧЕСКОм интерфейсе программного обеспечения) для обнаружения тела субъекта.

Алгоритм, основанный на направлении головы: второй алгоритм, который доступен только для черных мышей, основан на алгоритме на основе тела, в дополнение к определению направления головы. Этот алгоритм обнаруживает взаимодействие головы субъекта с "стимулами" областях, тем самым избегая ложных срабатываний, которые могут возникнуть из случайных контактов субъекта "с этими областями. Для этого алгоритма определены два порога обнаружения контуров тела мыши: высокий порог, который включает в себя более яркий хвост черных мышей, и низкий порог, который включает в себя тело без хвоста. После этого алгоритм приспосабливает эллипсоид к обнаруженным границам с помощью нижнего порога и определяет расположение головы и хвоста мыши (без различия между ними). Окончательная дискриминация между хвостом и головой основана на границах, определенных более высоким порогом.

Проводной алгоритм животных: третий алгоритм направлен на минимизацию артефактов, полученных в результате кабелей (т.е. электрической проволоки или оптического волокна), подключенных к животному, что позволяет анализировать поведение животного при подключении к кабелю. Этот алгоритм имеет коды только для черных мышей и белых крыс. Код для крыс требует, чтобы экспериментатор определял как низкие, так и высокие пороги, в то время как код мыши требует только низкого порога.

Protocol

Все описанные методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Хайфы.

1. Экспериментальная настройка

1. Арена
   1. Постройте экспериментальную арену для мышей(рисунок 1A,D), поместив белый или черный (в зависимости от цвета животного) плексиглас поле (37 см х 22 см х 35 см) в середине акустической камеры (60 см х 65 см х 80 см, из 2 см древесины, покрытой внутри с 2 см толщиной пены). Для освещения снимите полоску (шириной 2 см, на 10 см ниже потолка камеры) пены вокруг акустической камеры (кроме двери) и прикрепите светодиодную полосу с красными или белыми лампочками. Убедитесь, что свет как можно более однородный вокруг арены, чтобы предотвратить отражения.
   2. Постройте арену для крыс аналогично описанному выше для мышей, с различными размерами, которые соответствующим образом соответствуют размеру Крыс Sprague-Dawley (SD)(Рисунок 1G). Поместите черную коробку из плексигласа (50 см х 50 см х 40 см) в середине акустической камеры (90 см х 60 см х 85 см, изготовленную из дерева толщиной 2 см, покрытого внутри пеной толщиной 2 см).
2. Камеры
   1. Для мышей создайте две черные или белые (в зависимости от мехового цвета) треугольные камеры (12 см, высота 35 см, с закрытыми полами) от плексигласа толщиной 6 мм. Найдите их в двух случайно выбранных противоположных углах арены(рисунок 1B,E). Придерживайтесь металлической сетки (18 мм х 6 см; 1 см х 1 см отверстия) в нижней части каждой камеры с помощью эпоксидного клея, чтобы позволить прямое взаимодействие со стимулом через сетку (Рисунок 1C, F). Отметьте каждую палату таким образом, чтобы позволить дискриминацию от других в видео, не давая ключ к предметам (см. рисунок 1B, для примеров).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая камера в конечном итоге будет содержать социальный стимул (мышь) или объект (пластиковая игрушка, 5 см х 5 см х 5 см, с определенной формой и цветом; Рисунок 1C,I вставки). Пусть эпоксидный запах клея испаряется, по крайней мере за неделю до использования.
   2. Для крыс создайте две черные треугольные камеры (20,5 см, высота 40 см, из 6 мм толщиной плексигласа, с закрытыми полами) и поместите их в два случайно выбранных противоположных углах арены(рисунок 1H),каждая с металлической сеткой (25 см х 7 см; 2,5 см х 1 см отверстий), покрывающих ее нижнюю часть(рисунок 1I).
3. Поместите высококачественную монохромную камеру, оснащенную широкоугольным объективом, в верхней части акустической камеры и подключите ее к компьютеру, чтобы обеспечить четкий просмотр и запись поведения субъекта с помощью коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу Материалов для предложений).

2. Поведенческая парадигма

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1-2.7 описывают поведенческую парадигму для мышей. Смотрите раздел 2.8 для конкретных инструкций с участием крыс.

1. Убедитесь, что клетки всех животных (субъекты: 2-4-месячные мыши-самцы; стимулы: 21-30 дневных ювенильных мышей) остаются в экспериментальной комнате не менее 1 ч до начала поведенческого эксперимента.
2. После периода акклиматизации, вставьте две пустые камеры на арену случайным образом на двух противоположных углах. Поместите предмет в середине арены в течение 15 минут привыкания. В течение этого времени, место двух социальных стимулов, каждый в другой камере, расположенной вне арены для привыкания. Поместите предмет (пластиковая игрушка, 5 см х 5 см х 5 см, с определенной формой и цветом) в другой камере.
3. Для выполнения теста социальных предпочтений (SP) начните видеозапись и продолжайте запись до конца теста.
4. Удалите две пустые камеры и сразу же вставьте объект и один из социальных стимулов, каждый в отдельной камере. Найдите эти камеры случайным образом в противоположных углах арены, которые были пустыми во время привыкания. Разрешить субъекту взаимодействовать со стимулами в течение 5 минут теста SP. В конце теста прекратите запись.
5. После теста SP удалите с арены камеры, содержащие стимулы, и оставьте объект на пустой арене на 15 мин. Очистите камеры снаружи 10% этилового спирта.
6. Для выполнения социальной новинки предпочтения (SNP) тест, начать видеозапись и вставить две камеры на арене: один, содержащий тот же социальный стимул, используемый для теста SP (знакомый стимул), а другой, содержащий новый социальный стимул. Поместите эти камеры случайным образом в двух противоположных углах арены, убедившись, что эти места не были использованы для теста SP. Разрешить субъекту взаимодействовать со стимулами в течение 5 минут теста SNP.
7. В конце теста SNP, остановить видеозапись, удалить объект и камеры с арены, и поместить объект обратно в свою домашнюю клетку. Оставьте стимулы в камерах для следующего эксперимента (с другим предметом) или верните их в свои домашние клетки. Очистите арену и камеры с проточной водой следуют 10% этанола и дайте высохнуть.
8. Поведенческая парадигма для крыс
   1. Для крыс, повторите поведенческую парадигму, описанную в шагах 2.1-2.7, с двумя изменениями: 1) обрабатывать крыс субъектов и привыкать социальные стимулы в камеры в течение 2 дней (10 минут каждый день) до эксперимента; и 2) продлить тест SP на 15 минут, чтобы дать крыс более длительный период воздействия социальных стимулов. Позже ограничьте анализ теста SP первоначальными 5 минутами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения одной сессии требуется по крайней мере одна арена и пять камер.

3. Использование графического интерфейса TrackRodent для поведенческого анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите верхнюю панель рисунка 2А для графического интерфейса TrackRodent.

1. Откройте MATLAB (проверено с 2014a-2019a) и выберите папку TrackRodent.
2. Добавьте все подфачки в рабочий путь, нажав на каждую папку и выбрав Добавить в путь Выбранные фоллеры и подфолки.
3. Введите TrackRodent в окне команды и нажмите Enter.
4. Загрузите один файл или несколько видеофайлов (формат AVI или MP4), выбрав файл сеанса нагрузки (AVI).
5. Инспектор фильма, позволяющий осмотр видеоклип кадр за кадром, будет немедленно открыт для первого файла в списке (Рисунок 2A). Используйте его для изучения видеоклипа и определения первых и последних кадров сегмента, которые будут проанализированы. Запишите количество этих кадров, которые потребуются позже. Закройте окно, когда сделано.
6. Для проверки дополнительных видеофайлов откройте видеоинспектора в любое время, нажав фильм Inspect и выбрав конкретный видеофайл.
7. Выберите проверенный вид (мышь или крыса; мышь по умолчанию).
8. Исключите все области, которые могут прервать отслеживание, в соответствии с цветами объекта и арены (черный или белый).
   1. Чтобы исключить заданную область, нажмите Исключить область, и после того, как курсор изменения в крест форму, отметьте все углы области для исключения. После этого, правой кнопкой мыши, а затем дважды слева щелкните центр отмеченной области. Исключенная область станет оттенком красного цвета на экране. Повторите эту процедуру, чтобы исключить столько областей, сколько необходимо.
9. Чтобы удалить область из исключения, нажмите Удалить исключенную область,затем (с помощью скрещенного курсора) нажмите на область, которая будет удалена из исключения.
10. Чтобы определить каждую камеру как "стимул" области, для автоматического обнаружения его расследования субъектом, выбрать форму "стимул" области будет либо полигон или эллиптические, проверяя соответствующие окна, то нажав Стимул X (где "X" представляет 1, 2, или 3). Отметьте области «стимула» по аналогии с исключенными областями, которые затем станут желтыми цветами. Для изменения местоположения определенной области «стимула» нажмите На Stimulus X и отметьте новое местоположение области (это автоматически обновит местоположение).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите различные стимулы номер в последовательной манере для всех файлов (т.е. объект в качестве стимула 1 для всех файлов теста SP).
11. Чтобы отследить присутствие объекта в определенном виртуальном отсеке внутри арены, выберите форму области «купона» (полигона или эллиптической), затем нажмите «Х» (где «X» представляет 1, 2, 3, 4 или 5). Отметьте области «купе» по аналогии с исключенными или раздражителями, которые затем станут синими цветами. Для изменения местоположения определенной области «купе» нажмите «Compartment X» и отметьте новое местоположение области (это автоматически обновит местоположение).
12. Выберите нужный алгоритм (BlackMouseBodyBased был использован для видео) из списка (см. доступные алгоритмы на рисунке 2B).
13. Напишите номера начальных и заканчивающихся кадров для анализа в соответствующих коробках для отсвагов графического интерфейса.
14. Выберите порог для обнаружения тела субъекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство алгоритмов используют только "низкий" порог, в то время как алгоритмы, основанные на направлении головы, также используют порог «Высокий». Для "низкий" порог, выбрать уровень, который включает в себя мышь / крыса тела без хвоста (насколько это возможно), в то время как "Высокий" порог должен также включать хвост. В случае использования алгоритмов на основе направления головы, программное обеспечение будет определять местоположение головы как противоположное расположению хвоста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение будет позже игнорировать небольшие объекты, обнаруженные с помощью выбранного порога.
15. Для автоматического обнаружения границ субъекта для данного порога вставьте значение в соответствующее поле порога и нажмите Enter на клавиатуре.
16. При выборе нескольких файлов перейдите к следующему файлу (используя кнопку Next в верхней части) и выберите соответствующие определения для каждого файла. После завершения проверки параметров и местоположений площади для всех файлов, перемещаясь между каждым из них, используя кнопки «Предыдущий» и «Следующий» в верхней части графического интерфейса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определения всех областей и параметров специфичны для данного файла.
17. Для начала поведенческого анализа всех выбранных файлов перейдите на первый файл и нажмите Start.
18. В конце анализа для каждого фильма сохраняется файл результатов (.mat) в одном каталоге файлов фильма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется медленная (небыстрая) версия алгоритма, она также сохранит версию фильма с белым крестом центра массы тела, который изменяет свой цвет каждый кадр, который обнаруживается как следственный, если только кнопка переключения воспроизведения сохранить анализируемый фильм GUI не будет бесконтрольна. Эта версия фильма (сохраненная в том же каталоге, с тем же названием, что и оригинальный фильм, с суффиксом 'анализированного фильма') может быть использована в автономном режиме для оценки качества автоматического обнаружения, выполняемого системой.

4. Использование графического интерфейса TrackRodent для презентации результатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите нижнюю панель рисунка 2А для презентации результатов.

1. Чтобы проверить результаты каждого файла фильма, нажмите файл результатов загрузки и выберите файлы .mat, генерируемые поведенческим анализом.
2. Перемещение между кнопками переключения для изучения на экране любого из следующих анализов: след местоположения мыши(рисунок 2A); Отсеки занятия вдоль сессии (если "отсеки" были определены, не показаны); Stimuli разведки вдоль сессии(рисунок 2C); Общее время в отсеках (если "отсеки" определены, не показаны); и Общее время исследования стимулов(рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Области «Стимул» — это области, в которых программное обеспечение оценивает взаимодействие объекта, в то время как области «Compartment» — это области, в которых программное обеспечение отслеживает присутствие объекта. Остановка анализа с помощью кнопки анализа Стоп автоматически сохранит результаты, генерируемые до последнего анализируемого кадра. Для большинства компьютеров, это должно быть возможно загрузить и проанализировать до 20 фильмов одновременно (в зависимости от производительности компьютера).

5. Использование TrackRodentPopulationSummary GUI для анализа населения(Рисунок 2E)

1. Откройте MATLAB (проверено с 2014a-2019a) и выберите папку TrackRodent.
2. Введите TrackRodentPopulationSummary в окне команды и нажмите Enter.
3. Загрузите несколько файлов результатов TrackRodent (формат.mat) путем нажатия файлов результатов выбора.
4. Заполните номера Последнее кадр для анализа, Название теста, Стимул 1 имя, и Стимул 2 имя.
5. Выберите нужный анализ из списка факультативных анализов, проверив все соответствующие коробки.
6. Выберите результаты экспорта в speadsheet, проверив соответствующую коробку, чтобы извлечь все результаты проверенного анализа в виде единого файла электронной таблицы.
7. Нажмите "Начать" и подождите, пока не завершится анализ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом завершается анализ. Программное обеспечение может быть использовано для анализа результатов столько фильмов файлов, как хотелось бы, учитывая, что все они были поведенчески проанализированы с помощью программного обеспечения TrackRodent. Анализ, выполняемый программным обеспечением, предполагает видеозапись со скоростью 30 Гц. В случае использования другой частоты кадров умножьте время на 30 и разделите на частоту кадров, используемую для записи, чтобы преобразовать ее в правильное значение (ы).

Results

Использование системы для теста социальных предпочтений у мышей C57BL/6J
На рисунке 1 показаны три версии экспериментальной настройки. Первая версия(Рисунок 1A-C) предназначена для мышей с темными цветами меха, таких как мыши C57BL/6J. Второй(рисунок 1D-F) планируется для мышей с яркими цветами меха, таких как BALB/c или ICR (CD-1) мышей. Третий б...

Discussion

Описанная здесь экспериментальная система, которая была разработана как альтернатива трехкамерного аппарата^2,5,позволяет выполнять те же тесты при решении некоторых из его ограничений. Использование треугольных камер, расположенных в двух противоположных углах прямоугольной арены, ограничивает область взаимодействия предмета-стимула четко определенной плоскости, что позволяет точно анализировать поведение исследования. Одним из преимуществ является использование ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1,3 МП Моно USB3 Vision	FLIR (ранее PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Монохроматическая камера
FlyCap 2.0	FLIR (ранее PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Программа для записи видео
Домашняя 5-минутная эпоксидная смола	Devocon	20845	Для приклеивания металлической сетки к плексигласовым стимульным камерам
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Среда программирования
Плексигласовые доски (толщина 6 ммЧерные или белые)	Melina (1990) LTD, Израиль	NaN	Для строительства арены и стимульных камер
Красные светодиодные ленты (60 светодиодов на метр) подключены к источнику питания 12 В	2012topdeal eBay поставщик	NaN	Для подсветки акустической камеры