Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изучение влияния опухолевых паракринных лигандов на активацию макрофагов с помощью совместной культуры с проницаемой мембраной поддержкой

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60453

⸱

28 ноября 2019 г.

 ,  , 
1Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод с использованием проницаемых мембранных опор для облегчения изучения бесконтактной паракриной сигнализации, используемой опухолевыми клетками для подавления иммунного ответа. Система поддается изучению роли опухолевых факторов в увлажнении активации макрофагов.

Аннотация

Сигнализация паракрина, полученная из опухолей, является упускаемым из виду компонентом местного иммуносупрессии и может привести к разрешительной среде для дальнейшего роста рака и метастазирования. Паракриновые сигналы могут включать контакт клеток между различными типами клеток, таких как PD-L1, выраженный на поверхности опухолей, взаимодействующих непосредственно с PD-1 на поверхности Т-клеток, или секреция лигандов опухолевой клеткой, чтобы возразить иммунную клетку. Здесь мы описываем метод совместной культуры для того чтобы допросить влияния тумор-секретированных ligands на активации иммунных клеток (макрофага). Эта простая процедура использует коммерчески доступные 0,4 мкм поликарбонатной мембраны проницаемые опоры и стандартные пластины культуры тканей. В описанном процессе макрофаги культивируются в верхней камере и опухолевых клетках в нижней палате. Наличие барьера 0,4 мкм позволяет изучать межклеточную сигнализацию без запутанной переменной физического контакта, поскольку эти два типа клеток имеют одинаковую среду и подвержены паракринным лиганам. Этот подход можно сочетать с другими, такими как генетические изменения макрофага (например, изоляция от генетических вырубки мышей) или опухоли (например, CRISPR-опосредованные изменения) для изучения роли конкретных секретных факторов и рецепторов. Этот подход также поддается стандартному молекулярному биологическому анализу, такому как количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) или западный анализ помарки, без необходимости сортировки потока для разделения двух популяций клеток. Фермент-связанные иммуносорбентные анализы (ELISAs) могут также быть использованы для измерения выделяется лиганды, чтобы лучше понять динамическое взаимодействие клеточной сигнализации в контексте нескольких типов клеток. Длительность совместной культуры также может быть различной для изучения временно регулируемых событий. Этот метод совместной культуры является надежным инструментом, который облегчает изучение опухолевых сигналов в иммунном контексте.

Введение

Недавние исследования были сосредоточены на способности раковых клеток, чтобы избежать обнаружения иммунными клетками, подавить местную иммунную активацию, или производить толерантность опухоли вседозволенной среде в микроокружении опухоли. Были описаны два широких класса опухолевых и иммунных клеточных взаимодействий, которые облегчают эти эффекты: контактно-опосредованные взаимодействия или опухолевые лиганды. Одним из наиболее хорошо изученных и клинически tractable механизмов контактно-опосредованного иммунного ингибирования, используемых опухолями является выражение PD-L1, который взаимодействует с PD-1 на Т-клетки, чтобы ингибировать их активацию и функцию1,2. В ответ на интерферон-гамма (ИФНЗ), который выражается рядом активированных иммунных клеток, опухолевые клетки могут увеличить экспрессию PD-L1, чтобы вызвать истощение PD-1-выражения активированных Т-клеток, тем самым предотвращая их от эффективного искоренения опухолевых клеток3. Использование антител, чтобы блокировать взаимодействие между PD-L1 и PD-1 в настоящее время используется для лечения нескольких типов рака у людей4. В свете этого клинического успеха и других, выявление и таргетинг опухолевых иммуносупрессивных механизмов получил все большее внимание.

Помимо подавления адаптивного иммунитета, опухоли также известны выделять факторы, которые подавляют провоспалительные реакции врожденных иммунных клеток. Опухолевые или опухолевые выделения, в том числе IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, и колонии стимулирующий фактор (CSF-1), было показано, ингибировать противоопухолевые реакции естественных клеток убийцы (НК), гранулоцитов и дендритных клеток в микросреде опухоли5,6,7. Опухолевые клетки могут также выделять факторы, которые искажают набор и дифференциацию миелоидных клеток в микроокружении опухоли для содействия подавлению активации Т-клеток8,9.

Один из видов врожденных иммунных клеток, который имеет глубокое влияние на прогрессирование опухоли является макрофаг. На протяжении многих лет, наличие опухолевых макрофагов (TAMs) был использован в качестве отрицательного прогноза выживания пациента10. Концепция, что иммуносупрессивные TAMs ослабить иммунных клеток опосредованного очистки опухолей была введена более 40 лет назад11. Совсем недавно было показано, что макрофаг провоспалительных ответ может быть downregulated в то время как про-опухоли фенотип может быть индуцирован в микросреде опухоли. Эти иммуносупрессивные макрофаги могут способствовать толерантности, приводя к прогрессированию опухоли и устойчивости к химио- и иммунотерапии12. Учитывая, что макрофаги часто являются одним из наиболее распространенных лейкоцитов с опухолью, восстановление их опухоли специфической иммунной активности представляет собой потенциальную цель для противоопухолевых терапии13.

В то время как контактно-опосредованные взаимодействия между опухолевыми клетками и макрофагами могут быть смоделированы с помощью прямой кокультуры, использование проницаемых мембранных опор может выяснить, какие опухолевые факторы являются иммуномодулирующими без потенциально запутанного влияния опухолево-иммунного клеточного контакта. Используя несколько аналогичные методы, другие продемонстрировали потенциал выявления секретных факторов в микроглии / нейрональных взаимодействий14, а также опухолевые клетки с мезотелиальными клетками15. Мы также успешно использовали этот метод совместной культуры, чтобы охарактеризовать роль опухолевого белка, Pros1, как супрессор провоспалительного экспрессии генов после стимуляции перитонеальных макрофагов с LPS и интерферон-гамма16. Здесь мы описываем простую методологию, которая может быть использована для допроса, как опухолевые факторы могут повлиять на активацию макрофагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с сбором и использованием макрофагов перитонеального перитонеала, были проведены в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл (КООН) и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных КООН (IACUC).

1. Культура макрофагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может использовать первичные перитонеальные макрофаги (описанные подробно ниже), макрофаги костного мозга, или макрофаг клеточные линии, такие как J774 (ATCC) или RAW264 (ATCC).

  1. Урожай перитонеальных макрофагов, как ранее описано16,17 и пластины непосредственно в верхней камере (ы) 0,4 мкм полиэстермбраны вставить ко-культуры 6 хорошо пластины(рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительная урожайность макрофагов из каждой изоляции составляет 1 х 106 клеток, так что среднее количество клеток на скважину составляет 1,5-1,6 х 105 клеток в 6 хорошо пластины.
  2. Культура собраны макрофаги в Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) / F12, 10% Плодовий Сыворотка крупного рогатого скота (FBS), 1x пенициллин / стрептомицин, 20 нг / мл макрофаг колонии стимулирующий фактор (M-CSF) в течение 3 дней при 37 C, 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя камера содержит 1 мл культуры среды в то время как нижняя палата заполнена 1,5 мл. Среда должна быть добавлена к каждой камере.

2. Кокультура опухолевых клеток с макрофагами

  1. До использования, культура коммерчески доступны опухолевых клеток в их соответствующей среде следующие ATCC-рекомендуемых методов культуры тканей.
  2. Вымойте клетки опухоли адепта один раз с фосфатами буферного солей (PBS), добавить 0,05% трипсина и этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединиться. Resuspend клетки в FBS, содержащие среды, количественнообщее общее количество клеток с помощью гемоситометра или счетчика клеток, а затем центрифуга в течение 5 минут на 220 х г гранулы.
  3. Во время центрифугации, аспирировать среду из верхней и нижней камер макрофаговосодержащих проницаемых мембранных опорных пластин и заменить свежей средой.
    1. Для нижних камер, где опухолевые клетки будут покрыты, заполнить с 1 мл среднего вместо 1,5 мл, чтобы обеспечить достаточный объем для добавления клеток.
  4. Аспирная среда из гранулированных опухолевых клеток и повторное присоединение клеток в DMEM/F12 с 10% FBS, 1x пенициллином/стрептомицином и 20 нг/мл М-CSF в концентрации 3 х 105 клеток/мл.
  5. Добавьте 0,5 мл из 3 х 105 клеток/мл опухолевых клеток в нижнюю камеру желаемых скважин(рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно лечить немедленно.

3. Лечение кокультурных клеток

  1. Чтобы вызвать макрофаг провоспалительные экспрессии генов, лечить покорно или совместно культурные макрофаги, добавив 100 нг / мл IFN и 50 нг / мл LPS.
    1. Изменять продолжительность лечения раз в культуре по мере необходимости. Активация макрофага происходит в течение 2 ч, и некоторые опухолевые подавления происходит на 8 ч. Ко-культура для 24 ч дает надежные и последовательные опухоли полученных подавления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, макрофаги могут быть вызваны принять про-рана исцеления фенотипа путем добавления таких факторов, как интерлейкин-10 (IL10), и эффект опухоли секретированных лиганд оценивается.
  2. Как отрицательный контроль, культура макрофагов поетиво и оставить без лечения. В качестве положительного контроля, лечить познавательно культурные макрофаги с 100 нг / мл IFN и 50 нг / мл LPS.

4. Анализ сокультурных ячеек в низке

  1. После желаемого времени инкубации прошло, изолировать лизат клетки или условных среды культуры по желанию, в зависимости от потребностей тестирования.
  2. Чтобы изолировать лизат клетки для количественной полимеразы цепной реакции (qPCR) анализа, аспирировать средства массовой информации из обеих камер скважины и мыть один раз с 2 мл PBS. Нанесите буфер RNA lysis на верхнюю камеру, содержащую макрофаги. Аккуратно соскребите мембрану, чтобы выпустить клеточный лизат, и перенесите в трубку для дальнейшей обработки в соответствии с протоколом производителя изоляционных комплектов РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для определения влияния опухолевых лигандов на поляризацию макрофагов была использована описанная процедура. Перитональные макрофаги, культивируемые при отсутствии опухолевых клеток, использовались в качестве отрицательных (необработанные и крайне левые) и положительные (IFN и LPS стимулировали2-й слева) элементы управления(рисунок 2A). Кроме того, перитонеальные макрофаги были совместно культивированы с B16F10 клеток опухоли меланомы (ATCC) (Рисунок 1A

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ сокультуры, представленный здесь, представляет собой модификацию ранее установленных анализов, которая позволяет изучать опухолевые факторы активации иммунных клеток. В то время как контакт клеток, как известно, вызывают изменения в иммунной активности, способность опухолевых лигандов модулировать иммунную активацию менее хорошо понимается. Мы описываем метод, который, в отличие от прямой совместной культуры, может быть использован для допроса, как выдержанные опухолями выделяемые секретные факторы влияют на актив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эрик Ubil был профинансирован, в частности, Американское онкологическое общество постдокторской стипендий (128770-PF-15-216-01-LIB). Работа была поддержана грантом от NIH (R01-CA205398) и наградой Фонда исследований рака молочной железы (BCRF-18-041) в ВШЭ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
B16-F10ATCCATCC CRL-6475
набор для синтеза кДНКPromegaA3500
DMEM/F12 mediaThermoFisher Scientific- Gibco11320033
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаMilliporeTMS-013-B
J774A.1ATCCATCC TIB-67
Липополисахариды из Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL5293-2ML
Мышиный M-CSFProspecCYT-439
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)ThermoFisher Scientific- Gibco15140122
Pros1 ELISAMyBioSourceMBS2886720
RAW264.7ATCCATCC TIB-71
Рекомбинантный мышиный ИФН&гамма;BioLegend575302
Sensimix SYBR Low-ROX kitBiolineQT625-05
Transwell проницаемые опорыFisher Scientific07-200-170
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific - Gibco25200056

Ссылки

  1. Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
  2. Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
  3. Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
  4. Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).
  5. Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
  6. Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
  7. Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
  8. Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
  9. Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
  10. Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
  11. Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
  12. Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
  13. Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
  14. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
  15. Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).
  16. Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
  17. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
  18. Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Паракринная сигнализациялигандысекретируемые опухольюметод совместного культивированияпроницаемая мембранная поддержкаиммуносупрессия опухолибелок Sвестерн-блоттингинтерферон гаммапро-воспалительные гены
Изучение влияния опухолевых паракринных лигандов на активацию макрофагов с помощью совместной культуры с проницаемой мембраной поддержкой
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.