Изучение влияния опухолевых паракринных лигандов на активацию макрофагов с помощью совместной культуры с проницаемой мембраной поддержкой

Недавние исследования были сосредоточены на способности раковых клеток, чтобы избежать обнаружения иммунными клетками, подавить местную иммунную активацию, или производить толерантность опухоли вседозволенной среде в микроокружении опухоли. Были описаны два широких класса опухолевых и иммунных клеточных взаимодействий, которые облегчают эти эффекты: контактно-опосредованные взаимодействия или опухолевые лиганды. Одним из наиболее хорошо изученных и клинически tractable механизмов контактно-опосредованного иммунного ингибирования, используемых опухолями является выражение PD-L1, который взаимодействует с PD-1 на Т-клетки, чтобы ингибировать их активацию и функцию^1,2. В ответ на интерферон-гамма (ИФНЗ), который выражается рядом активированных иммунных клеток, опухолевые клетки могут увеличить экспрессию PD-L1, чтобы вызвать истощение PD-1-выражения активированных Т-клеток, тем самым предотвращая их от эффективного искоренения опухолевых клеток³. Использование антител, чтобы блокировать взаимодействие между PD-L1 и PD-1 в настоящее время используется для лечения нескольких типов рака у людей⁴. В свете этого клинического успеха и других, выявление и таргетинг опухолевых иммуносупрессивных механизмов получил все большее внимание.

Помимо подавления адаптивного иммунитета, опухоли также известны выделять факторы, которые подавляют провоспалительные реакции врожденных иммунных клеток. Опухолевые или опухолевые выделения, в том числе IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, и колонии стимулирующий фактор (CSF-1), было показано, ингибировать противоопухолевые реакции естественных клеток убийцы (НК), гранулоцитов и дендритных клеток в микросреде опухоли^5,6,7. Опухолевые клетки могут также выделять факторы, которые искажают набор и дифференциацию миелоидных клеток в микроокружении опухоли для содействия подавлению активации Т-клеток^8,9.

Один из видов врожденных иммунных клеток, который имеет глубокое влияние на прогрессирование опухоли является макрофаг. На протяжении многих лет, наличие опухолевых макрофагов (TAMs) был использован в качестве отрицательного прогноза выживания пациента¹⁰. Концепция, что иммуносупрессивные TAMs ослабить иммунных клеток опосредованного очистки опухолей была введена более 40 лет назад¹¹. Совсем недавно было показано, что макрофаг провоспалительных ответ может быть downregulated в то время как про-опухоли фенотип может быть индуцирован в микросреде опухоли. Эти иммуносупрессивные макрофаги могут способствовать толерантности, приводя к прогрессированию опухоли и устойчивости к химио- и иммунотерапии^12. Учитывая, что макрофаги часто являются одним из наиболее распространенных лейкоцитов с опухолью, восстановление их опухоли специфической иммунной активности представляет собой потенциальную цель для противоопухолевых терапии¹³.

В то время как контактно-опосредованные взаимодействия между опухолевыми клетками и макрофагами могут быть смоделированы с помощью прямой кокультуры, использование проницаемых мембранных опор может выяснить, какие опухолевые факторы являются иммуномодулирующими без потенциально запутанного влияния опухолево-иммунного клеточного контакта. Используя несколько аналогичные методы, другие продемонстрировали потенциал выявления секретных факторов в микроглии / нейрональных взаимодействий^14, а также опухолевые клетки с мезотелиальными клетками¹⁵. Мы также успешно использовали этот метод совместной культуры, чтобы охарактеризовать роль опухолевого белка, Pros1, как супрессор провоспалительного экспрессии генов после стимуляции перитонеальных макрофагов с LPS и интерферон-гамма¹⁶. Здесь мы описываем простую методологию, которая может быть использована для допроса, как опухолевые факторы могут повлиять на активацию макрофагов.

Все процедуры, связанные с сбором и использованием макрофагов перитонеального перитонеала, были проведены в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл (КООН) и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных КООН (IACUC).

1. Культура макрофагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может использовать первичные перитонеальные макрофаги (описанные подробно ниже), макрофаги костного мозга, или макрофаг клеточные линии, такие как J774 (ATCC) или RAW264 (ATCC).

1. Урожай перитонеальных макрофагов, как ранее описано^16,17 и пластины непосредственно в верхней камере (ы) 0,4 мкм полиэстермбраны вставить ко-культуры 6 хорошо пластины(рисунок 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительная урожайность макрофагов из каждой изоляции составляет 1 х 10⁶ клеток, так что среднее количество клеток на скважину составляет 1,5-1,6 х 10⁵ клеток в 6 хорошо пластины.
2. Культура собраны макрофаги в Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) / F12, 10% Плодовий Сыворотка крупного рогатого скота (FBS), 1x пенициллин / стрептомицин, 20 нг / мл макрофаг колонии стимулирующий фактор (M-CSF) в течение 3 дней при 37 C, 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя камера содержит 1 мл культуры среды в то время как нижняя палата заполнена 1,5 мл. Среда должна быть добавлена к каждой камере.

2. Кокультура опухолевых клеток с макрофагами

1. До использования, культура коммерчески доступны опухолевых клеток в их соответствующей среде следующие ATCC-рекомендуемых методов культуры тканей.
2. Вымойте клетки опухоли адепта один раз с фосфатами буферного солей (PBS), добавить 0,05% трипсина и этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединиться. Resuspend клетки в FBS, содержащие среды, количественнообщее общее количество клеток с помощью гемоситометра или счетчика клеток, а затем центрифуга в течение 5 минут на 220 х г гранулы.
3. Во время центрифугации, аспирировать среду из верхней и нижней камер макрофаговосодержащих проницаемых мембранных опорных пластин и заменить свежей средой.
   1. Для нижних камер, где опухолевые клетки будут покрыты, заполнить с 1 мл среднего вместо 1,5 мл, чтобы обеспечить достаточный объем для добавления клеток.
4. Аспирная среда из гранулированных опухолевых клеток и повторное присоединение клеток в DMEM/F12 с 10% FBS, 1x пенициллином/стрептомицином и 20 нг/мл М-CSF в концентрации 3 х 10⁵ клеток/мл.
5. Добавьте 0,5 мл из 3 х 10⁵ клеток/мл опухолевых клеток в нижнюю камеру желаемых скважин(рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно лечить немедленно.

3. Лечение кокультурных клеток

1. Чтобы вызвать макрофаг провоспалительные экспрессии генов, лечить покорно или совместно культурные макрофаги, добавив 100 нг / мл IFN и 50 нг / мл LPS.
   1. Изменять продолжительность лечения раз в культуре по мере необходимости. Активация макрофага происходит в течение 2 ч, и некоторые опухолевые подавления происходит на 8 ч. Ко-культура для 24 ч дает надежные и последовательные опухоли полученных подавления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, макрофаги могут быть вызваны принять про-рана исцеления фенотипа путем добавления таких факторов, как интерлейкин-10 (IL10), и эффект опухоли секретированных лиганд оценивается.
2. Как отрицательный контроль, культура макрофагов поетиво и оставить без лечения. В качестве положительного контроля, лечить познавательно культурные макрофаги с 100 нг / мл IFN и 50 нг / мл LPS.

4. Анализ сокультурных ячеек в низке

1. После желаемого времени инкубации прошло, изолировать лизат клетки или условных среды культуры по желанию, в зависимости от потребностей тестирования.
2. Чтобы изолировать лизат клетки для количественной полимеразы цепной реакции (qPCR) анализа, аспирировать средства массовой информации из обеих камер скважины и мыть один раз с 2 мл PBS. Нанесите буфер RNA lysis на верхнюю камеру, содержащую макрофаги. Аккуратно соскребите мембрану, чтобы выпустить клеточный лизат, и перенесите в трубку для дальнейшей обработки в соответствии с протоколом производителя изоляционных комплектов РНК.

Для определения влияния опухолевых лигандов на поляризацию макрофагов была использована описанная процедура. Перитональные макрофаги, культивируемые при отсутствии опухолевых клеток, использовались в качестве отрицательных (необработанные и крайне левые) и положительные (IFN и LPS стимулировали2-й слева) элементы управления(рисунок 2A). Кроме того, перитонеальные макрофаги были совместно культивированы с B16F10 клеток опухоли меланомы (ATCC) (Рисунок 1A). Сразу же после покрытия клетки либо лечились ИФНЗ и ЛПС, либо не получали лечения. После 24 ч культуры, макрофаги были собраны, РНК подготовлены, и qRT-PCR выполняется для измерения экспрессии провоспалительных генов. Используя систему совместной культуры, описанную здесь, мы показываем, что перитонеальные макрофаги совместно культивируются в присутствии опухолевых клеток B16F10, но без активации стимулов (LPS и IFN) не увеличивали экспрессию провоспалительных генов(Рисунок 2A,B16F10 мембраны/необработанные). Это означает, что опухолевые лиганды 1) не достаточно сами по себе, чтобы вызвать провоспалительные экспрессии генов или 2), если есть иммунная активация опухолевых выделений, паракринные лиганды достаточно, чтобы подавить его до наивных уровней. Этот метод совместной культуры иллюстрирует, что, когда макрофаги, поляризованные ИФНЗ и LpS, культивируются в присутствии опухолевых клеток, подавление связанного с воспалением экспрессии генов было уменьшено на целых 60%(рисунок 2A, B16F10 Membrane/IFN-LPS). Сопоставимый уровень макрофагов про-воспалительных подавления генов наблюдался, когда линии макрофагов murine макрофаг овой линии J774 был заменен на перитонеальные макрофаги(рисунок 2B).

Наша предыдущая работа определила Pros1 как опухолевый фактор, который может ингибировать активацию макрофагов16. Используя проницаемую модель поддержки мембраны в сочетании с ELISA, мы проанализаировали концентрацию Pros1 в условной среде после 24 ч. Мы заметили, что в условной среде от IfN и LPS лечение B16F10 меланомы клеток Pros1 был выражен на 475 нг/мл 120 нг/мл (Рисунок 3). Перитональные макрофаги, обработанные в тех же условиях, выраженные Pros1 на 61 нг/мл , 5 нг/мл(рисунок 3). Интересно, что при совместной культуре, Pros1 в рамках IFN и LPS хорошо относились было 86 нг /мл 15 нг/мл. Это говорит о том, что 1) макрофаги потребляют опухолевые Pros1 или 2) количество Pros1 выделяется B16F10 клеток существенно снижается, когда в присутствии макрофагов. Результаты как на рисунке 2, так и на рисунке 3 подчеркивают глубокие изменения активации макрофагов и сигнализации паракрина, когда макрофаги совместно культивируются с опухолевыми клетками.

Рисунок 1. Схема для проницаемой мембраны поддерживает кокультуру опухолевых клеток с макрофагами. Положительные и отрицательные элементы контроля лечения могут быть применены к познавательно культивированных скважин макрофага (A). Для определения влияния опухолевых сигналов на активацию макрофагов, макрофаги культивируются в верхней камере проницаемой мембранной поддержки кокультурных пластин и опухолевых клеток, культивируемых в нижней палате (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2. Опухолевые парокриновые сигналы подавляют макрофаг провоспалительную поляризацию. Макрофаг выражение связанных с воспалением генов было оценено qRT-PCR в необработанных или ИФНЗ и LPS стимулировали макрофаги при наличии или отсутствии опухолевых клеток. Выражение провоспалительных генов было уменьшено в перитонеальных макрофагах (A) или J774 линии макрофаг клеток (B) когда культивируется в присутствии опухолевых клеток, разделенных проницаемой мембранной поддержкой, так что эффект был передан паракринной растворимой лиганд. p slt; 0,05 по отношению к необработанным, p s lt; 0,05 по отношению к IFN и LPS стимулировали. Данные являются средними и SEM; p значения, рассчитанные по двуххвостому тесту студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3. Кокультура опухолевых клеток и макрофагов приводит к изменениям в количестве опухолевых паракринных лигандов, обнаруженных в условной среде. ELISA был использован для определения концентрации Pros1 только в опухоли, макрофаг в одиночку, или совместной культуры кондиционированных среды после 24 ч. Co-культура приводит к уменьшению количества Pros1 по отношению к опухолевых клеток только контролирует. р-р злт; 0,05 по отношению к необработанным. p значения, рассчитанные по двуххвостому тесту студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.