Исследование кишечного барьера Разбивка в живых органоидов

Целостность эпителиального барьера поддерживается апикальным соединением (AJC), который состоит из плотного соединения (TJ) и присоединения соединения (AJ) белков¹. Поляризованная структура АЕК имеет решающее значение для его функции in vivo. Дисрегуляция AJC присутствует при различных заболеваниях и, как предполагается, является важным триггером воспалительного патогенеза кишечника. Потеря функции кишечного барьера представляет собой инагитирующее событие заболевания. Следующие транслокации сопутствующих бактерий и воспалительных реакций являются болезненными последствиями².

Различные модели in vitro и in vivo были разработаны. для изучения регулирования AJC. Transwell асса основанна на двухмерных (2D) клеточных монослойах, которые были получены из опухолевых клеточных линий. Эти системы хорошо оценить с помощью оптических и биохимических методов и позволяют анализ ировать многие образцы в то же время, но не имеют многих особенностей первичных клеток и процессов дифференциации, присутствующих в vivo. Исследование целостности барьера также возможно в животных моделях. В терминальных экспериментах, влияние специфических обработок in vivo на проницаемость всего intestine можно сотвиную. Однако эти модели требуют большого количества животных, и они не позволяют детально визуализировать основные молекулярные процессы. В настоящее время доступны улучшенные 3D-модели in vitro, которые тесно переизглашают процессы дифференциации клеток, поляризацию клеток и представляют структуру склепового кишечника^3. Применение 3D кишечных органоидов для функционального анализа требует адаптации доступных методов из 2D-моделей. Здесь мы описываем модель для исследования целостности кишечного барьера в жизни малых кишечных органов мыши. Анализ был создан для изучения влияния ИФН-З на целостность барьера и соответствующих плотных белков соединения⁸.

В отличие от техники, применяемой Лесли⁴, Зитек⁵, или Пирс⁶, который измеряет флуоресценцию после удаления люцифера желтый (LY) из среды, наш подход позволяет количественной оценки светящегося поглощения фторофора с течением времени. Таким образом, результат представляет собой динамическое поглощение кинетической и наш ассе может применяться дополнительные стимулы или ингибиторы в ходе эксперимента. Тот факт, что оба ассы измеряют поглощение от внешней базолатеральной стороны к внутренней атикальной поверхности, явно контрастирует с ситуацией in vivo. В модели, описанной Hill et al.^7,эта тема была изучена. При микроинъекции флюорофора в просвет органоида была количественно определена флуоресценция. Направление диффузии представляет направление, присутствуют в vivo. Технические усилия микроинъекции явно снижает пропускную мощность этого метода. В отличие от описанной здесь модели метод микроинъекций позволяет измерять эффекты, требующие биологической активации на аптической эпителиальной поверхности.

Модель целостности органоидных барьеров, представленная здесь, основана на живой клеточной микроскопии и позволяет анализировать динамические изменения в рамках регулирования АЕК с течением времени. Установка может быть применена для проверки фармакологического воздействия веществ, вызывающих и препятствующих целостности кишечного барьера. Кроме того, модели на основе органидов помогают сократить количество животных, используемых для фармакологических исследований.

Все этапы были завершены в соответствии со всеми соответствующими нормативными и институциональными руководящими принципами по уходу за животными.

1. Покрытие органоидов

1. Изолировать органоиды, как описано ранее³. Процедура кратко описана ниже.
   1. Соберите тонкий кишечник от мышей.
   2. Откройте тонкий кишечник продольно и удалить вилли советы, соскоб внутренней ткани кишечника с крышкой.
   3. Разрежьте кишечную ткань небольшими кусочками ножницами.
   4. Вымойте кусочки 5x в холодном фосфатно-буферном сольнике (PBS) путем pipetting куски 10x вверх и вниз с 25 мл пипетки.
   5. Инкубировать кусочки ткани холодным раствором 2 мМ EDTA на льду в течение 30 мин на горизонтальной встряхиваемая платформу. Разрешить части ткани в отложения.
   6. Замените раствор EDTA буфером PBS, как только части ткани оседают внизу. Откажитесь от супернатанта и добавьте 20 мл PBS.
   7. Освободите кишечные склепы из ткани, энергично пипетки 10x вверх и вниз с 10 мл пипетки.
   8. Соберите супернатант в центрифуговых трубках и осмотрите его с помощью фазовой контрастной микроскопии. Для этого добавьте каплю супернатанта в пластину культуры 96 скважин. Держите центрифугации труб на льду.
   9. Повторите шаги 1.1.6-1.1.8 до тех пор, пока количество кишечных склепов в собранном супернатанте не уменьшится.
   10. Передайте фракции, содержащие большинство склепов через 70 мкм ячейки ситечко.
   11. Centrifuge спущенная подвеска на 300 х г,4 КК в течение 5 мин.
   12. Откажитесь от супернатанта и resuspend гранулы в холодной PBS для того, чтобы мыть склепы. Затем повторите шаг центрифугации, описанный в 1.1.11.
   13. Resuspend гранулы в общей сложности 25 qL в колодец 1:1 смесь клеточного матричного раствора и мурин органоидной культуры среды и пластины органоидов в 48 хорошо пластины клеточной культуры.
   14. Инкубировать органоиды при 37 градусах Цельсия, 5% CO_2,^, в течение 20 минут, чтобы позволить раствору матрицы клеток затвердеть.
   15. Обложка органоидов с 300 зл люна буриноидов среды в скважине.
   16. Культура органоидов при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂, изменение среды каждые 2-3 дня.
   17. Используйте органоиды для экспериментов после 7 дней культуры.
2. Подготовьте органоиды для измерения барьерной целостности.
   1. Precoat все центрифугации труб, которые будут использоваться для хранения органоидов в процессе покрытия с бычьей сыворотки альбумина (BSA), добавив достаточно 0,1% BSA решение в PBS для покрытия всех пластиковых поверхностей. Затем снова удалите раствор BSA и храните центрифугивационные трубки на льду.
   2. Оттепель клеточной матрицы раствора и органоидной культуры среды на льду.
3. Чтобы отделить органоиды, тщательно удалить культуры среды и resuspend органоидов из одного колодца 48 хорошо пластины в 1 мл холодного PBS. Растворите клеточную матрицу энергичным пипеттингом. Всегда держите органоидную подвеску в центрифуговых трубках, предварительно покрытых BSA, и всегда держите на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность, размер и положение органоидов в пределах камерного слайда охватывает, зависят от сплит-соотношения, концентрации раствора клеточной матрицы и обработки суспензии матричной органидно-клеточной камеры. Рекомендуется заранее практиковать обработку решения клеточной матрицы. Обычно восемь хорошо камерных стеклянных крышки подходят для ассена. Органоиды, полученные из одной скважины священной пластины 48 скважин, могут быть разделены на две скважины из восьми хорошо камерных покрывало (40 л органоидно-клеточной матрицы гранул на скважину).
4. Центрифуга органоидная подвеска при 300 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
5. Тщательно отбросьте супернатант и resuspend гранулы с 1 мл холодного PBS.
6. Центрифуга органоидная суспензия на 300 х г,4 КК в течение 5 мин.
7. Откажитесь от супернатанта полностью и resuspend органоидов, полученных из одного колодца из 48 хорошо пластины в 40 Л холодной среде. Фрагмент больших органоидных структур путем pipetting органоидной подвески 5x через 10 л пипетки наконечник для сбора структур с размером 40-60 мкм для посева.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечник 10 л на наконечнике пипетки 100 л для фрагментации органоидных структур и заранее наблюдайте шаг 1,7, чтобы обеспечить стабильные результаты. Контролируйте размер органоидов с помощью фазовой контрастной микроскопии в центробежной трубе. Убедитесь, что больше несуществуети органоидов и что фрагменты органоидов имеют длину примерно 40-60 мкм в длину.
8. После того, как органоиды получили желаемый размер, смешайте их с 40 злицом клеточного матричного раствора (средний:клеточный матричного раствора No 1:1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение средней и клеточной матрицы должно быть постоянным для достижения последовательных результатов. Разбавление раствора клеточной матрицы снижает жесткость органоидной капли и влияет на ее диффузионные свойства. Используйте предварительно охлажденные наконечники труб (-20 градусов по Цельсию) для всех суспензий, содержащих решение матрицы клеток.
9. Поместите 40 зл итог суспензии матричного раствора органидно-клеточной камеры в центр каждого колодца 8 хорошо камерного покрытия.
10. Держите горку на пакете со льдом в течение 5 минут. Это сохраняет клеточной матричной суспензии жидкости и увеличивает концентрацию органоидов на поверхности крышки под действием силы тяжести.
11. Инкубировать в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2, чтобы обеспечить полимеризацию органоидно-клеточной матричной капли.
12. Добавьте 150 зЛ органоидной культуры среды в колодец и инкубировать в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ до начала экспериментального лечения.
    1. Используйте этот период для лечения органоидов и модулировать их барьер целостности в соответствии с соответствующей научной гипотезы. Для положительного контроля, лечить органоиды в течение 48 ч с IFN-Я для того, чтобы исследовать IFN-я связанных жесткой деградации соединения и проницаемость увеличение. Стимулировать положительный контроль с 10 U/mL (10 нг/мл) рекоминат ный рифине IFN-з. Оставьте органоиды одного хорошо необработанных.
13. Культурные органоиды при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ на срок до 48 ч.

2. ОрганоидПермируемость

1. Доведите инкубационную камеру микроскопа до 37 градусов по Цельсию, по крайней мере, 2 ч, прежде чем начать эксперимент по уменьшению теплового дрейфа при визуализации органоидов.
2. Подготовьте решение LY 100 мМ в PBS. Хранить на льду, защищенном от света.
3. Подготовьте решение EGTA номинал 200 мМ в PBS. Храните его на льду.
4. Перенесите камерный покрывало, включав органоиды, в инкубационную камеру перевернутого конфокального микроскопа и включите инкубацию CO₂ (5%). Убедитесь, что камерный обкрытиный лист плотно заперт в стадии микроскопа.
5. Используя органоиды в одном колодце, а также ссылку, отрегулируйте настройки изображения микроскопа. Добавьте LY (3 л из 100 мМ LY в 150 л среднего) для получения окончательного объема 1 мМ LY в 300 л среднего. Инкубировать на микроскоп в течение 1 ч и настроить фокус для визуализации проема органоидов. Определите необходимую лазерную энергию для возбуждения LY (488 нм) и соответствующую чувствительность обнаружения прибора и попытайтесь изобразить ly флуоресценцию ly на уровне 30-40% от имеющегося динамического диапазона используемого инструмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте энергию лазерного возбуждения и эффективность обнаружения на необработанных органоидах 70 мин после добавления LY. Убедитесь, что энергия возбуждения достаточно высока, чтобы получить хорошо выставленное изображение. Чтобы избежать насыщения LY флуоресценции в микроскопических изображений, рекомендуется настроить эти настройки после ТОГО, как диффузия LY достигает устойчивого состояния.
6. Определите положение органоидов с помощью дифференциального интерференционного контраста (DIC) живой визуализации. Попробуйте собразить органоиды с сопоставимыми диаметрами (80 и 30 мкм) и сосредоточьтесь на центральном срезе органоидов, чтобы сделать изображение их просвета. Определите примерно 10 органоидов на скважину и попытайтесь изобразить только органоиды, близкие к поверхности покрытия, сферической структурой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество органоидов, которые могут быть изображены за пробег, зависит от скорости микроскопа. Рекомендуется изображение органоидов в течение 5 минут интервал. На обычном лазерном сканирующем микроскопе 40 позиций в общей сложности являются разумной отправной точкой.
7. Запись DIC и LY флуоресценции каждой позиции, чтобы задокументировать форму органоида и автофлуоресценции перед добавлением LY в скважины, используемые для проверки целостности барьера.
8. Не следует отображать органоиды, которые отображают высокую аутофлуоресценцию. Это связано с накоплением мертвых клеток в просвете органоида, и результаты аутофлуоресцентных органоидов трудно проанализировать потом.
9. Разбавить 3 зл и готовый раствор LY (100 мМ LY в 150 л среднего) и добавить это тщательно к каждому колодцу, не касаясь камерной крышкой. Рекомендуемая концентрация LY на скважину составляет 1 мМ. Окончательный объем на скважину должен сосупросмотреться в 300 л.
10. Быстро проверьте фокус определенных позиций и исправить, если это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LY быстро рассеивается через клеточную матрицу. Таким образом, конфокальная визуализация должна быть начата в течение 3 минут после добавления фторофора.
11. Начните замедленное изображение на микроскопе. Возьмите флуоресценцию изображение каждого положения каждые 5 минут в общей сложности 70 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды были изображены в 5 минут интервалы, чтобы визуализировать LY поглощения с течением времени. Для измерения кишечного барьера поломка, достаточно записать флуоресценцию до и 60 мин после добавления LY и еще раз 10 мин после добавления EGTA.
12. Добавьте 3 злитроподого раствора EGTA на скважину, не касаясь камерного обкрытия. Рекомендуемая концентрация в камерном покрывале EGTA составляет 2 мМ. Общий объем скважины должен составят 300 л.
13. Начните второй промежуток времени. Запись флуоресценции определенных органоидов снова с интервалом 5 мин в общей сложности 30 мин.
14. Откажитесь от всего в соответствии с местными правилами безопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

3. Анализ данных

1. Только проанализировать результаты органоидов, которые заняли LY после добавления EGTA.
2. Результаты можно количественно опрокинет с Помощью Fiji ImageJ.
3. Откройте набор данных в ImageJ, нажав файл (ru) Откройте и выберите данные изображений. В следующих вариантах BIO-Formats Импорт выберите стек View с: Hyperstack.
4. Откройте интересующий регион (ROI) менеджера, нажав на Анализ (ru) Инструменты Менеджер roI.
5. Нарисуйте овальную рентабельность инвестиций, нажав на кнопку Овального выбора в панели меню ImageJ. Нарисуйте выделение, содержащее внутренний просвет органоида. Затем нажмите Добавить в roI Manager.
6. Повторите шаги для трех представительных областей за пределами органоида.
7. Нажмите на Анализ в панели меню и выберите набор измерений. Включите только среднее значение серого цвета и отключите любые другие измерения. Затем нажмите OK.
8. Убедитесь, что все ROIs выбраны в ROI Manager. В roI Manager щелкните Подробнее Многомерная мера. В диалоге опции выберите Измерьте все срезы и один ряд на срез. Затем нажмите OK.
9. Выберите все значения в окне результатов и скопируйте их в приложение электронной таблицы для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если положение органоида перемещается во время замедленной визуализации, рентабельность инвестиций должна быть соответствующим образом скорректирована. Для этого выберите правильную рентабельность инвестиций в менеджере ROI и переместите ее на новую должность. Затем нажмите Обновление в менеджере ROI. Выполните измерение для каждой временной точки индивидуально, нажав мера в менеджере рентабельности инвестиций, а затем переключиться на следующую точку времени в окне изображения, используя бар на дне. Соберите все измерения в электронной таблице. Индивидуальная форма и движение органоидов в период визуализации требует анализа данных в ручном режиме.
10. Рассчитайте среднее значение интенсивности трех ROIs за пределами органоида для каждой временной точки.
11. Разделите интенсивность рентабельности инвестиций внутри просвета органоида на средняюю интенсивность рентабельности инвестиций снаружи и средней интенсивности внутри органоида.
12. Для того, чтобы вычислить относительное увеличение светиловой флуоресценции, разделите относительную флуоресценцию (см. шаг 3.11) в каждой временной точке, изображенной минимальной относительной флуоресценцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимальную относительную флуоресценцию, потому что иногда диффузия фторора может быть медленным в начале эксперимента.

Для проверки применения 3D малых кишечных органов мыши в качестве модели для количественной оценки влияния соединений, регулирующих целостность кишечного барьера, мы применили IFN-З. Для этого мы выделили и культивировали органоиды, полученные из IFN-я реагировать дикий тип и IFN-я-рецептор-2 нокаут мышей, которые не реагируют на IFN-Я8. При лечении 48 ч с IFN-я или PBS (контроль), все органоиды подверглись воздействию LY и изображения конфокального вращающегося диска живой клеточной микроскопии в 5 минутах интервалов в течение 70 минут. Функциональная целостность кишечного барьера в этой модели привела к исключению LY из просвета органоида, в то время как внутрилюминное накопление LY означало разрушение TJ. Репрезентативные микроскопические изображения флуоресценции после 70 мин инкубации с LY ясно показывают, что внутрилюминовелетняя ly флуоресценция была видна только в органоидах от диких животных типа, обработанных с ПОМОЩЬю IFN-З. В нестимулированных (PBS) контроля, ни в органоидов, полученных из выбить животных (IFN-R2ЗИЕК, Рисунок 1), нет внутрилюминовой LY флуоресценции присутствовал после 70 мин.

Добавление EGTA вызывает неспецифический срыв целостности кишечного барьера путем секвестра TJ кофакторов. Этот контроль всегда использовался в конце эксперимента, чтобы продемонстрировать способность соответствующего органоида взять на себя LY (Рисунок 1). Если при лечении EGTA не было обнаружено внутрилюминовой лифоресценции, органоид был исключен из эксперимента.

Для количественной оценки микроскопических результатов, LY флуоресценция была измерена в просвет ели и за пределами органоида. Относительные значения интенсивности были рассчитаны (флуоресценция внутри/флуоресценция снаружи и внутри) и показаны для каждого изображения точки времени. Рекомендуется избегать визуализации органоидов различных размеров. Мы решили сосредоточиться на органоидов с диаметром 80 и 30 мкм(рисунок 2). Схема протокола с репрезентативными изображениями показана на рисунке 3. Некоторые основные проблемы и методы устранения неполадок показаны и обсуждены на рисунке 4.

Рисунок 1: Целостность кишечного барьера может быть проанализирована в органоидах мыши. Кишечные органоиды из IFN-R2WT и IFN-R2ЗИЕК культивировались в присутствии ИФН-З в течение 48 ч или не лечились. Для исследования целостности кишечного барьера, LY (457 Da) был добавлен и confocal флуоресцентные изображения были захвачены в 5 минут интервалы в общей сложности 70 мин. Представитель изображения в точке времени 0 мин, 70 мин, и после добавления EGTA показаны (зеленый люцифер желтый; Шкала бар 20 мкм). Эта цифра была изменена из Bardenbacher и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Малая модель целостности кишечного органоидного барьера обеспечивает количественные результаты. (A)LY флуоресценция была определена внутри и снаружи органоида. Относительные значения интенсивности были рассчитаны (внутри/флуоресценция вне - внутри) по отношению к первоначальной относительной интенсивности и показаны для каждой временной точки. (B) Распределение размера проанализированных органоидов. Чтобы уменьшить стандартное отклонение и ошибки из-за изменений в соотношении поверхности к объему, мы проанализировали только органоиды диаметром 80 и 30 мкм. Средние значения соответствующих диаметров органоидов показаны SD (IFN-R2WT, n no 20; ИФН-ЗР2ЗИЕК, n No 18). Значения среднего диаметра существенно не менялись между различными группами (одностороннее ANOVA). (C) Проницаемость органоидов была определена 70 мин после добавления LY. Она была определена путем деления интенсивности внутрилюминовой флуоресценции после 70 мин на минимальную относительную интенсивность флуоресценции, измеренную в период наблюдения. Каждый бар представляет собой средние значения - SD, измеренные в 10 органоидах, полученных в ходе двух независимых экспериментов (IFN-NoR2WT,n no 20; ИФН-ЗР2ЗИЕК, n No 18). ИФН-З значительно увеличила поглощение LY только в органоидах ИФН-ЗР2WT. р-значение злт;0.001 в T-тест студента. Эта цифра была изменена из Bardenbacher и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Схематический протокол с репрезентативными изображениями. (A) Схематическое описание основных этапов протокола. (B) Представитель фотографии основных этапов протокола. (B1) Дика микроскопическое изображение центрального ломтика через подходящий органоид, который был выбран для анализа проницаемости. Пунктирная линия представляет ширину 89 мкм. (B2) Флуоресценция микроскопии картина того же органоида в (B1) перед добавлением LY. На рисунке показана автофлюоресценция органоида. (B3) Органоид 70 мин после добавления LY. Изображенный органоид не показывает поглощения LY и, следовательно, нетронутой барьерной функции. Пунктирные линии показывают ROIs для дальнейшего анализа. Разметяются внутренний просвет органоида и три представительные области вокруг органоида. (B4) Органоид после добавления EGTA. Органоид может быть пригоден для дальнейшего анализа, поскольку он показывает, LY поглощения после лечения EGTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Устранение общих проблем. (A) Таблица с общими проблемами и решениями. (B) Образцовые изображения. (B1) DIC изображение большого многоотраслевого органоида, который не подходит для этого асссе. (B2). Конфокальный образ органоида, отображающего высокую аутофлуоресценцию перед LY был добавлен в среду. Органоид был исключен из количественной оценки. (B3) Конфокальный образ органоида, отображающего низкую аутофлуоресценцию перед LY был добавлен в среду. В данном случае была количественно определена флуоресценция. (B4) Органоид, показывающий отсутствие поглощения LY из среды 30 мин после добавления EGTA и поэтому исключен из количественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.