Использование куриных хориоаллантоических Membrane In Vivo Модель для изучения гинекологических и урологических раков

Краткое содержание

Мы представляем куриную модель хориоаллантоической мембраны в качестве альтернативной, трансплантируемой модели in vivo для прививок гинекологических и урологических раковых клеток и опухолей, полученных пациентом.

Аннотация

Мыши модели являются эталоном испытаний для исследования рака in vivo. Тем не менее, стоимость, время и этические соображения привели к призывам к альтернативным моделям рака in vivo. Модель куриной хориоаллантоической мембраны (CAM) обеспечивает недорогую, быструю альтернативу, которая позволяет прямую визуализацию развития опухоли и подходит для визуализации in vivo. Таким образом, мы стремились разработать оптимизированный протокол для привить гинекологических и урологических опухолей в эту модель, которую мы представляем здесь. Примерно через 7 дней послеоплодное, воздушная клетка перемещается в васкуляризованную сторону яйцеклетки, где отверстие создается в скорлупе. Опухоли из мурин и клеточных линий человека и первичных тканей могут быть привиты. Они, как правило, семенами в смеси внеклеточной матрицы и среды, чтобы избежать клеточного рассеивательства и обеспечить поддержку питательных веществ, пока клетки набирать сосудистой питания. Опухоли могут расти еще до 14 дней до вылупления яйцеклеток. Путем имплантации клеток, стабилизируемых светлячков ойлиферазой, биолюминесценция может быть использована для чувствительного обнаружения роста опухоли на мембране и раковой клетки распространяются по всему эмбриону. Эта модель потенциально может быть использована для изучения опухоли, вторжения, метастази и терапевтической эффективности. Модель chicken CAM требует значительно меньше времени и финансовых ресурсов по сравнению с традиционными моделями мурина. Поскольку яйца иммунокомпромиссны и невосприимчивы, ткани любого организма потенциально могут быть имплантированы без дорогостоящих трансгенных животных (например, мышей), необходимых для имплантации тканей человека. Тем не менее, многие из преимуществ этой модели потенциально могут быть ограничения, в том числе короткое время генерации опухоли и иммунокомпромисс / иммунный толерантный статус. Кроме того, хотя все типы опухолей, представленные здесь, прививаются в модели куриной хориоаллантоической мембраны, они делают это с различной степенью роста опухоли.

Введение

Мыши служили классическим образцовым организмом для изучения заболеваний человека, в том числе злокачественных новообразований. Как млекопитающие, они имеют много общего с людьми. Их высокая степень генетического сходства позволила трансгенных манипуляций генома мыши, чтобы обеспечить огромное понимание генетического контроля заболеваний человека¹. Обширный опыт в обработке и экспериментировать с мышами привел к тому, что они являются моделью выбора для биомедицинских исследований. Однако, в дополнение к этическим и научным проблемам, касающимся моделей мурин, они также могут быть довольно дорогостоящими и трудоемкими^2,3. Развитие опухолей может занять недели или даже месяцы. Корпус в типичном учреждении в одиночку может работать в сотни до тысячи долларов в то время как опухоли развиваются. Рак яичников является примером этого недостатка, потому что его рост в моделях мурина может легко занять месяцы. Задержки в исследованиях прогресс потенциально влияние рака яичников пациентов постоянно низкий 5-летний показатель выживаемости только 47% (т.е., увеличение выживаемости только 10% в течение 30 лет)⁴. Аналогичным образом, урологические раковые заболевания (рак почек, простаты и мочевого пузыря) составляют 19% всех случаев рака в Соединенных Штатах и 11% случаев смерти, связанных с раком⁴. Таким образом, новый подход in vivo к изучению гинекологического и урологического рака может сэкономить лаборатории значительное время, труд и деньги, даже если эта модель применяется только для первоначальных экспериментов скрининга. Кроме того, в результате ускорения результатов исследований может значительно повлиять на 177000 лиц с диагнозом этих видов рака ежегодно.

Модель chicken CAM предлагает множество преимуществ, которые решают вышеупомянутые проблемы. Популярная модель для изучения ангиогенеза^5,6, вторжение опухолевых клеток^7,8,и метастазирование^7,9, модель cam эмбриона цыпленка уже был использован для изучения многих форм рака, в том числе глиомы^10,12,12, головы и шеи плоскоклеточной карциномы^13,14, лейкемия^15,16, рак от рака от утротротроя колоректальный рак¹⁸. Кроме того, CAM модели были созданы для нейробластомы¹⁹, Лимфома Буркитт²⁰, меланома²¹, и кошачьей фибросаркомы²². Предыдущие исследования также представили прививки рака мочевого пузыря²³ и рак предстательной железы клеток^{линий 24}, но с ограниченным и с ограниченным протоколом детали. Не только яйца гораздо дешевле, чем мыши, но они также производят высоко воспроизводимые результаты^25,26. Они показывают быстрое развитие сосуды, и прививок опухоли может произойти в так быстро, как несколько дней и быть визуализированы продольно через открытое окно. С 21-дневный промежуток времени между оплодотворением яйцеклеток и штриховки, эксперименты могут быть завершены в течение нескольких недель. Кроме того, низкая стоимость, ограниченные потребности в жилье и небольшие размеры легко позволяют крупномасштабные эксперименты, которые были бы запретительными для изучения мышей.

Поэтому мы стремились оптимизировать модель CAM для прививок гинекологического и урологического рака. Из-за иммунокомпромиссного статуса раннего куриного эмбриона^27,как мыши, так и человеческие клетки могут быть легко имплантированы. Таким образом, мы успешно привили рака яичников, почек, простаты и мочевого пузыря. Для каждого из этих типов опухоли, CAM легко принимает установленные линии морин и / или человеческих опухолевых клеток. Важно отметить, что свежесобранные первичные ткани опухоли человека могут также привить либо из переваренных клеток или кусочков твердой ткани с высоким уровнем успеха. Каждый из этих типов рака и источников клеток требует оптимизации, которую мы разделяем здесь.

Протокол

Все эксперименты, представленные в настоящем проекте, были рассмотрены и одобрены соответствующими этическими комитетами Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA). Использование деидентифицированных первичных опухолей человека было одобрено Советом ucla Institutional Review Board (Протокол номера 17-000037, 17-001169, и 11-001363). В Калифорнийском университете в Калифорнийском университете обзор Комитета по исследованиям животных не требуется для экспериментов с использованием куриных эмбрионов; протокол утверждения требуется только тогда, когда яйца будут вылупляются. Тем не менее, лучшие практики, такие как Руководящие принципы AVMA для эвтаназии животных, были использованы для обработки куриных эмбрионов этически и, чтобы избежать боли как можно больше. Исследователям настоятельно рекомендуется проверить требования надзора в их учреждении до начала исследований с использованием моделей CAM.

1. Приготовление яиц

1. Перед получением яиц соберите и уравновесите яичный инкубатор до 37,8 градусов по Цельсию (100 градусов по Фаренгейту) с 60-70% влажности в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации рисков загрязнения, автоклавированная вода может быть использована для контроля влажности.
2. После получения оплодотворенной, Род-Айленд Красные куриные яйца от сертифицированного поставщика лабораторных яиц, сухие протрите поверхность скорлупы бумажными полотенцами. Слегка смоченное бумажное полотенце может быть использовано для удаления прилипчитого материала. Высушите немедленно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивание оболочки с жидкостью ниже 43,3 градуса по Цельсию может ввести бактерии в яйцо. Если высажено или дезинфицировать яйца, температура жидкости должна быть между 43,3-48,9 градусов по Цельсию. Более высокие температуры могут варить яйца. Выбор дезинфицирующего средства должен быть сделан на основе микроорганизмов, вызывающих озабоченность.
3. Используйте карандаш или маркер, чтобы пометить дату на яйцо. Это считается днем развития 0.
4. Поместите яйца в яйцо инкубатор и инкубировать, по крайней мере 7 дней с вращением, чтобы позволить CAM развития. Автоматический ротатор может быть использован, или яйца могут быть повернуты 180 "2-3x в день.

2. Открытие яиц

ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие яиц должно быть сделано, когда CAM полностью разработан. Это, как правило, на развитие день 7 или 8.

1. Дезинфицировать шкаф биобезопасности с 70% этанола. Аналогичным образом дезинфицировать и место в биобезопасности шкаф яйцо стойку, яйцо свечи, маркер, беспроводной поворотный инструмент с кремния карбид шлифовальный камень и круговой резки колесо, 18 G иглы, трубчатый контроллер с четверть дюйма вакуумных труб, упаковка ленты, офис ножницы, изогнутые ножницы, semken (или аналогичные) щипцы, ватные шарики, и 6 х 7 см прозрачной пленки соусом. По возможности используйте стерильные, одноразовые или аутоклавированные инструменты.
2. Выключите яичный ротатор. Поместите примерно 1-3 яйца в шкаф биобезопасности на яичной стойке. В то время как в темноте, поместите яйцо свечи против яичной скорлупы, чтобы определить воздушную ячейку. Отметьте местоположение воздушной ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность освещения от яичного свечи имеет решающее значение для визуализации интерьера яйца. Если виолончельное элементосы или сосуды постоянно трудно увидеть, попробуйте заменить яйцо свечи батареи.
3. Переместите яйцо свечник над оболочкой, чтобы найти большую сеть кровеносных сосудов. При необходимости поверните яйцо. Идеальная сосуда будет ветвления вблизи середины яйца. Используйте маркер, чтобы нарисовать сваску, которая будет использоваться для имплантации.
4. Включите свет в капюшоне. Используя беспроводной роторный инструмент, оснащенный кремниевым карбидным шлифовальным камнем, просверлите небольшое отверстие в оболочке непосредственно над центром воздушной ячейки. Просверлите до тех пор, пока большая часть оболочки не будет удалена, но белая внутренняя мембрана не повреждена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бурение над воздушной клеткой перед ориентацией на сосуд ы позволяет определить толщину этой конкретной яичной скорлупы над воздушной клеткой, а не над CAM и сосудами. Если CAM или сосуд ы нарушается, то яйцо не используется для имплантации.
5. Пробурите и откройте еще одно небольшое отверстие, где будет открыто сосудистое окно, как это было сделано для воздушной клетки (шаг 2.4).
6. Используя 18 G иглу, аккуратно пробить через белый, внутреннюю мембрану над воздушной клеткой и сосуды. Если не удается проникнуть в оболочку, то тщательно просверлите немного больше. Убедитесь, что белая внутренняя мембрана (но не CAM) нарушается на протяжении всей пробуренной области. Удаление части мембраны не требуется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если CAM или сосуд нарушается во время этого шага, отбросить яйцо. Повреждение очевидно, если есть кровь или альбумин утечки из пробуренного отверстия.
7. Выключите капот света. Используя яичный свечник, убедитесь, что воздушная ячейка была перенесена из конца яйца в область над сосудой. При необходимости поместите вакуумную трубку, вставленную в контроллер трубы вокруг отверстия над исходной воздушной ячейкой, и аккуратно нанесите всасывание короткими очередями для перемещения воздушной ячейки.
8. Используйте маркер, чтобы наметить новое местоположение воздушной ячейки примерно 0,5 см внутри границы воздушного кама. Прикрепите кусок упаковочной ленты чуть более новой воздушной ячейки. При необходимости используйте стандартные офисные ножницы, чтобы обрезать ленту до соответствующего размера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лента может нарушить поток воздуха через оболочку и не должна быть больше, чем необходимо, чтобы полностью покрыть воздушную ячейку.
9. Вернуть яйца в инкубатор, чтобы согреться без вращения с новой воздушной ячейки вверх. Повторите шаги 2.2-2.9 для открытия оставшихся яиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Если не уверены в качестве развития CAM, небольшое количество яиц должны пройти через шаг 2.16 до открытия оставшихся яиц.
10. Поместите примерно 1-3 яйца с перемещенными клетками воздуха на яичную стойку в шкафу для биобезопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы избежать загрязнения в открытом яйце. Поэтому всегда открывайте яйца внутри шкафа для биобезопасности и, когда это возможно, используйте стерильные инструменты и оборудование.
11. Используя беспроводной вращающийся инструмент, оснащенный круглым режущим колесом, вырежьте небольшую линию над границей воздушной ячейки, нарисованной в шаге 2.8. Убедитесь, что это примерно 0,5 см внутри фактической границы воздушного CAM, чтобы избежать нарушения CAM или сосуды. Вырезать полностью через оболочку, но будьте осторожны, чтобы не проникнуть достаточно глубоко, чтобы нарушить CAM или сосуды.
12. Используя изогнутые ножницы, разрежьте оставшуюся воздушную ячейку, чтобы создать окно в оболочке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь или мембрана присутствует на удаленной оболочке, то яйцо не подходит для имплантации. Если высокая доля яиц не чисто открыты, рассмотреть вопрос о ожидании по крайней мере 1 дополнительный день, чтобы открыть оставшиеся яйца, чтобы лучше CAM формирования. Если оболочки оставшихся яиц не были проколоты, вращение яиц в инкубаторе должно быть возобновлено.
13. Проверьте жизнеспособность эмбриона. Жизнеспособные эмбрионы будут отображать обширную сосуду, прозрачный альбумин, движение эмбриона или видимое сердцебиение.
14. Используя щипточки Semken, вытащите маленькие кусочки хлопка из стерильного ватного шарика. Аккуратно профолите поверхность CAM, чтобы удалить оболочку пыли и мусора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мусора должно быть выполнено в тот же день, когда яйца открыты.
15. Обложка оболочки открытия с одной четверти кусок 6 х 7 см прозрачной пленки соусом.
16. Верните яйца в инкубатор. Убедитесь, что яйцо сидит надежно с открытым окном вверх и CAM не касаясь прозрачной заправки пленки. Используйте кусок яичной стойки, край яичного ротатора, или другой подходящий элемент для поддержки любых яиц, которые продолжают катиться.
17. Повторите шаги 2.10-2.16 для всех оставшихся яиц, которые будут открыты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие яйцеклеток не обязательно должно быть завершено в тот же день, что и имплантация. Ожидание по крайней мере 1 день может помочь устранить яйца, жизнеспособность которых была скомпрометирована, открыв скорлупу.

3. Подготовка суспензии раковых клеток к трансплантации (вариант 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть завершено непосредственно перед имплантацией, которая в идеале должна проходить между днями 7 и 10. Пожалуйста, ознакомьтесь с примечаниями в начале шага 5 или 6 для получения дополнительной информации о дате имплантации. Этот подход был использован для всех клеточных линий и культивированных переварок опухоли почки.

1. Оттепель внеклеточного матричного раствора на льду.
2. Используя механическое и/или ферментативное пищеварение, получите одноклеточное суспензию с помощью метода, подходящего для имплантированного типа клеток.
3. Приостановить общее количество клеток, которые будут имплантированы в соответствующую среду для имплантации. Имплантаты 1-2 х 10⁶ 6 клеток на яйцо являются типичными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда, используемая для имплантации клеточных линий, как правило, является полной средой, используемой для культивирования клеток, содержащей FBS или замену сыворотки. Имплантация опухолевых дайджестов обычно использует полную среду, используемую для культивирования клеточных линий одного и того же типа рака. Однако при необходимости в экспериментальном порядке могут быть внесены коррективы в среднюю формулировку. Влияние на развитие опухоли и рост необходимо эмпирически определить.
4. Пеллет клетки, используя скорость центрифуги и время, подходящее для используемых клеток. Типичные скорости 250-300 х г,а время 5-10 мин.
5. Удалите супернатант из гранулированных клеток путем пипетки. Механически resuspend клетки в остаточной среде через щелкая или pipetting. Место на льду, чтобы охладиться. Измерьте объем ячеек и средних с помощью трубажа соответствующего размера.
6. Рассчитайте объемы имплантации таким образом, что 1-2 х 10⁶ клеток имплантируются в объеме 20-100 л на яйцо с окончательной внеклеточной матричной концентрацией 2,7-4 мг/мл белка. Добавьте средний, любые желаемые факторы роста или добавки, и внеклеточное матричного решения в соответствии с этим расчетом. Держите на льду до готовности к имплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчетов в шагах 3.3 и 3.6, дополнительный том по крайней мере половины яичного имплантата должны быть включены для обеспечения адекватного объема для всех яиц в группе. Для имплантации линий раковых клеток яичников (т.е. SKOV3 и ID8) было имплантировано 10⁶ клеток на яйцо. Для имплантации линии клеток карциномы почек RENCA были имплантированы культивированные клетки, полученные из переваренной первичной карциномы почек человека, линии раковых клеток предстательной железы (т.е. CWR, CWR, C4-2 и MyC-CaP) и линии раковых клеток мочевого пузыря (т.е. HT-1376 и T24), 2 x 10⁶ клеток.

4. Подготовка опухолевых частей для имплантации (вариант 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть завершено непосредственно перед имплантацией, которая в идеале должна проходить между днями 7 и 10. Пожалуйста, ознакомьтесь с примечаниями в начале шага 5 или 6 для получения дополнительной информации о дате имплантации. Первичный рак яичников и мочевого пузыря были имплантированы в виде опухолевых кусочков.

1. Оттепель внеклеточного матричного раствора на льду. Разбавить до конечной концентрации белка 2,7-4 мг/мл в соответствующей среде, содержащей любые желаемые факторы роста или добавки. Продолжайте на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация опухолевых частей обычно использует полную среду, используемую для культивирования клеточных линий того же типа рака. Однако при необходимости экспериментально могут быть внесены коррективы в среднюю формулировку. Влияние на привлёки опухоли и рост должны быть эмпирически определены.
2. Использование скальпеля или ножниц, акцизных штук от свежей опухоли. Идеальные размеры варьируются от 2-5 мм с каждой стороны. Держите ткани погружены в среду до готовности к имплантации.

5. Имплантация с использованием антипригарного кольца (вариант 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть имплантированы, начиная с 7-го дня развития, если CAM полностью развит. Имплантация может произойти в любое время до вылупления, что позволяет достаточно времени для развития опухоли и желаемого эксперимента, но обратите внимание, что иммунные клетки эмбриона начинают присутствовать около дня 10 постферттилизации²⁷. Темпы роста опухоли значительно различаются в зависимости от типа клеток и должны быть эмпирически определены для типа клеток интереса. Рак яичников и раковые клетки простаты были имплантированы с помощью антипригарного кольца метод. Обратите внимание, что, когда антипригарным кольцом не доступно, наконечник трубы может быть сокращен до аналогичного размера и используется.

1. Используйте 70% этанола для дезинфекции шкафа биобезопасности и всех необходимых инструментов: яичная стойка, изогнутые щипцы радужной оболочки глаза, антипригарные кольца (1/4 дюйма внутреннего диаметра), стеклостер, соответствующий объем pipets и советы, 6 х 7 см прозрачная пленка соусом, офисные ножницы, и маркер или карандаш. По возможности следует использовать стерильные, одноразовые или аутоклавированные инструменты.
2. Поместите яйца для имплантации на яйцестойкую стойку в шкаф для биобезопасности. Выберите управляемое количество яиц. Типично до шести лет. Избегайте позволяя яйца значительно остыть во время работы с ними.
3. Удалите прозрачную пленку соусом из оболочки, прокатки края к открытому окну, чтобы избежать вытягивая куски оболочки. Убедитесь, что яйца являются жизнеспособными и здоровыми. Идеальные яйца будут иметь большой сосуд в центре открытой области с небольшими сосудами, разветвляющимися от него.
4. Используя изогнутые щипцы радужной оболочки, поместите стерильное, антипригарным кольцом на CAM над сосудом, в идеале над точкой ветви. Используйте стерильный стеклянный стержень, чтобы мягко абрадировать CAM.
5. Pipet подвески клетки от шага 3.6 в центр антипригарного кольца. Кроме того, используйте щипцы, чтобы поместить часть опухоли со ступени 4.2 в центр антипригарного кольца и покрыть 20-50 зл внеклеточного матричного раствора, генерируемого в шаге 4.1.
6. Запечатайте отверстие одной четвертью прозрачной пленки 6 х 7 см. Пометьте яйца соответствующим обозначением имплантата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нумеринг яиц в группе облегчает продольные наблюдения.
7. Верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие оболочки сидит в вертикальном положении и что яйцо является безопасным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут быть возвращены в яичный инкубатор без вращения. Кроме того, высокая жизнеспособность постимплантов может быть получена с помощью инкубатора 37-38 градусов по Цельсию с деактивированным CO₂ и гигрометром для мониторинга влажности, которая должна составить 50%-80%.

6. Имплантация без антипригарного кольца (вариант 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть имплантированы, начиная с 7-го дня развития, если CAM полностью развит. Имплантация может произойти в любое время до вылупления, что позволяет достаточно времени для развития опухоли и желаемого эксперимента, но обратите внимание, что иммунные клетки эмбриона начинают присутствовать около дня 10 постферттилизации²⁷. Этот метод был использован для имплантации клеток карциномы почек и раковых клеток мочевого пузыря.

1. Используйте 70% этанола для дезинфекции шкафа биобезопасности и всех необходимых инструментов: соответствующего объема pipets и советы, стерильные 10-см ткани культуры блюда, яичная стойка, 6 х 7 см прозрачной пленки соусом, офисные ножницы, и маркер.
2. Привить прививочный объем клеточной подвески, генерируемой в шаге 3.6 в подходящий типный наконечник трубача (200 Л. Удерживая верхнюю часть кончика, аккуратно выбрасывайте кончик трубы и поместите горизонтально в стерильное, 10-сантиметровое блюдо культуры ткани.
3. Повторите шаг 6.2 для всех образцов в группе с одним блюдом для каждой группы.
4. Поместите советы в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 15-30 мин, чтобы внеклеточная матрица частично полимеризировалась.
5. После 15 мин инкубации, начать проверку на полимеризацию. Небольшое количество жидкости обычно вытекает из кончика при размещении на блюдо. Полимеризация этой жидкости может быть использована для оценки степени полимеризации жидкости в наконечнике.
6. Поместите яйца, которые будут имплантированы на яйцеклетки стойку в шкаф биобезопасности. Выберите управляемое количество яиц. Типично до шести лет. Избегайте позволяя яйца значительно остыть во время работы с ними.
7. Удалите прозрачную пленку соусом из оболочки, прокатки края к открытому окну. Это позволяет избежать вытягивания кусочков оболочки.
8. Убедитесь, что яйца являются жизнеспособными и здоровыми. Идеальные яйца будут иметь большой сосуд в центре открытой области с небольшими сосудами, разветвляющимися от него.
9. Поместите один наконечник трубы на соответствующий размер пайпета. Угнетаете поршень, чтобы заставить частично полимеризованную подвеску клеток на CAM над большим, хорошо развитым сосудом, в идеале над точкой ветки.
10. Запечатайте отверстие одной четвертью прозрачной пленки 6 х 7 см.
11. Пометьте яйцо соответствующим обозначением имплантата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нумеринг яиц в группе облегчает продольные наблюдения.
12. Верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие оболочки сидит в вертикальном положении и что яйцо является безопасным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут быть возвращены в специализированный инкубатор без вращения. Кроме того, высокая жизнеспособность постимплантов может быть получена с помощью инкубатора 37-38 градусов по Цельсию с деактивированным CO₂ и гигрометром для мониторинга влажности, которая должна составить 50%-80%.

7. Биолюминесценция изображения светлячок luciferase отмеченных опухолей

ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантированные клетки были стабилизированы с геном, кодируя светлячок люциферазы или другие факторы изображения, то в результате опухоли могут быть визуализированы с помощью биолюминесценции изображений. Флуоресценция изображения не рекомендуется на нетронутых яиц из-за высокого фона из яичной скорлупы. Это анализ конечной точки, так как открытие оболочки резко снижает выживаемость. Опухоли могут быть изображены в любое время, которое подходит для экспериментальных потребностей и скорость роста опухоли. Однако, в среднем, яйца люк 21 дней послеоплодизации. Таким образом, день развития 18 является подходящей точкой, чтобы избежать нежелательных штриховок.

1. При необходимости транспортировать яйца в оборудование для визуализации. Залито яйца на 10-сантиметровые ткани культуры блюда. Верните их в яичный инкубатор 37.8 градуса по Цельсию (100 градусов по Фаренгейту) с механизмом вращения, удаленным или деактивированным. Влажность не имеет решающего значение для транспорта и визуализации.
2. Используя изогнутые щипчинки радужной оболочки, осторожно нажмите CAM от оболочки, пока CAM заподлицо с альбумином и эмбрионом. Используя широко опрокинутые щипкания образца, оторвайте части оболочки, чтобы расширить отверстие оболочки адекватно для визуализации опухоли.
3. Вводят в яичный альбумин не менее 50 л 30 мг/мл D-люциферина. Аналогичный объем D-люциферина также может быть пипнетвечен в антипригарным кольцом или на поверхность CAM в области, содержащей имплантированные клетки. Это обеспечивает оптимальную биолюминесценцию при отсутствии идеального сосудистого питания. Инкубировать в течение 8 мин.
4. Введите 20-50 л изофлюран в альбумин яйца, чтобы обезопадать яйцо. Инкубировать еще 2 мин. Кроме того, яйцо может быть помещено в индукционную камеру, содержащую 2-2,5% испаряется изофлуран. При прекращении эмбрионального движения получена достаточная глубина анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большие объемы изофлуран (100 л) могут быть использованы для эвтаназии яйца.
5. Поместите яйца в устройство биолюминесценции и изображение с использованием соответствующих настроек, как это определено инструкциями производителя. Для этого исследования использовалось время экспозиции в 1 мин.
6. Чтобы сизображение мейк-кии и эмбриона, откройте яйцо в 10-сантиметровую ткань культуры блюдо.
   1. Возьмите яйцо пальцами обеих рук на нижней стороне яйца всередине яйца и большие пальцы по обе стороны от открытия скорлупы.
   2. Аккуратно потяните друг от друга две половинки яйца с большими пальцами, а осторожно нажав на яйцо пальцами.
   3. Когда оболочка примерно наполовину отделена от CAM и эмбриона, переверните яйцо вверх дном над 10-сантиметровой культурой.
   4. Продолжайте отделять половинки оболочки. Если CAM прилипает к внутренней части оболочки, осторожно используйте пальцы, чтобы отодвинуть CAM от оболочки.
   5. При желании эмбрион может быть перевернут в другое блюдо.
   6. При необходимости, дополнительный изофлуран может быть введен как в шаге 7.4.

8. Уборка опухолей

ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли могут быть собраны в любое время, что подходит для экспериментальных потребностей и скорость роста опухоли. Однако, в среднем, яйца люк 21 дней послеоплодизации. Таким образом, день развития 18 является подходящей точкой, чтобы избежать нежелательных штриховок.

1. Возьмите опухоль с помощью щипков. Использование ножниц (весенние ножницы радужной оболочки хорошо работать) или скальпель, тщательно акцизной опухоли от CAM.
2. Если опухоль была трансумционной с светлячок luciferase гена, reimaging может быть выполнена для проверки успешного удаления трудновизутки опухолей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезанные опухоли могут быть проанализированы любым методом, подходящим для конкретного эксперимента. Опухоли также могут быть реимплантированы в CAM или мышей. Для подтверждения опухолевой идентичности, опухоли могут быть исправлены, парафин встроенных, и рассматривается с гематоксилин и эозин или иммуногистохимических окрашивания.

Результаты

До сих пор мы обнаружили, что этот метод имплантации, чтобы быть успешным для рака яичников, почек, простаты и мочевого пузыря. Каждый из них был оптимизирован для определения конкретных условий имплантации, хотя может быть гибкость. Из проверенных типов опухоли, рост рака яичников был гораздо менее выраженным и, как правило, не видимых без помощи биолюминесценции изображения (Рисунок 1). Тем не менее, ужесточение CAM может ощущаться с щипками в области импла...

Обсуждение

Расширение опухоли и прививок с помощью модели CAM позволяет более быстрый и непосредственно наблюдаемый рост опухоли, чем существующие модели животных in vivo. Кроме того, затраты значительно ниже, как только первоначальная покупка оборудования завершена, особенно по сравнению со стоимостью иммунокомпромиссных мышей. Начальное, ослабленное иммунитетом состояние куриных эмбрионов легко позволяет привить ткани человека и мурин. Даже с этими преимуществами, модель CAM имеет ограничения. Короткое время, которое может быть п...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
-010 Тефлон (ПТФЭ) Белый 55 Уплотнительные кольца Duro Shore D	Уплотнительное кольцо для хранения	TEF010	Антипригарное кольцо для посева клеток. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Политетрафторэтилен (ПТФЭ).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Клеточная линия рака предстательной железы человека.
Клетки CWR22Rv1			CWR были любезным подарком доктора Дэвида Агуса (Keck Medicine Университета Южной Калифорнии)
Антитело к цитокератину 8/18 (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0,02 мг	Используется в разведении 1:100 для иммуногистохимического анализа опухолей яичников человека.
D-Люциферин Светлячок, соль калия	Goldbio	LUCK-1G
Деликатные операционные ножницы; Изогнутый; Шарп-Шарп; длина лезвия 30 мм; 4-3/4 дюйма. Общая длина	Roboz Surgical	RS6703	Это приведено в качестве примера. Любые подобные изогнутые ножницы также подойдут.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Набор инструментов	Dremel	8050-N/18	Этот набор содержит все необходимые инструменты.
Оплодотворенные куриные яйца (Род-Айленд Ред - Браун, Лабораторный класс)	AA Lab Eggs Inc.	Н/Д	Необходимо будет определить местного поставщика яиц, так как этот поставщик осуществляет поставки только на региональном уровне.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Клеточная линия рака мочевого пузыря человека.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Можно использовать и другие инкубаторы для яиц, но их надежность необходимо проверить. После имплантации также можно использовать клеточный инкубатор с отключенным CO2.
ID8			Коммерчески недоступен, см. PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Инкубатор Склад	1102	Можно использовать и другие свечи, однако этот является предпочтительным среди тех, которые мы тестировали. Этот свечник входит в вышеупомянутый набор инкубатора.
Щипцы с радужной оболочкой, 10 см, изогнутые, зубчатые, наконечники 0,8 мм	World Precision Instrument	15915	Это приведено в качестве примера. Любые подобные изогнутые щипцы также подойдут. Для этого метода было использовано несколько брендов.
Изофлуран	Clipper, распределяющий	0010250
IVIS Lumina II in vivo Imaging System Perkin	Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	раствор внеклеточного матрикса
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Мышиная клеточная линия рака предстательной железы.
Портативный контроллер пипеток Pipet-Aid XP	Drummond Scientific	4-000-101	Подойдет любой подобный контроллер пипетки.
Иглы для подкожных инъекций PrecisionGlide	BD	305196	Это приведено в качестве примера. Любая игла 18G будет работать аналогично.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Щипцы Semken	Fine Science Tools	11008-13	Это представлено в качестве примера. Любые подобные щипцы или другой стиль, который соответствует предпочтениям исследователя, будут уместны.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Клеточная линия рака яичников человека.
Образцы щипцов	Электронная микроскопия Sciences	72914	Это представлено в качестве примера. Щипцы, используемые для оттягивания оболочки для биолюминесцентной визуализации, имеют длину около 12,8 см с наконечниками шириной 3 мм.
Стерильные ватные шарики	Fisherbrand	22-456-885	Это предоставлено в качестве примера. Достаточно любых стерильных ватных шариков.
Мешалки с резиновым полицейским; диаметр 5 мм, длина 6 дюймов	United Scientific Supplies	GRPL06	Это приведено в качестве примера. Любые подобные стеклянные стержни для перемешивания также подойдут.
T24	ATCC	HTB-4	Клеточная линия рака мочевого пузыря человека.
Tegaderm Прозрачная повязка Оригинальная рама Стиль 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Тарелка для культуры тканей, диаметр 10 см	Corning	353803	Это приведено в качестве примера. Можно использовать любую подобную, стерильную 10-сантиметровую посуду. Бактериологическое лечение тканей не требуется.
Лабораторная трубка Tygon Clear - стена 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 футов)	Tygon	AACUN017	Это приведено в качестве примера. Любые трубки аналогичного размера также подойдут.