Этот протокол описывает экспериментальный процесс по производству высокотитра инфекционных вирусных псевдотипированных частиц (pp) с оболочкой гликопротеинов из двух штаммов гриппа А и как определить их инфекционность. Этот протокол очень адаптируется к разработке pps любого другого типа окутанных вирусов с различными гликопротеины оболочки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство высокотитерных инфекционных частиц гриппа Псевдотипированные с конвертами гликопротеинов из высокопатогенных вирусов H5N1 и Avian H7N9
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Случайная прямая передача высокопатогенного вируса птичьего гриппа А H5N1 (HPAI H5N1) и H7N9 людям и их летальности являются серьезными проблемами общественного здравоохранения и указывают на возможность эпидемии. Тем не менее, наше молекулярное понимание вируса является рудиментарным, и необходимо изучить биологические свойства его оболочки белков в качестве терапевтических целей и разработать стратегии по борьбе с инфекцией. Мы разработали твердую вирусную псевдотипированную частицу (pp) платформу для изучения вируса птичьего гриппа, включая функциональный анализ его гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA) конвертгликопротеинов, реассортировызные характеристики HAs и NAs, рецепторы, тропизмы, нейтрализация антител, диагностика, инфекционность, для целей разработки лекарств и разработки вакцин. Здесь мы описываем экспериментальную процедуру по установлению pps с оболочкой гликопротеинов (HA, NA) из двух штаммов гриппа А (HAPI H5N1 и 2013 птичьи H7N9). Их генерация основана на способности некоторых вирусов, таких как вирус мурин лейкемии (MLV), включать конверт гликопротеинов в pp. Кроме того, мы также подробно, как эти pps количественно с RT-qPCR, и инфекционность обнаружения родной и несовместимые вирусpps в зависимости от происхождения HAs и NAs. Эта система является очень гибкой и адаптируемой и может быть использована для создания вирусных pps с конвертом гликопротеинов, которые могут быть включены в любой другой тип окутанного вирусом. Таким образом, эта платформа вирусных частиц может быть использована для изучения диких вирусов во многих исследованиях.
Введение
Миссия вирусной частицы состоит в том, чтобы транспортировать ее геном из инфицированной клетки-хозяина в неинфицированную клетку-хозяина и доставить ее в цитоплазму или ядро в рецифицируемой форме1. Этот процесс первоначально вызван связыванием с рецепторами клеток-хозяев, а затем слиянием вирионных и клеточных мембран. Для окутанных вирусов, таких как вирусы гриппа, шип гликопротеинов отвечают за связывание рецепторов и слияние1,2. Вирусные гликопротеины конверта (например, пирогенны, антигены), участвуют во многих важных свойствах и событиях, таких как инициирование жизненного цикла вируса (связы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. День 1: Культура клеток и посев
- Культивировать эмбриональные почки человека (HEK) 293T/17 клеток в 60 мм блюда с dulbecco модифицированных основных средств (DMEM) дополнен 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин (DMEM Полный средний, DCM) в 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа (CO2) инкубатора до около 80% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: РЕКОМЕНДУЕТся низкий проход HEK 293T/17. - Тщательно промыть клетки с 5 мл фосфата буферного солья (PBS) 1x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная обработка клеток HEK 293T/17 должна быть очень нежной, потому что они легко отсоединяются. - Удалить PBS и разъединить клетк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В зависимости от общей процедуры, описанной выше, мы создали 10 типов pps, сочетающих две группы HAs/NAs или ГЛИкопротеин VSV-G или гликопротеины без конверта (показано в таблице 1). Семь из них заразны. PPS, которые гавани не-конверт гликопротеин или только гавань NA не показали какой-либо инфекции здесь. Процедура производства гриппа pp рассматривается на рисунке 1. На рисунке 3показаны электронные микрографы трансмиссии pps (например, H5N1pp).......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы описываем метод производства псевдотипированных частиц вируса гриппа (pp) в условиях BSL-2. Репортер плазмид pcDNA-GFP включен в pps и может быть использован для количественной оценки pps FACS в анализе инфекции. Мы выбрали два типа восприимчивых клеточных линий, потому что они широко используются в исследованиях гриппа. Клетки MDCK обеспечат хороший контроль над переменными увековеченными человеческими клетками, используемыми в этих исследованиях.
Этот протокол основан на .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от провинции Чжэцзян медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, 2017KY538), Ханчжоу муниципальной медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, OO20190070), Ханчжоу медицинской науки и Проект "Технологический ключевой проект" (Grant Numbers, 2014-11) и муниципальный проект автономного применения в Ханчжоу социального развития и научных исследований (Grant Numbers, 20191203B134).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бензоназа Нуклеаза | Миллипор | 70664 | Эффективное снижение вязкости и удаление нуклеиновых кислот из белковых растворов |
| Прозрачные плоскодонные полистирольные микропланшеты, обработанные TC (96-луночные) | Corning | 3599 | Обработаны для оптимального прикрепления клеток Стерилизованы гамма-излучением и сертифицированы как безпирогенные Индивидуальные буквенно-цифровые коды для идентификации скважин |
| Прозрачные многолуночные планшеты (6-луночные) | Costar | 3516 | Индивидуальные буквенно-цифровые коды для идентификации лунок Обработаны для оптимального прикрепления клеток Стерилизованы гамма-облучением |
| Модифицированная эфирная среда Дульбекко (DMEM) | Gibco | 11965092 | Широко используемая базальная среда для поддержки роста многих различных клеток млекопитающих |
| Фетальная бычья сыворотка | Excell | FND500 | Фетальная бычья сыворотка, которая может предложить отличную ценность для базовой клеточной культуры, специализированных исследований и специфических анализов |
| Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) | Beckman coulter | цитофлекс | |
| Альвеолярная аденокарцинома человека Клетки A549 | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Эмбриональная почка человека (HEK) HEK-293T/17 клетки | ATCC | CRL-11268 | Универсальный реагент для трансфекции, который показал свою эффективность для эффективной трансфекции самого широкого спектра адгезивных и суспензионных клеточных линий |
| Инвертированный флуоресцентный биологический микроскоп | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Микроскоп с инвертированным светом | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Липофектамин 2000 Реагент для трансфекции | Invitrogen | 11668019 | Быстрое, чувствительное и точное обнаружение и количественное определение мишеней РНК-мишеней с помощью зондов с помощью зондовой ПЦР. |
| Универсальный зонд Luna One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Выдерживает до 14 000 RCF РНКазы-/ДНКазы непирогенных |
| клеток собачьей почки Madin-Darby (MDCK) | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Микроцентрифужная трубка (1,5 мл) | Axygen | MCT-150-C | 33 мм, гамма-стерилизованный фильтрующий |
| блок шприца Millex-HV, 0,45 &; m, PVDF | Millipore | SLHV033RS | улучшенную минимальную незаменимую среду (MEM), которая позволяет снизить прием добавок фетальной бычьей сыворотки не менее чем на 50% без изменения скорости роста или морфологии клеток. Среда Opti-MEM I также рекомендуется для использования с катионными реагентами для трансфекции липидов, такими как реагент Липофектамин. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | Антибиотики пенициллин и стрептомицин используются для предотвращения бактериального загрязнения клеточных культур благодаря их эффективному совместному действию в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. |
| пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140122 | Максимальная RCF составляет 12 500 xg Диапазон температур от -80 °°; C до 120 °°; C РНКаза без РНКазы Стерильные |
| пробирки для ПП (15 мл) | Corning | 430791 | стабильной и высокореактивной сериновой |
| протеазой Proteinase K | Beyotime | ST532 | Обработано для оптимального прикрепления клеток Стерилизовано гамма-излучением и серифицировано непирогенной чашкой |
| культур, обработанной TC (60 мм) | Corning | 430166 | Трипсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота TPCK Обработанный, практически бессолевой, лиофилизированный порошок, ≥ 10 000 BAEE единиц/мг белка |
| TPCK-трипсин | Sigma | T1426 | Этот жидкий состав трипсина содержит ЭДТА и феноловый красный. Gibco Trypsin-EDTA производится из порошка трипсина, облученной смеси протеаз, полученных из поджелудочной железы свиньи. Благодаря своей пищеварительной силе трипсин широко используется для диссоциации клеток, рутинного прохождения клеточной культуры и первичной диссоциации тканей. Концентрация трипсина, необходимая для диссоциации, варьируется в зависимости от типа клеток и экспериментальных требований. |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный | Gibco | 25200056 |
Ссылки
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
