Методическая статья

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

DOI:

10.3791/60677

⸱

27 февраля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод криоаПЕКС, в котором apEX2-тегами мембранного белка могут быть локализованы путем передачи электронной микроскопии в оптимально сохранившейся ультраструктуре клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключевые клеточные события, такие как трансдукция сигнала и мембранный оборот, зависят от правильного расположения белка в сотовых отсеках. Понимание точной субклеточной локализации белков, таким образом, имеет важное значение для ответа на многие биологические вопросы. Поискнадежной этикетки для определения локализации белка в сочетании с адекватной клеточной консервацией и окрашиванием исторически был сложным. Недавние достижения в области визуализации электронной микроскопии (EM) привели к разработке многих методов и стратегий для увеличения клеточной консервации и маркировки целевых белков. Относительно новый генетический тег на основе пероксидаза, APEX2, является перспективным лидером в области клонируемых ЭМ-активных тегов. Подготовка образцов для передачи электронной микроскопии (TEM) также продвинулась в последние годы с появлением криофиксации путем замораживания высокого давления (HPF) и низкотемпературного обезвоживания и окрашивания через замену замораживания (FS). HPF и FS обеспечивают превосходное сохранение клеточной ультраструктуры для tEM-изображений, уступая только прямой крио-изображению образцов стекловидного тела. Здесь мы представляем протокол для метода cryoAPEX, который сочетает в себе использование тега APEX2 с HPF и FS. В этом протоколе, белок интерес маркируется APEX2, а затем химической фиксации и реакции пероксидазы. Вместо традиционного окрашивания и обезвоживания алкоголя при комнатной температуре, образец крификируется и подвергается обезвоживанию и окрашиванию при низкой температуре через FS. Используя cryoAPEX, не только может быть идентифицирован интересуемый белок в субклеточных отсеках, но и дополнительная информация может быть решена в отношении его топологии в структурно сохранившейся мембране. Мы показываем, что этот метод может обеспечить достаточно высокое разрешение для расшифровки моделей распределения белка в просвете органеллы, а также различать разобщенность белка в пределах одной органеллы в непосредственной близости от других немаркированных органелл. Кроме того, cryoAPEX является процедурно простым и поддается клеткам, выращенным в культуре тканей. Это не более технически сложной задачей, чем типичные методы криофиксации и замораживания замены. CryoAPEX широко применим для TEM-анализа любого мембранного белка, который может быть генетически помечен.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биологические исследования часто включают в себя вопросы решения субклеточной локализации белка в клетках и органеллах. Иммунофлуоресцентная микроскопия обеспечивает полезное представление с низким разрешением локализации белка, и последние достижения в области визуализации супер-разрешения толкают границы разрешения для флуоресцентно помеченных белков1,2,3. Тем не менее, электронная микроскопия (EM) остается золотым стандартом для визуализации с высоким разрешением клеточной ультраструктуры, хотя маркировка белков является сложной задачей.

Исторически сложилось так, что некоторые методы EM были использованы для того чтобы причалить вопросам ультраструктурной локализации протеина. Одним из наиболее часто используемых методов является иммуноэлектронная микроскопия (IEM), где антиген-специфические первичные антитела используются для обнаружения белка, представляющих интерес. Сигнал EM генерируется применением вторичных антител, спряженных с электрон-плотными частицами, чаще всего коллоидным золотом4,5. Кроме того, антитела, спряженные с ферментами, такими как переоксидаза редиса (HRP), могут быть использованы для производства электронного плотного осадка6,7,8. Существуют два основных подхода к маркировке IEM, называемые предварительновнедентиями и поствстранительной маркировкой. В предварительном встраивании IEM, антитела вводятся непосредственно в клетки, что требует световой фиксации и промежности клеток9,10,11. Оба шага могут повредить ультраструктуру12,13. Разработка значительно меньших антител, состоящих из фрагмента антитела Fab, спряженого с 1,4 нм наноголдом, позволяет использовать очень нежные условия промеаблизации; однако, nanogold слишком мал для сразу визуализации под TEM и требует дополнительных шагов повышения, чтобы стать видимым14,15,16. В пост-встраиваемом IEM, антитела применяются на тонких участках клеток, которые были полностью обработаны фиксации, обезвоживания и встраивания в мише17. Хотя этот подход позволяет избежать шага permeabilization, сохранение эпитопа интереса на протяжении всего отбора образцов являетсясложной задачей 18,19,20. Метод Токуясу световой фиксации с последующим замораживанием, криосекцией и обнаружением антител обеспечивает улучшенное сохранение эпитопа21,22. Однако технические требования крио-ультрамикротомии, а также неоптимальный контраст, достигнутый в клетке, являются недостатками23.

Использование генетически закодированных тегов устраняет многие трудности IEM, связанные с обнаружением интересуемого белка. Различные теги доступны, в том числе HRP, ферритин, ReAsH, miniSOG, и metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Каждый из них имеет преимущества по сравнению с предыдущими методами, но каждый из них также имеет недостатки предотвращения широкого использования. Эти недостатки варьируются от бездействия HRP в цитозоле до большого размера тега ферритина, светочувствительности ReAsH, а также небольшого размера и отсутствия совместимости с клеточным окрашиванием металлотионеина. Недавно, белок, полученный из аскорбата переоксидаза была разработана как EM тег, названный APEX233,34. Как пероксидаза, APEX2 может катализировать окисление 3,3' диаминобензидин (DAB), производя осадок, который реагирует с тетродов осмия, чтобы обеспечить локальный контраст EM с минимальным диффузии из белка интерес (менее 25 нм)33,35. В отличие от традиционных методов на основе HRP, APEX2 чрезвычайно стабилен и остается активным во всех сотовых отсеках33. Образцы могут быть обработаны для TEM с использованием традиционных EM образца окрашивания и методы, которые позволяют хорошую визуализацию окружающих структур33,34,36. Из-за своего небольшого размера, стабильности и универсальности, APEX2 стал EM-тегс с большим потенциалом.

Многие из рассмотренных выше подходов либо не могут быть, либо еще не объединены с современным состоянием в ультраструктурной консервации, криофиксации и низкотемпературной заморозке-замещении. Таким образом, они страдают от отсутствия сохранения мембраны и/ или окрашивания клеток для определения точной локализации белка. Это обязательно ограничивает разрешение и интерпретацию данных, которые могут быть получены. Криофиксация путем замораживания высокого давления (HPF) включает в себя быструю заморозку образцов в жидком азоте при высоком давлении (2100 бар), что вызывает витрификации, а не кристаллизации водной образцов, тем самым сохраняя клетки в почти родном государстве37,38,39. HPF сопровождается замораживанием замены (FS), низкой температуры (-90 градусов по Цельсию) обезвоживание в ацетоне в сочетании с инкубации с типичными пятнами EM, таких как тетроксид осмия и уранила ацетат. HPF и FS вместе обеспечивают явное преимущество перед традиционной химической фиксацией (более длительный процесс, который может привести к артефактам) и обезвоживанию алкоголя при комнатной температуре или на льду (что может привести к извлечению липидов и сахаров), и, таким образом, желательно сочетать с лучшими МЕТками EM для обнаружения белка.

Одна из причин того, что HPF/FS не был объединен с маркировкой APEX2, заключается в том, что легкая химическая фиксация является необходимым условием реакции пероксидазы, ограничивающей диффузию продукта реакции DAB. В исследованиях APEX2 до сих пор, фиксация и реакция пероксидазы следуют традиционные методы EM для окрашивания и обезвоживания алкоголя33,36. Тем не менее, было показано, что после химической фиксации с HPF / FS обеспечивает явное преимущество в сохранении по сравнению с традиционной химической фиксации и обезвоживания алкоголя только40. Потеря ультраструктурной целостности, наблюдаемая в традиционных образцах TEM, оказывается менее связанной с фиксацией, чем с обезвоживанием, что обычно делается с использованием алкоголя при комнатной температуре или на льду, и может привести к извлечению липидов и сахаров40,41. Для разработки метода криоаПЕКС мы предположили, что химическая фиксация и реакция пероксидазы, за которыми следуют HPF и FS, дадут оптимальный результат с точки зрения ультраструктурной консервации.

Здесь мы представляем протокол криоаПЕКС, который сочетает в себе apEX2 пометки с криофиксированием и замораживание методов замены (Рисунок 1). Этот простой протокол состоит из трансфекции интересуемого белка APEX2, химической фиксации клеток и реакции пероксидазы. Затем HPF и FS выполняются с последующим типичным встраиванием в мелину и тонким сечением. TEM изображений показывает отличное сохранение ультраструктуры с помощью этого метода. Кроме того, наблюдалось субклеточная локализация с высоким разрешением и пространственное распределение эндоплазмического люменного белка (ER). Этот метод широко полезен для обнаружения локализации мембранного белка в клетках для анализа электронной микроскопии. В наших руках метод успешно работал для различных клеточных линий, выращенных в культуре тканей, в том числе HEK-293T (человеческий эмбриональный почки), HeLa (рак шейки матки человека), Cos7 (африканская зеленая обезьяна фибробласт), и BHK (ребенок хомяка почки). Подробные инструкции описаны ниже с помощью heK-293T клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток и трансфекция

  1. Семена HEK-293T клетки на 60 мм в диаметре или больше ткани культуры блюдо и расти до 60%-90% слияния в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  2. Трансфектные клетки с apEX2-тегами плазмиды выражения млекопитающих с использованием трансфекционного реагента (см. Таблица материалов) в соответствии с указаниями производителя.
  3. При 12-15 ч после трансфекции, мыть клетки один раз с фосфатами буферного солья (PBS). Удалите клетки из тарелки путем мягкой стирки с ПОМОЩЬю PBS. Реагент диссоциации, такой как трипсин, может быть использован при необходимости для данного типа ячейки. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин, чтобы сформировать гранулы.

2. Химическая фиксация и реакция пероксидазы

  1. Тщательно удалите супернатант и resuspend гранулы в 2 мл 2% глютаральдегида (v/v) в 0,1 М натрия какодилат буфер, рН 7,4, при комнатной температуре. Поместите образец на лед и инкубировать в течение 30 мин. Пелле образец при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. С этого момента до шага 2.3.3, держать образец и растворы на льду, и выполнять центрифугирование при 4 градусах Цельсия.
    ВНИМАНИЕ: Как гюмтаралдегид и натрий какодилат буфер (содержащий мышьяк) являются токсичными. Надлежащие процедуры безопасности и средства индивидуальной защиты должны использоваться во время обработки. Растворы, содержащие глутаральдегид и/или буфер какодилата натрия, должны быть утилизированы в качестве опасных химических отходов.
  2. Вымойте гранулы 3x в течение 5 минут с 2 мл 0,1 М буфер акодилат натрия. Для них, а также последующих спусков, осторожно resuspend клетки гранулы в требуемом растворе, затем центрифуга в течение 5 минут при 500 х г и тщательно удалить и отбросить супернатант. Следует соблюдать осторожность с помощью повторяющихся шагов по гранулировке и повторному восстановлению, чтобы свести к минимуму потерю образца.
  3. Провести реакцию пероксидазы
    1. Приготовьте свежий раствор, содержащий 1 мг/мл 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB) в буфере какодилата натрия 0,1 м. Растворите DAB путем энергичного вихря в течение 5-10 мин.
      ВНИМАНИЕ: DAB является токсичным и потенциальным канцерогеном и должен быть обработан с надлежащей процедуры безопасности и средств индивидуальной защиты. Решения, содержащие DAB, следует рассматривать как опасные химические отходы.
    2. Вымойте гранулы, переопрокинув 3 мл раствора DAB, а затем гранулы при 500 х г в течение 5 мин.
    3. Отрежь гранулы в растворе DAB 3 мл, к которому была добавлена перекись водорода, чтобы достичь конечной концентрации 5,88 мМ. Инкубировать в течение 30 минут при температуре номера. Гранулы становятся заметно коричневого цвета, указывающими на наличие нерастворимого продукта реакции DAB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации DAB может потребоваться оптимизировать для каждого образца. Изменение цвета можно контролировать на световом микроскопе. По нашему опыту, инкубация 15–45 мин является адекватной для большинства белков. Перекись водорода должна быть получена из свежеиспулевой бутылки или той, которая была хорошо запечатана после открытия.
    4. Пеллетклетки, затем мыть 2x в течение 5 минут с 0,1 М натрия какодилат буфер, а затем одна шайба в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) или клеточного носителя выбора.
  4. Приостановите действие клеточной гранулы в 500 л криозащитного раствора DMEM (или других клеточных носителей выбора), содержащего 10% сыворотки крупного рогатого скота плода и 15% сывороточного сыворотки крупного рогатого скота. Пеллет снова, слегка увеличивая скорость центрифуги от 500 х г, если требуется для достижения гранулы в толстый крио-защиты раствора. Откажитесь от большинства супернатантов, гарантируя, что достаточно жидкости остается так, что гранулы не высохнут. Транспортировать клеточные гранулы к инструменту замораживания высокого давления.

3. Замораживание высокого давления

  1. Заполните резервуар морозильной камеры высокого давления жидким азотом (LN2) и запустите насос, чтобы заполнить образец камеры с LN2.
    ВНИМАНИЕ: Используйте надлежащие процедуры безопасности и средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги специфичны для морозильной камеры высокого давления Leica EMPACT2.
  2. Убрать любую оставшуюся жидкость из клеточной гранулы, используя угол лабораторной салфетки или бумажное полотенце. Достаточно жидкости должно оставаться, что гранулы образует пасту похож по консистенции на зубную пасту. Она должна быть достаточно тонкой, чтобы быть аспирированы в 20 л трубчатый наконечник.
  3. Аспир2-3 л клеточных гранул и откладывать его на мембранный переносчик. Заполните колодец мембранного носителя полностью, так что поверхностное натяжение создает небольшой купол на вершине, но жидкость не выливается из колодца. Никаких пузырьков воздуха не должно быть.
  4. Сдвиньте мембранный переносчик в картридж и закрепите. Поместите картридж в машину HPF, которая была подготовлена и загрунтована, и нажмите Начало замораживания.
  5. Проинспектировать температуру по сравнению с графиками времени, чтобы убедиться, что давление достигло 2100 бар и температура достигла -196 градусов по Цельсию в пределах 200 мс, и оба параметра оставались устойчивыми для 600 мс измерения.
  6. Повторите шаги от 3,3 до 3,5 до тех пор, пока не будет использована клеточная гранулы или не будет заморожено необходимое количество образцов.
  7. Ведение картриджи погружены в LN2, удалить каждый мембраны перевозчика из картриджа, место в пластиковой капсуле, и место пластиковой капсулы в крио-флакон полный LN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Крио-флаконы с образцами могут храниться в LN2 dewar в крио-тростях или крио-коробках.

4. Замена заморозки

ВНИМАНИЕ: Используйте надлежащие процедуры безопасности и средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом. Кроме того, многие из химических веществ, используемых в шаге 4 являются токсичными, в том числе дубиновой кислоты, тетроксида осмия, и уранил ацетат. Эти химические вещества должны обрабатываться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности и утилизироваться в качестве опасных химических отходов.

  1. Заполните автоматизированный блок замены замораживания с LN2. Доведите температуру до -90 градусов по Цельсию.
  2. Подготовка FS Mix 1 и начать FS.
    1. В химическом капюшоне, подготовить раствор 0,2% дубиновой кислоты (w/v) и 5% DI воды в ацетоне и аликут 1 мл на образец в крио-флаконы. Место в LN2, чтобы заморозить.
    2. Поместите флаконы FS Mix 1 и крио-флаконы, содержащие замороженные клеточные гранулы, в камеру образца fs-подразделения. Перенесите внутреннюю капсулу, содержащую мембранный переносчик из флакона LN2, в соответствующий флакон, содержащий FS Mix 1.
    3. Запустите протокол FS с его первым шагом в 24 ч при -90 градусов по Цельсию. После 24 ч, пауза FS, и мыть образцы 3x в течение 5 мин с ацетоном, который был охлажден до -90 градусов по Цельсию.
  3. Подготовка FS Mix 2 и полный FS
    ВНИМАНИЕ: Тетроксид осмия является высокотоксичным и окисляющим химическим веществом, которое должно обрабатываться только обученными людьми в соответствии с установленными протоколами безопасности. Необходимо соблюдать протоколы хранения и утилизации осмийсодержащих растворов, а также маркировки лабораторных участков, в которых используется тетроксид осмия. Тетроксид осмия должен быть обработан в химическом капюшоне с персональным защитным оборудованием, включая защиту глаз, лабораторное пальто, обеспечивающее полную защиту рук, двойные перчатки Nitrile и дополнительный респиратор.
    1. В химическом капоте, подготовить раствор 1% тетроксида осмия, 0,2% уранила ацетата, и 5% DI воды в ацетоне. Aliquot 1 мл на образец в крио-флаконы и место в LN2 заморозить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы дубиновой кислоты (10% ж/v в ацетоне), тетрокисода осмия (10% w/v в ацетоне) и уранил ацетат (8% w/v в метаноле) могут быть подготовлены и сохранены в крио-флаконах в LN2 dewar для удобства приготовления FS Mixes.
    2. Поместите крио-флаконы с FS Mix 2 в блок FS и перенесите капсулы из третьего ацетона мыть в FS Mix 2 флаконы. Инкубировать в FS Mix 2 для 72 ч при -90 градусах по Цельсию, а затем постепенное потепление до 0 градусов по Цельсию в течение 12-18 ч.
  4. Держите температуру на уровне 0 градусов и промойте 3x в течение 30 минут с предварительно охлажденный ацетон из свежеискрытой бутылки.

5. Проникновение и встраивание в горюшку

ВНИМАНИЕ: используемая здесь мизаня (см. таблицу материалов)является токсичной до полимеризации и должна обрабатываться с помощью надлежащих процедур безопасности и средств индивидуальной защиты. Любая неполимеризованная мизаня должна быть утилизирована в качестве опасных химических отходов.

  1. Проникать в образцы с возрастающей концентрацией мисы, растворенного в ацетоне из недавно открытой бутылки. Приготовьте смесь компонентов из семы A, B и D в пластиковом стакане в соответствии с указаниями производителя и инкубините образцов в следующих концентрациях с мелины: 2%, 4% и 8% для 2 ч каждый при 0 градусах Цельсия. Инкубировать в 15%, 30%, 60%, 90%, и 100% синой по 4 ч каждый при комнатной температуре. Инкубировать 4 ч в смеси компонентов А, В, С и Д.
  2. Поместите мембранные носители с клеточной гранулой вверх в плоские формы встраивания и заполните с помощью миснины (A, B, C и D). Бумажные этикетки для образцов могут быть добавлены в скважины в это время.
  3. Полимеризуйте в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию на 24-36 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после полимеризации.
  4. Удалите блоки из формы и дайте остыть. Чтобы удалить мембранный переносчик, сначала поместите образец в вертикальный патрон ультрамикротома, где его можно визуализировать с увеличением. Отделить мембранный носитель от блока путем комбинации dabbing жидкого азота на мембранном несущем для того чтобы отделить металл от пластмассы, и использование лезвия бритвы для того чтобы обломоками прочь сеялку с мибраны несущей. При разделении, осторожно отнимите мембранный переносчик, оставив купол клеточной гранулы на лице блока.
  5. Поместите блок с открытой клетки гранулы лицом вверх в плоской встраивающей формы, которая немного глубже, чем первая плесень, и заполнить с помощью мисы. Полимеризуется при 60 градусах по Цельсию при 24-36 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после полимеризации.

6. Секция

  1. Обрезать блок вокруг клеточной гранулы с помощью лезвия бритвы. Затем поместите блок в образец патрона на секционную руку ультрамикротома. Используя стеклянный или алмазный нож, обрезать блок в трапециевидной формы, тесно окружающих клетки гранулы.
  2. Получить 90 нм ультратонких секций клеточной гранулы с помощью стеклянного или алмазного ножа.
  3. Возьмите ленту разделов на сетке TEM. Формвар покрытием медных слот сетки (1 х 2 мм2 слот) полезны для изображения серийных разделов. Высушите сетку, прогремя край на листе фильтровальной бумаги, и храните в ящике для хранения сетки TEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после секции.

7. TEM Imaging

  1. Установите сетку на держатель TEM и поместите в микроскоп. Мы регулярно используем Tecnai T12 при 80 кВ для скрининга образцов криоапекса. Приобретайте изображения клеток и субклеточных структур, представляющих интерес с маркировкой APEX2.
  2. При желании получите дополнительный мембранный контраст с помощью свинца после окрашивания. См Рисунок 2 для сравнения не-пост-окрашенных образцов(Рисунок 2I-K) и привести пост-окрашенных образцов(Рисунок 2A-H).
    1. Поплавок сухих сеток раздела вниз на каплю разбавленного раствора хлорида натрия (1,5 мМ), 2x на 1 мин каждый, затем 1x на 10 мин.
    2. Поплавок сетки на капле свинцового раствора Сато в течение 1 мин. Вымойте, плавая на растворе хлорида натрия 3x на 1 мин, затем на DI воды 3x в течение 1 мин. Blot избыток жидкости из сетки и хранить в сетке коробки.
      ВНИМАНИЕ: Свинец является токсичным химическим веществом и должен быть обработан с надлежащей процедуры безопасности и средств индивидуальной защиты. Растворы, содержащие свинец, должны быть утилизированы в качестве опасных химических отходов.
  3. Изображение пост-окрашенных образцов на TEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При традиционной подготовке образца для TEM, ведущий контрастный шаг выполняется до TEM изображения. Тем не менее, рекомендуется, чтобы для cryoAPEX образцов, изображение осуществляется в первую очередь на неконтрастных образцов. Это гарантирует, что сигнал от тега может быть легко расположен его сильный контраст с более слегка окрашенных клеточных структур. Для многих образцов не потребуется никаких дальнейших окрашивания; однако, если пожелает дополнительный контраст мембраны, можно провести послеокирование свинца (Шаг 7.2) и повторно есеобразить образец.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для сравнения ультраструктурной консервации с помощью метода криоаПЕКС с традиционной фиксацией и обезвоживанием мы подготовили образцы, в которых эндоплазмическая мембрана ретикулума (ERM; ER мембраны) пептид был помечен APEX2 и трансфицируется в HEK-293T клеток. ERM-APEX2 локализуется к цитоплазматической стороне ER и переделывает структуру ER в морфологически различные структуры, известные как организованные гладкие ER (OSER)34,42,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь протокол криоаПЕКС обеспечивает надежный метод для характеристики локализации мембранных белков в клеточной среде. Мало того, что использование генетически закодированного тега APEX2 обеспечивает точную локализацию интересующего белка, но и использование криофиксации и низкотемпературного обезвоживания обеспечивает отличную консервацию и окрашивание окружающей клеточной ультраструктуры. В совокупности эти подходы являются мощным инструментом для локализации белка с высокой точностью в его субклеточно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол вытекает из публикации Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Эта работа поддерживается грантами R01GM10092 (для S.M.) и AI081077 (R.V.S.) от Национальных институтов здравоохранения, CTSI-106564 (до S.M.) от Института клинических и трансляционных наук Индианы, и PI4D-209263 (до S.M.) от Института клинического и клинического заболевания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлоридгидратSigma-AldrichD5637-1G
ацетон (стеклодистиллированный)Электронная микроскопия Sciences10016
Стаканы; Пластик, одноразовый 120 куб. смЭлектронная микроскопия Sciences60952
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA7906-100G
Криогенные флаконы для хранения, 2 млVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, однокомпонентный A, M эпоксидная смолаSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, однокомпонентный B, отвердитель 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, однокомпонентный C, ускоритель 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka, однокомпонентный DSigma-Aldrich44614-100ML
Форма для встраивания, стандартная плоская, 14 мм x 5 мм x 6 ммЭлектронная микроскопия Sciences70901
Форма для встраивания, стандартная плоская, 14 мм x 5 мм x 4 ммЭлектронная микроскопия Sciences70900
Фетальная бычья сыворотка; Nu-Serum IV Питательная средаДобавка Corning355104
Glass Knife Boats, 6,4 ммЭлектронная микроскопия Науки71008
Производитель стеклянных ножейLeica MicrosystemsEM KMR3
Глутаральдегид 10% водный растворЭлектронная микроскопияНауки 16120
HEK 293 КлеткиATCCCRL-1573
Морозильник высокого давления с системой быстрого переносаLeica MicrosystemsEM PACT2Архивный продукт заменен на Leica EM ICE
Перекись водорода 30% растворFisher Scientific50-266-27
Липофектамин 3000 Реагент для трансфекцииThermoFisher ScientificL3000015
Мембранный носитель для EM PACT2, 1,5 мм x 0,1 ммMager Scientific16707898
Тетраоксид осмия, кристаллическаяэлектронная микроскопия Sciences19110
Фосфат буферизованный физиологический раствор (PBS) 20X, ультрачистый классVWR97062-950
пластиковые капсулы для AFS/AFS2, 5 мм x 15 ммMager Scientific16702738
Слотовые сетки, 2 x 1 мм медь с поддерживающей пленкой FormvarElectron Microscopy SciencesFF2010-Cu
Буфер какодилата натрия, 0,2 м, pH 7,4Электронная микроскопияНауки 102090-962
Гидроксид натрия, гранулы 500 г (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Дубильная кислотаЭлектронная микроскопия Науки21710
Чашки для культуры тканей, полистирол, стерильный, Corning, 100 ммVWR25382-166
Ультрастеклянные полоскидля ножейЭлектронная микроскопия Науки71012
УльтрамикротомLeica MicrosystemsEM UC7
Дигидрат уранилацетатаЭлектронная микроскопия Науки22400

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003(2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041(2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315(2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

APEX2

Похожие статьи