Method Article

Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

DOI:

10.3791/60686

⸱

February 21st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует в режиме реального времени запись полной дозы-реакции отношений для агониста индуцированной активации GPCR из одного слоя клеток, выращенных на одном микроэлектроде с использованием без этикетки импеданса измерений. Новая схема дозирования значительно увеличивает пропускную схему без потери во времени разрешения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Без этикетки impedance основе анализы все чаще используются для неинвазивного изучения лиганд-индуцированной активации GPCR в экспериментах клеточной культуры. Этот подход обеспечивает мониторинг клеток в режиме реального времени с разрешением времени, зависящим от устройства, до нескольких десятков миллисекунд, и он полностью автоматизирован. Однако, когда число образцов становится высоким (например, доза-ответ исследований для различных лигандов), стоимость одноразовых электродов массивов, а также доступное разрешение времени для последовательных хорошо хорошо записи могут стать ограниченными. Таким образом, мы представляем серийный протокол дополнения агониста, который имеет потенциал для значительного увеличения выпуска без этикетки GPCR анализов. Используя протокол последовательного добавления агониста, агонист GPCR добавляется последовательно в увеличении концентраций к одноклеточному слою при постоянном мониторинге импеданса образца (агонистовый режим). С помощью этого последовательного подхода теперь можно установить полную кривую реакции дозы для агониста GPCR только из одного слоя клеток. Протокол последовательного агониста применяется к различным типам соединения GPCR, Gq Gi/0 или Gs и совместим с рекомбинантными и эндогенными уровнями экспрессии исследуемого рецептора. Блокирование рецепторов антагонистами GPCR также оценивается (антагонистский режим).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете представлено подробное описание серийного протокола добавления, разработанного для количественной оценки активации рецептора белка, индуцированного Г-жа (GPCR) в правильно выращенных клетках по измерениям без этикетки импеданса. G белковые рецепторы (GPCRs) участвуют во множестве физиологических функций и заболеваний человека1. Из-за этого и их хорошей доступности на поверхности клетки, GPCRs являются одной из наиболее важных целей наркотиков. Эта оценка находит свое отражение в, по оценкам, число 700 утвержденных препаратов, ориентированных на GPCRs, что эквивалентно 35%-ной доле на всех продаваемых препаратах2.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Посев клеток на электродных массивах

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор макета электрода является компромиссом между чувствительностью и количеством исследуемых ячеек. Чем меньше электрод, тем более чувствительным является измерение, но чем меньше количество исследуемых ячеек. Для клеток, показывающих сильные колебания импеданса с течением времени в базовых условиях, более крупные или межцифровые электроды предпочтительнее.

  1. Предварительно согреть все растворы, необходимые для стандартного пропуска ячеек и посева в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Для анализов с человеческими U-373 МГ клеток он принимает: фосфат буферного сольникового раство....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичная схема для подготовки различных агонистовых решений показана для эксперимента с использованием 8-колодных электродных массивов с гистамином в качестве агониста в таблицах 1-4. Таблица 1 и таблица 2 представляют объемы и концентрации для эксперимента с использованием режима добавления 1 (cf., Рисунок 1),в то время как таблица 3 и таблица 4 представляют объемы и концентрации для экспер.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод для измерения импеданса без этикетки для определения отношения доза-реакции активации гЦКр в отсутствие или наличии конкретных антагонистов для одного и того же рецептора. Доказательство концепции этого метода было представлено в недавней публикации12. Насколько нам известно, это первое исследование, описывающее создание полной кривой реакции на дозу агонист-опосредованного активации GPCR с использованием одноклеточного слоя in vitro. Этот подход неизбежно требует исп.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Барбару Горицник и Надю Хинтеррайтер за помощь в культивированиеклето клеток и подготовку экспериментальных решений. Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку исследовательской учебной группы 1910 "Лекарственная химия селективных лигандов GPCR", финансируемой Немецким исследовательским фондом (DFG) под грантом No 222125149. JAS особенно признательна за стипендию, предоставленную Баварской программой гендерного равенства.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bü Счетная камераМариенфельда (Lauda-Kö nigshofen, Германия)640210
колбы для клеточных культур 25 см2Greiner bio-one (Frickenhausen, Германия)690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)Thermo Scientific (Дармштадт, Германия)\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (Дармштадт, Германия)\
Diphenhydramine hydrochlorideSigma Aldrich (Тауфкирхен, Германия)D3630
Eagle's Minimum Essential Medium с 4,5 г/л D-глюкозы и 2,2 г/л NaHCO3Sigma Aldrich (Тауфкирхен, Германия)D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc. (Трой, Нью-Йорк, США)\
8-луночные электродные массивы (8W1E PET)Applied BioPhysics Inc. (Трой, Нью-Йорк, США)\ПЭТ основание с рабочим электродом 0,049 мм2 и противоэлектродным электродом ~50 мм2 (золото)
96-луночные электродные массивы (96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc. (Трой, Нью-Йорк, США)\ПЭТ основание с двумя электродами (золото) с 0,256 мм2 общей площадью электрода
Фетальная телячья сыворотка (FCS)Biochrom (Берлин, Германия)S0615
Гистамина дигидрохлоридCarl Roth (Карлсруэ, Германия)4017.1
Ламинарный проточный колпак (Herasafe, KS 12)Thermo Scientific (Дармштадт, Германия)51022515безопасный шкаф класса II
Leibovitz' L-15 mediumThermo Scientific (Дармштадт, Германия)21083-027
L-глутаминSigma Aldrich (Тауфкирхен, Германия)G7513
Микропипетка большая (100 - 1000 &; L)Brandt (Wertheim, Германия)704780
Микропипетка большая (20 - 200 &; L)Brandt (Wertheim, Германия)704778
Микроскоп (фазовый контраст, Nikon Diaphot)Nikon (Dü
Пенициллин/стрептомицинSigma Aldrich (Тауфкирхен, Германия)P0781
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma Aldrich (Тауфкирхен, Германия)D8537
Пипетка, серологическаяGreiner bio-one (Фрикенхаузен, Германия)607 180
Пипетка (accu-jet pro)Brandt (Вертхайм, Германия)26300
ТрипсинSigma Aldrich (Тауфкирхен, Германия)T4174in PBS с 1 мМ ЭДТА
Пробиркой, 15 млGreiner bio-one (Фрикенхаузен, Германия)188 271
Tube, 50 млGreiner bio-one (Фрикенхаузен, Германия)210 261
MG cellsATCC (Роквилл, Мэриленд, США)ATCC HTB-17
водяная баня (TW21)Julabo (Зеельбах, Германия)\
U-373

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free Impedance AssaysGPCR AssaysSerial Agonist AdditionDose Response CurveImpedance MonitoringHistamine ConcentrationFour Parameter Logistic ModelReceptor BlockingGPCR AntagonistsCell Seeding

Related Articles