Method Article

Одновременное обогащение сродства двух постпереводных модификаций для количественной оценки и локализации сайта

DOI:

10.3791/60780

⸱

February 27th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Buck Institute for Research on Aging

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот рабочий процесс описывает производительность времени и экономически эффективного обогащения нескольких белковых посттрансляционных модификаций (ПТМ) одновременно для количественного глобального протеомического анализа. Протокол использует пептидного уровня PTM обогащения с несколькими конъюгированными антителами, а затем данные-независимых приобретения масс-спектрометрии анализа для получения биологической информации в PTM перекрестный разговор.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение нескольких посттрансляционных модификаций (ПТМ) белков является важным шагом для понимания перекрестного разговора PTM и получения более целостного понимания функции белка. Несмотря на важность многофункциональных исследований по обогащению ПТМ, несколько исследований исследуют более одного ПТМ за один раз, частично из-за расходов, времени и больших количеств белка, необходимых для выполнения нескольких глобальных протеомных анализПТ. Обогащение сродства "одного горшка", подробно описанное в этом протоколе, преодолевает эти барьеры, позволяя одновременное выявление и количественную оценку пептидов с остатками лизина, содержащими ацетилирование и succinylation PTMs с низким количеством выборки Вход. Протокол включает в себя подготовку белкового лизата из мышечной печени мышей-нокаутов SIRT5, производительность пищеварения трипсина, обогащение ПТМ и производительность масс-спектрометрического анализа с использованием рабочего процесса по сбору данных (DIA). Поскольку этот рабочий процесс позволяет обогащать два ПТМ из одного и того же образца одновременно, он предоставляет практический инструмент для изучения перекрестного разговора PTM, не требуя больших количеств образцов, и это значительно сокращает время, необходимое для подготовки образца, данные приобретение и анализ. Компонент DIA рабочего процесса предоставляет всеобъемлющую информацию о PTM-специфических данных. Это особенно важно при изучении локализации участка PTM, так как DIA предоставляет полные наборы фрагментов ионов, которые могут быть расшифрованы с точки зрения вычислений, чтобы различать различные изоформы локализации ПТМ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Множество посттрансляционных модификаций динамически регулируют белки и пути через воздействие на активность1, сигнализацию2,и оборот3,4. Например, белковые киназы активируются или деактивируются при добавлении фосфатных групп5,а ацетилирование гистона и другие модификации обеспечивают механизм изменения структуры хроматина и служат транскрипционными регулятивными механизмами6,7. В последние годы, доказательства установлены, что несколько PTMs работать в согласии или конкурировать для регулирования функции белка или деятельности8,9,10,11. Таким образом, понимание перекрестного разговора PTM является нарождающейся потребностью в исследованиях PTM. Однако большинство доступных протеомических рабочих процессов для выявления и количественной оценки сайтов PTM сосредоточены на отдельных модификациях, а не на взаимосмежаже, в ходе чем несколько модификаций. Описанный рабочий процесс коррелирует с конкретными белковыми модификациями «горячих точек» и остатками лизина, которые модифицируются несколькими различными ПТМ.

Существует растущая потребность в научном сообществе для осуществимых методов для изучения нескольких ПТМ одновременно12. Большинство методов для глобальной идентификации и количественной оценки сайтов нескольких типов ПТМ являются сложными из-за высоких затрат и количества тканей требуется12,13. Мало того, что многократные эксперименты по обогащению PTM отнимают много времени с точки зрения подготовки образцов, сбора данных и анализа данных, но эти исследования обычно требуют больших и часто непомерно высокой степени белка11. Описано здесь протокол для одновременного обогащения и анализа нескольких ПТМ, который также рассматривает некоторые из этих барьеров и позволяет крупномасштабных PTM профилирования и оценки перекрестного разговора между различными PTMs14. Этот рабочий процесс в один горшок излагает практический способ для биомедицинских исследователей глобально профиль нескольких PTMs, определить совместно модифицированные пептиды, и изучение PTM перекрестный стебель в эффективный и экономически эффективный способ14,15.

Здесь этот метод демонстрируется путем изучения митохондриального белка ацилации, которая была впервые изучена более 50 лет назад16. Он специально концентрируется на ацетилирование лизина17 и succinylation18, в том числе совместное возникновение этих изменений на белки и даже совместной модификации на уровне пептида. Так как исследование использует sirtuin 5 (SIRT5) нокаут мыши модели, он был выбран, чтобы сосредоточиться на обогащении ацетилации и succinylation сайтов. Это решение было принято потому, что succinylation сайты являются целями SIRT5 desuccinylase и, таким образом, как ожидается, показать значительное upregulation в KO мышей, что делает их наиболее актуальными PTMs в этом случае. Оба ПТМ биологически актуальны, как недавно обобщены Carrico et al.19. В целом, ацетилирование показывает важное влияние на экспрессию генов и обмен веществ, и succinylation было сообщено, чтобы регулировать метаболизм сердца и функции20.

Описанный протокол может быть выполнен с низким количеством материала для ввода белка (например, 1 мг белка лизата) и уменьшает общую продолжительность эксперимента за счет сокращения времени, затрачиваемого на обработку образцов, приобретение MS и анализ данных. Схема рабочего процесса приведена на рисунке 1. Мы также использовали еще меньшее количество исходного материала (до 100 мкг белка лизата, масштабирование вниз количество шариков, используемых соответственно), что, как и ожидалось, снижает общую урожайность выявленных ацилатированных пептидов; однако, он по-прежнему обеспечивает весьма ценные результаты и количественные ацитилированные пептиды.

В то время как так называемые сверху вниз или среднего вниз рабочие процессы, как правило, не используют протеолитические подходы к пищеварению (и, таким образом, поддерживать связь нескольких ПТМ в пределах одного белка), этот протокол фокусируется на пептид основе сродства обогащения подход, чтобы получить дополнительную глубину и чувствительность для идентификации И количественной оценки PTM (Рисунок 1). Кроме того, этот пептид-ориентированный рабочий процесс использует современные методы масс-спектрометрии, в том числе 1) комбинацию взаимозависимости данных (DDA) для создания спектральных библиотек и 2) независях от данных приобретения (DIA) для точной количественной оценки PTM в процессе, свободном от меток.

Рабочие процессы DIA преодолевают стохастичность выборки типичных схем сканирования ДДА, всесторонняя фрагментация всех пептидных сигналов в пределах выборки м/з диапазона21. Эта функция также чрезвычайно полезна с точки зрения локализации участка, потому что легче получить информацию о том, какие конкретные ионы фрагментов модифицируются в пептид. Кроме того, рабочие процессы DIA позволяют идентифицировать и количественно определить незначительные изоформы ПТМ-пептида с идентичными ионами прекурсоров. Методы ДИА могут также определить конкретную локализацию участка ПТМ в пептиде на основе конкретных соответствующих ионов фрагментов, которые всесторонне измеряются в любое время. Тем не менее, подходы DDA часто используют функции "динамического исключения", которые исключают несколько выборок MS/MS для одного иона предшественника, тем самым не хватает незначительных изоформ PTM.

Описанная здесь стратегия одновременного обогащения идеально подходит для исследований, которые выиграют от глобального профилирования и количественной оценки нескольких ПТМ, изучения перекрестного разговора PTM и понимания динамических взаимодействий посттрансляционных модификаций. Идентификация нескольких обогащенных ПТМ в одном комбинированном рабочем процессе была описана: глобальным, последовательным или параллельным обогащением ПТМ, содержащим протеолитические пептиды, или же путем анализа нетронутых белков. В прямом сравнении с серийным обогащением ацетилирования и succinylation, эффективность методологии одного горшка была установлена как очень похожая14. Эти альтернативные протоколы требуют значительного количества исходного материала и времени и могут быть непомерно дорогими. В отличие от этого, протокол с одним горшком предоставляет недорогой и эффективный метод обогащения более чем одного PTM с последующим анализом и идентификацией.

Мышь ткани печени получены из SIRT5 нокаут мышей и используются здесь в качестве исходного материала. Этот протокол также может быть выполнен для лисатов белка из различных тканей или экспериментов клеточной культуры. Этот протокол может быть применен к белкам lysates, полученных из тканей или клеточной культуры гранул.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты, описанные в протоколе, следуют руководящим принципам Институционального комитета по исследованию животных Института Бака.

1. Извлечение белка из гомогенизированной ткани и пищеварение с протеазой

  1. Свежеприготовьте буфер лисиса к конечной концентрации 8 М мочевины, 50 мм триэтиламмония бикарбоната (TEAB), 1 мкм трихостатин A (TSA), 20 мМ никотинамид, 75 мМ хлорид натрия (NaCl), 1x протеаз/фосфатазный коктейль-ингибитор (PICPLC) с h-grade.
  2. Добавьте одну стерильную стальную бисора в трубку 2 мл, совместимую с гомогенизатором мельницы из биса, затем поместите кусок ткани (размером с горох) в трубку. Добавьте буфер лисиса (500 л) и вихрь кратко, чтобы обеспечить буфер охватывает кусок ткани (добавить больше буфера лисиса, если это необходимо). Поместите трубки на предварительно охлажденные наборы адаптеров, гарантируя, что трубы сбалансированы между двумя адаптерами гомогенизатора.
  3. Гомогенизировать образцы 2x при 25 Гц в течение 3 мин каждый при 4 градусах Цельсия. Если ткань не полностью однородна, спина труб кратко и передать гомогенизированный лизат в свежемаркированной 1,5 мл трубки. Затем добавьте дополнительный буфер лизиса к оставшейся части ткани и повторите гомогенизацию 2x при 25 Гц в течение 3 мин каждый. Два раунда гомогенизации, как правило, достаточно, чтобы разбить ткани.
  4. Удалите металлический бисер с помощью пинцета. В период между каждым образцом, промыть пинцет с HPLC-класса воды, HPLC-класса метанола, и HPLC класса воды снова.
  5. Объедините гомогенизированные лизаты, если были применены два раунда гомогенизации, и снотворное образцы с ультразвуковым для 10 циклов при 30 с на/30 с и 4 кс на высокой мощности.
  6. Центрифуги гомогенизированных лизата при 14000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы очистить лизат. Перенесите супернатант (очищенный лизат) в новую микроцентрифуговую трубку объемом 1,5 мл, избегая любого жирового слоя, который может находиться на верхней части супернатанта, и любого мусора в нижней части трубки.
  7. Выполните анализ бисинкониновой кислоты (BCA) для измерения концентрации белка очищенного лизата при правильном разбавлении (например, 1:20 и/или 1:200). Согласно результатам BCA, aliquot 1 мг белка из каждого образца.
  8. Уменьшите белки в дитиотрейтол 4,5 мм (ДТТ) при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин с возбуждением при 1400 об/мин. Впоследствии, алкилировать белки в 10 мм йодоацетамид (IAA) с инкубации в темноте (место в ящике или шкафу) при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо IAA могут использоваться альтернативные реагенты, такие как N-этилмалеймид (NEM).
  9. Добавьте 50 мМ TEAB в образцы, чтобы разбавить концентрацию мочевины до уровня ниже 2 М. Пятно 1 л образца на бумагу рН, чтобы обеспечить рН разбавленного образца между 7,0-8,5. Добавьте трипсин к каждому образцу в соотношении 1:50 (трипсин к белку, wt/wt) и переварить белок с возбуждением при 37 градусах Цельсия в одночасье (около 14-16 ч).
  10. Утолить дайджесты с 10% формовой кислоты, чтобы достичь 1% для меновой кислоты на следующий день. Вихрь и спина кратко. Пятно 1 Зл и образца на полоски рН, чтобы обеспечить дайджест рН 2-3. Образцы центрифуги при 1800 х г в течение 15 мин на RT, чтобы гранулы любого нерастворимого материала.

2. Дезалостивание необогащенных протеолитических пептидов с помощью крупномасштабной твердой фазы экстракции

  1. Получить картриджи, содержащие C18 мизины, которые могут связывать до 10 мг белка. Приспособите эти картриджи в вакуумный аппарат для использования вакуумного всасывания, который может тянуть жидкость через картридж во время каждого из следующих шагов. Назначьте один картридж для каждого пептидного образца.
  2. Добавьте 800 л 80% ацетонитрила (ACN) в 0,2% для модной кислоты к картриджам с 19,8% воды и используйте вакуумный всасывание, чтобы вытащить жидкость. Повторите этот шаг 1x, избегая сушки картриджей полностью.
  3. Уравновешивать картриджи, добавляя 800 л 0,2% formic кислоты в воде с вакуумным всасыванием, чтобы вытащить весь объем через фильтр. Повторите это 2x. Загрузите пептиды на картриджи с вакуумным всасыванием. Вымойте пептиды 2x с 800 л 0,2% для модной кислоты в воде под вакуумным всасыванием.
  4. Упорядочить 1,5 мл микроцентрифуговых труб под каждым картриджом, чтобы собрать пептид eluting в заключительном шаге. Под вакуумным всасывающим электоральным пептидами из картриджей, сначала с 800 qL 80% ACN в 0,2% для модной кислоты и 19,8% воды, затем с 400 зл., то же раствор. Высушите опресненные образцы пептида полностью в вакуумном концентраторе (2-3 ч).

3. Одновременное обогащение К-ацетилированных и K-сцицицинилированных пептидов с помощью бисера иммуноаффинити

  1. Притязание высушенных пептидов в 1,4 мл холодного 1x иммуно-сродниообразуя очищаемого буфера (IAP). Вихрь смешать и обеспечить рН в размере 7 евро. Образцы центрифуги при 10 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Может появиться небольшая гранулы.
  2. Установите пептиды в сторону на льду при подготовке антител-бусы. К трубке K-ацетила и трубки K-succinyl антитела бусины суспензии (объем: 100 л шлама на трубку), добавить 1 мл холодного 1x фосфат-буферизированного соливого раствора (PBS) и перемешать путем пипетки. Перенесите все решение на новую трубку 1,5 мл и закрутите в миниатюрной центрифуге 30 с на RT.
  3. Аспирировать PBS, заботясь, чтобы избежать аспирации от любых бусин. Повторите мыть 3x, стирка снова с 1 мл холодного 1x PBS, центрифугирование для 30 с на RT и aspirating от PBS.
  4. Повторно приостановить бисер в около 440 Л Л PBS. Четверть количества бисера в каждой трубке PTM (100 кЛ, предоставляемых производителем) используется для обогащения одного горшка (около 62,5 мкг каждого обездвиженого антитела для обоих к-ацетилов и K-succinyl антитела бисер). Пипетка бусы несколько раз хорошо перемешать. Удалите 100 л ацетил-лизиновых бусиновых бусин и перенесите в одну трубку с 200 наконечниками предсечения, гарантируя, что мастер-микс остается неизменно хорошо смешанным.
  5. Сделайте то же самое с succinyl-лизин антитела бусы, удалив 100 л из succinyl-лизин антитела бусы в трубку для достижения равных частей ацетил-лизин антитела и суцинил-лизин антитела в каждой трубке. Спин вниз на 30 с в миниатюрной центрифуги и аспирированных от средств массовой информации с гель погрузчик отзыв (бусы станут белыми).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая трубка должна иметь аналогичные гранулы биса в нижней части.
  6. Пипетка переплет пептид прямо на промытые бусы. Будьте осторожны, чтобы избежать каких-либо гранул (добавить быстро, чтобы избежать высыхания бисера). Инкубировать пептиды с бисером при 4 градусах Цельсия на ночь с возбуждением.

4. Улавливание пептидов, привязанных к бусинкам антител

  1. Спин пептид образцы на 2000 х г для 30 с при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант, содержащий несвязанные пептиды и сохранить для будущих экспериментов при желании. Добавьте 1 мл холодного 1x буфера IAP к бисеру для мытья и смешивания путем инвертирования 5x. Спин при 2000 х г на 30 с при 4 градусах Цельсия. Призадыхайся от решения IAP и повторите шаг iAP wash 1x в общей сложности на две стирки.
  2. Добавьте 1 мл холодной воды HPLC в бисер и перемешайте, перевернув 5x. Спин при 2000 х г на 30 с при 4 градусах Цельсия. Отвалиотать воду. Повторите шаг мытья воды дважды в общей сложности три моет. Спин дополнительное время на 2000 х г для 30 с при 4 градусах по Цельсию, чтобы собрать любую оставшуюся воду в нижней части трубки. Аспирот от любой дополнительной воды, которые, возможно, собрали с плоским наконечником гель загрузки советы. Будьте осторожны, чтобы избежать аспирации бисера.
  3. Добавьте в бисер 55 кл 0,15% трифтороацетической кислоты в воде. Инкубировать бусы в течение 10 минут на RT в то время как иногда нажав нижней части трубки, чтобы смешать. Спин бисер на RT в течение 30 с в миниатюрной центрифуге. Удалите eluted пептиды и отложите в сторону с помощью плоских наконечником гель-загрузки отзыв.
  4. Добавьте в бисер 45 qL 0,15% трифтороацетической кислоты в воде. Инкубировать в течение 10 минут на RT при нажатии нижней части трубки время от времени смешивать. Спин бисер на RT в течение 30 с в миниатюрной центрифуге. Удалите вторую элютацию с помощью плоского наконечником геля-загрузки наконечника и в сочетании с первым elution.
  5. Спин комбинированных eluted пептиды на 12000 х г в течение 5 мин на RT, чтобы гранулы любые бусы, которые переносят. Перенесите образец пептидов в новую трубку мощностью 500 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

5. Дезайлирование обогащенных пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: рН образцов должен быть меньше 4 для оптимального привязки к кончику, содержащему c18 мизины. Используйте 10-й пипетки, содержащий 0,6 л из си-18 йодры и 10-ю пипетку для управления наконечником.

  1. Предварительно смочите наконечник C18, врезавшись в кончик 10 зла ацетонитрила. Распределите ацетонитрил в отходы. Повторите этот шаг еще два раза.
  2. Уравновесить кончик, промыв 3x с 10 Л л 0,2% для модной кислоты в воде. Распределять раствор в отходы после каждого равновесия.
  3. Загрузите пептиды из образца на кончик, непрерывно трубацией и дозированием обогащенного пептида образца кончиком. Пипетка вверх и вниз неоднократно по крайней мере 20x и обойтись оставшийся раствор от кончика.
  4. Вымойте кончик, содержащий связанный пептид с 10 зл и 0,2% на 0,2% для модной кислоты в воде. Распределить раствор в отходы. Повторите этот шаг 9x.
  5. Elute пептиды в новую трубку с использованием 10 ql из элуционного буфера, содержащего 0,2% для модной кислоты, 50% ацетонитрила, и 49,8% воды. Неоднократно пипетка и обойтись 10 л раствора в новой трубке 15x. Повторите этот шаг с дополнительным 10 злитровым буфером elution, неоднократно пайпетируя в ту же трубку, что и предыдущая elution.
  6. Сухие пептиды полностью в вакуумном концентраторе (примерно 20 мин). Приостанавливать высушенные пептиды в соответствующем объеме 0,2% для модной кислоты в воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

6. Получение данных с использованием DDA и DIA

ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте образцы с помощью методов DDA и DIA LC-MS/MS, которые могут быть скорректированы в зависимости от имеющегося масс-спектрометрического инструмента. Здесь были проанализированы образцы с помощью системы nano-LC 2D HPLC в сочетании с масс-спектротером высокого разрешения.

  1. Используйте систему HPLC в сочетании с системой HPLC на основе чипа, непосредственно подключенной к масс-спектрометру (многие конфигурации и системы LC-MS также могут быть использованы).
  2. Анализ образцов с использованием обратной фазы HPLC-ESI-MS/MS
    1. После инъекции, перенесите пептидные смеси на чип C18 предварительноколонной и опресните пептиды путем мытья с мобильной фазой А при 2 л/мин в течение 10 мин. Затем перенесите пептиды в аналитическую колонку и выщелачивайте со скоростью потока 300 нл/мин с градиентом 2-3 ч с использованием мобильных фаз A и B. В частности, используйте линейный градиент от 5% мобильной фазы B до 35% мобильной фазы B в течение 80 мин.
    2. Впоследствии, пандус мобильной фазы B до 80% в течение 5 минут, а затем провести на 80% B в течение 8 минут, прежде чем вернуться к 5% B для 25 мин повторного равновесия.
  3. Создайте метод MS-инструмента для DDA и определите следующие эксперименты по сканированию приборов
    1. Эксперимент 1: ионное сканирование прекурсора MS1 от м/з 400-1500 (время накопления 250 мс). Установите порог интенсивности, чтобы вызвать MS/MS сканирование для ионов заряда состояния 2-5 до 200 пунктов. Установите динамическое исключение ионов прекурсоров до 60 с.
    2. Эксперимент 2: ионное сканирование продукта MS/MS с диапазоном сканирования MS2 от м/з 100-1500 (время накопления 100 мс на каждый 30-продуктовое ионное сканирование за цикл). Установите энергию столкновения, распространяемую на КЕС No 5, а затем выберитережим ионного сканирования продукта высокой чувствительности»...
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод DDA приобретет спектры MS/MS для 30 наиболее распространенных ионов прекурсоров после каждого сканирования MS1 обследования за цикл, а общее время цикла составит 3,3 с. Приобретения DDA будут использованы для создания спектральных библиотек, как описано в разделе 7.
  4. Создание метода MS-инструмента для DIA и определение следующих экспериментов по сканированию приборов.
    1. Эксперимент 1: выполнить MS1 ионное сканирование от м / z 400-1,250 (время накопления 250 мс).
    2. Эксперимент 2: выполнить MS/ MS ионносного сканирования для 64 переменных сегментов SWATH с MS2 диапазона сканирования от м / z 100-1500 (время накопления 45 мс на каждый 64-продукт ионного сканирования за цикл). Установите энергию столкновения, распространяемую на КЕС No 10, а затем выберитережим ионного сканирования продукта высокой чувствительности".
    3. Используйте стратегию приобретения 64 переменного окна DIA/SWATH, описанную Schilling et al.22, чтобы получить количественную оценку без маркировки с общим временем цикла в 3,2 с. Кратко, в этом приобретении, вместо quadrupole No 1, передающего узкий диапазон массы до ячейки столкновения, более широкое окно переменной ширины окна (5 -90 м/з) передается в постепенных шагах по всему диапазону массы (м/з 400 -1,250 с 64 сегментами SWATH, каждый с 45 мс накопления времени, что дает время цикла 3.2 s, который включает в себя один с 250 мс время накопления).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переменная ширина окна регулируется в зависимости от сложности типичного ионного тока MS1, наблюдаемого в пределах определенного диапазона м/з с использованием алгоритма переменного калькулятора22 (более узкие окна выбираются в диапазонах "занятых" м/з, широкие окна в диапазонах м/з с несколькими ионами прекурсоров). На других платформах ИНСТРУМЕНТОв MS могут быть реализованы другие стратегии окна DIA.

7. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые настройки анализа данных должны быть изменены и адаптированы к конкретному эксперименту. Например, выбранная база данных белков (файл FASTA) зависит от вида, из которого был подготовлен образец (здесь, Mus musculus). Ниже описан анализ данных образцов мыши, обогащенных для ацетилированных и лаконитных пептидов.

  1. Используйте поисковую систему MS для анализа приобретений DDA. Создайте метод поиска базы данных следующим образом:
    1. Для параметров описания образца: выберите "Идентификацию"по типу образца, выберите "Iodoacetic Acid"под "Cysteine Alkylation", выберите "Трипсин"под "Digestion" (при условии c-терминального расщепления на лизине и аргинине), выберите "TripleTOF 6600" под инструментом, под специальными факторами, проверить акциляцию имускусию.
    2. Для конкретных параметров обработки: выберите "Биологические модификации"под ID Focus, выберите "SwissProt"под базой данных, проверьте "Thorough ID"под поиском, выберите "0,05 (10%)" под "Обнаруженный порог белка", ипроверьте "Запуск ложного анализа скорости обнаружения"под "Качество результатов". Сохранить метод поисковой системы и представить масс-спектрометрические необработанные файлы для обработки в поисковой системе базы данных с помощью сгенерированного метода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В итеративном процессе все сканирование MS и MS/MS/MS автоматически перенастраивается поисковой системой на основе первоначальных аннотаций и результатов.
  2. Нажмите на кнопку"Экспорт пептид Резюме"по завершении поиска и фильтрации всех результатов идентификации пептида на "порог доверия" 99 в электронной таблице программного обеспечения (например, Excel; ложные коэффициент обнаружения (FDR) 1%).
  3. В файле таблицы«Пептид Резюме»фильтр для всех пептидов, содержащих аннотацию PTM «ацетилирование» и «succinylation» в колонке модификации, чтобы создать отчет о результатах, чтобы представить исключительно ацилатированные пептиды и соответствующие белки.
  4. Чтобы построить спектральные библиотеки MS/MS для дальнейшей обработки необработанного файла DIA и дальнейшей относительной количественной оценки, откройте программное обеспечение для количественного анализа DIA. Выберите вкладку«Библиотека»,затем (в нижней части страницы) нажмите «Generate Spectral Library» из поисковойсистемы базы данныхи откройте отчет ОБаза поиска FDR (файл FDR.xlsx), который был автоматически сгенерирован как часть процесса поиска исходной базы данных DDA. Затем щелкните «next» и выберите «LibrarySettings Schema» и «следующий». Выберите"Uniprot_mouse_proteome"в качестве базы данных, затем нажмите "следующий" и "goa_mouse" как аннотация гена (онтология) файл. Наконец, нажмите"закончить",и спектральная библиотека будет создана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Информация о ацетилированных и succinylated пептидов из theDDA необработанных файлов данных, предшественник ионных сканирований от MS1, и фрагментир ионных сканирований от MS2 будут включены в спектральные библиотеки (это включает время хранения, MS / MS фрагментации шаблон и т.д.).
  5. Используйте программное обеспечение для количественного анализа ПРОЕмомики DIA для выполнения относительной количественной оценки уровней ацетилирования и сучинки и создания электронных таблиц кандидатских ПЕПтидов, содержащих PTM, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа данных.
    1. Для анализа и количественной оценки ПЕПтиды, содержащие PTM, открывают программное обеспечение для количественного анализа DIA, используйте схему анализа шаблонов. Схема шаблона доступна в программном обеспечении, выбрав опцию«Перспективы настроек» «АНАЛИЗ ДИА» "BGS PTMs" (значительные или редкие, в зависимости от эксперимента).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо использования шаблона анализа BGS PTM в программном обеспечении для количественного анализа DIA, все настройки PTM-специфических также могут быть настроены вручную в соответствии с этими инструкциями: 1) под«идентификацией»,выберите «локализацию PTM» (probability cutoff ) 0,75;; 2) в «количественнойоценке «, выберите «незначительную пептидную группировку» "измененная последовательность"; и 3) под «post-analysis«, выберите «дифференциальную группировку изобилия« "минорная группа"(параметры количественной оценки). Эти настройки активируют функцию локализации PTM, так что модифицированные пептиды перечислены как отдельные записи и дифференциальный анализ выполняется на уровне пептида.
    2. Чтобы начать анализ количественных данных, выберите вкладку«Pipeline», затем нажмите кнопку«Наймите анализ DIA из файла»,откройте необработанные файлы MS DIA, представляющие интерес для относительной количественной оценки. Выберите «Присвоите Спектральную библиотеку» и выберите библиотеку, которая была построена выше, щелкните «нагрузка» "следующий". Выберите схему анализаBGS PTMsи нажмитекнопку «Следующий». Выберите соответствующую базу данных FASTA файл "Uniprot_mouse_proteome" "следующий". Определите настройку состояния, которая присваивает различные условия образцам, и нажмите«следующий». Выберите "goa_mouse" в качестве генной аннотации (онтологии) файл и нажмите "следующий". Просмотрите обзор анализа (резюме настройки эксперимента) и выберите "каталог выходов" "закончить". Наконец, нажмите кнопку«Запуск трубопровода»,чтобы выполнить количественный анализ без маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Статистические модули в DIA Количественный анализ программного обеспечения автоматически выполнять анализ ФДР, генерировать тепловые карты и вулкан участков сравнения различных условий, генерировать списки выявленных и количественных пептидов и белков, а также обеспечить Значения наряду с относительными изменениями складок, сравнивая различные условия.
  6. В качестве альтернативы используйте программное обеспечение для удаления наборов данных DIA для обработки данных и проведения статистического анализа после экспорта извлеченных пиковых областей для сайтов ацетилляции и сучинки.

8. Визуализация данных модифицированных пептидов и оценка локализации участка ПТМ

  1. Чтобы открыть сгенерированный DIA Количественный Анализ, выберите вкладку«Анализ»,за которой следует«загрузите программный эксперимент количественного анализа»(от сохраненного эксперимента, открываемого в .. Файл SNE). Перейдите к q. SNE результаты файл а также выбрать "открыть".
  2. В левой панели, нажмите на стрелку слева от третьего необработанных данных файла s.wiff сверху, чтобы расширить и визуализировать все 64 сегмента SWATH. Нажмите на стрелку слева от сегмента (428.7-437.3), чтобы расширить определенный сегмент и отобразить модифицированные пептиды, идентифицированные для этого массового диапазона. Нажмите на тройной заряженный пептид КЗИГЭФЭК.Ацетил-Р.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию, правая верхняя панель обычно отображает MS2 XIC, а нижняя панель отображает MS1 изотопный конверт XIC
    1. В верхней панели выберите "PTM Локализация Участок". В нижней панели выберите "PTM Локализация Участок".
    2. В участке локализации PTM выберите верхнюю пептидную последовательность «K'YGEAFEK»Acetyl'R,, с общим баллом локализации PTM 18.32. Нажмите на стрелку слева, чтобы расширить представление и визуализировать подтверждающие и опровергающих ионы. Нажмите на стрелку рядом с«Подтверждением Ионов», затем выберите ион «y3 »42»для выделения этого конкретного иона, что подтверждает, что место ацетилирования расположено на K2 пептидной последовательности.
    3. В участке локализации PTM выберите вторую пептидную последовательность «K'Acetyl'YGEAFEKR» с общим (очень низким) баллом локализации PTM 1. Нажмите на стрелку слева, чтобы расширить представление и визуализировать подтверждающие и опровергающих ионы. Нажмите на стрелку рядом с"Подтверждение Ионов", затем на стрелке рядом с "Опровержение Ионов", а затем выберите некоторые фрагменты ионов для визуализации и оценки извлеченных ионных хроматограммы и MS / MS спектра (Рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Назначенный PTM Оценка локализации и визуальный осмотр указывают на то, что правильным изомером PTM является КЗиГЕФАФЕК-Ацетил-Р, в то время как нет или минимальных доказательств, не существует для других возможных PTM изомер КЗЦетил-ЗИГЕАФЕКР.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показана общая схема рабочего процесса, включая сбор ткани из печени мыши, использование 1 мг белка для переваривания белка лизата с трипсином, инкубации пептидов с антител-конъюгированными бусинами, приобретение образцов на MS, и, наконец, выполнение DIA/SWATH анализа данных с использованием различных количественных пакетов программного обеспечения протеимики (академических и коммерческих).

На рисунке 2А показано, как указаны сроки рабочего процесса и требуемые количества образцов и белка по сравнению с альтернативными методами, которые в настоящее время используются для многофункциональных исследований по обогащению ПТМ. Метод «одного горшка» может быть выполнен в два раза меньше времени и с половиной количества образцов, как эти альтернативные методы. По сравнению с двумя методами обогащения с одним PTM, протокол с одним горшком также требует половины количества белка.

Этот протокол был продемонстрирован в качестве осуществимой и экономически эффективной альтернативы. На рисунке 2B показано, что средний коэффициент вариации (CV) для модифицированных пептидных областей был ниже в методе одного горшка, чем в одно-PTM и серийном PTM обогащении. Рисунок 2C,D показывает, что при сравнении методов PTM и одного PTM-обогащения не было выявлено никаких заметных различий между корреляциями количественных данных на уровне сайта для двух модификаций. Это относится также к корреляциям пептидного уровня и уровня фрагментов. Одно и то же наблюдение проводилось для всех трех корреляций при сравнении обогащения одного горшка и серийного ПТМ. Все базовые данные MS и обработанные листы результатов Excel, связанные с недавним отчетом Basisty et al.14, доступны и могут быть загружены из MassIVE (MSV00081906) и ProteomeXchange (PXD008640).

В целом, в то время как стратегии обогащения антител могут показать определенные ограничения, такие как потенциальный окклюзия эпитопа или ограниченная специфичность, антитела, используемые в этом исследовании, являются смесями независимо генерируемых клонов и, таким образом, обеспечивают более широкие диапазоны Особенности.

Экспериментальные результаты документируют возможность обнаружения и оценки перекрестного разговора PTM. Рисунок 3 отображает данные от успешного обогащения и иллюстрирует пример пептида, содержащего несколько и различные изменения ацила, визуализирующие перекрестный разговор PTM. На рисунке 3А показан пептид, который ацетилируется на одном остатке лизинина и лаконичен с другой, а на рисунке 3B показан один и тот же пептид, который утилицируется на обоих лизинах. Это свидетельствует о том, что один и тот же остаток лизина может быть изменен с обеих групп акилиации, и есть возможность перекрестного разговора, происходящих на этом сайте. На рисунке 4 отображается количество остатков лизина, которые были определены как описано в разделах 7.1-7.3 для выполнения обеих модификаций, также указывая на возможный перекрестный разговор PTM.

Как показано на рисунке 5, обработка наборов данных DIA PTM с помощью программного обеспечения количественной протеомики позволяет нам определить, какие конкретные остатки лизинмода модифицируются. Это концепция, известная как локализация сайта, которая является важным шагом для любого анализа для определения возможного перекрестного разговора PTM. На рисунке 5 показаны две потенциальные изоформы наряду с подтверждающими и опровергающих ионами для каждого из них, которые могут быть визуализированы и оценены как описано в разделах 8.1-8.3 (конкретно шаги 8.3.2 и 8.3.3). Основываясь на этой информации, мы смогли с уверенностью определить, какая из двух изоформ присутствовала в первоначальном образце. Спектр MS/MS подтвержденного изоформа K'YGEAFEKacR ясно демонстрирует, что ионы y (y2-y5),содержащие остатки ацетилированного лизина, которые сместились на 42 м/з (приращенная масса ацетиловой группы), подтвердили специфические остатки лизины в пептидном модификации, который был обнаружен.

figure-results-1
Рисунок 1: Типичный рабочий процесс для обогащения ПТМ на один горшок. Ткань (здесь, печень) собирают из SIRT5 KO и диких мышей типа (WT), а белки лисицируются, перевариваются в пептиды и опресняются. Пептиды затем обогащаются иммуноаффинити с комбинациями succinyl- и ацетил-антитела бусин. Параллельные рабочие процессы MS измеряют как 1) небольшие алиquots из цельного изменения экспрессии белка лизата (для нормализации белка) и 2) обогащенные ацилсодержащие пептиды для идентификации участка акиляции (DDA-MS) и локализации участка, за которыми следует количественная оценка (DIA-MS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Сравнение рабочего процесса с одним горшком с альтернативными методами. ()Сравнение времени, затрат и материалов, необходимых для одного горшка рабочего процесса, серийного обогащения PTM, и два одно-PTM обогащения. (B) Сравнение резюме между одним горшком рабочего процесса, одного обогащения ацетил-лизин PTM, и одного succinyl-лизин PTM обогащения. Анализ корреляции Spearman сравнивая пиковые области ацила пептида, полученные из рабочего процесса одного горшка, и одно-PTM обогащения: соответствующие участки log2 пиковой области результаты для (C) ацетилирования сайтов и (D) succinylation сайтов. Регрессионные наклоны и корреляционные факторы указаны в отдельных панелях14. Для каждого из условий было обработано две независимые биологические репликации. Эта цифра была изменена с Basisty et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Перекрестный разговор между ацетилированием и изменениями синцинилации остатков лизина. MS / MS спектры триптических пептидов из митохондриальных 3-кетоацил-КоА тиолазы, которые показывают ту же последовательность аминокислот, но были изменены на двух остатков лизина с различными ПТМ. (A) MS/MS пептида AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK и (B) MS/MS пептида AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Эта цифра была изменена с Basisty et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Перекрытие и перекрестный разговор между ацетилированными и лаконилатыми остатками лизин-специфических примеров в белковых комплексах. (A) Диаграмма Венна отображение перекрытия между 2235 ацетилации и 2173 succinylation сайтов. Из них 943 участка были как ацетилированными, так и слажен. Печень из SIRT5 (де-succinylase) нокаут мыши был проанализирован, и многие сайты succinylation были определены. В самом деле, они были более обильными, чем обычно наблюдается в печени мыши (модифицированные пептиды были отфильтрочены по цене й lt;0.05). (B) Белковые комплексы, показывающие процент их субъединиц, содержащих как ацетилированные, так и succinylated сайты (смелый красная линия представляет значение, как это определено точным тестом Фишера). (C) Диаграмма комплекса синтаза АТФ: белковые субъединицы в красном цвете изображают субъединицы, которые содержат как ацетилированные, так и succinylated сайты. Эта цифра была изменена с Basisty et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Программное обеспечение количественной протеомики расшифровывает локализацию пептидного участка ПТМ. На основе MS/MS фрагментации пептида, можно предоставить информацию о конкретных остатков лизина ацетил группы изменяется. Это демонстрирует способность программного обеспечения предлагать ценную информацию о локализации сайта PTMs. (A) Две возможности модификации остатков лизина и локализации сайта PTM: K'YGEAFEKacR (слева) и KacYGEAFEKR (справа). Для каждого потенциального участка показаны "подтверждающие" и "опровержения" ионы фрагментов. На основе этой информации назначаются подтверждающие оценки и опровержения, подтверждающие наличие в образце изоформы КЗИГЕАФЕКакР. (B)СПЕКТР MS/MS, соответствующий подтвержденной изоформе КЗИГЕАФЕKacR, указывающий на то, что все ионы y, включая остатки ацетилированных лизиновых отложений (y2 и выше) несут приращение массой 42 м/з, что соответствует ацетиловой модификации. Наблюдаемые ионы b не содержат модификации. (C) Извлеченная хроматограмма иона (XIC) с обильными пиковыми участками в результате у2 и у3 ионов, оба из которых составляют место ацетилирования в подтвержденном изоформе КЗИГЕАФЕКакР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает новый метод для одновременного многократного обогащения PTM, чтобы более эффективно понять перекрестный разговор PTM. Альтернативные методы достижения этой цели, как правило, непомерно отнимают много времени и дорого, и они требуют большого количества белка, чтобы быть успешным11,13. Этот протокол представляет собой многофункциональный рабочий процесс по обогащению ПТМ, который включает в себя инкубацию в антителах- конъюгированных бусин сразу для двух ПТМ для повышения общей эффективности эксперимента. Этот метод также включает в себя использование DDA для генерации спектральной библиотеки и DIA MS приобретений для обнаружения и количественной оценки пептидов настоящее время с уменьшенным помехи от фрагментов ионов22,23. Программные программы, такие как движки поиска баз данных MS, используются для анализа и количественной оценки данных, полученных в результате приобретений DDA, в то время как количественное программное обеспечение ProteomicsSoftware 24 и специфическое программное обеспечение для количественного анализа DIA25 необходимы для интерпретации сложных спектров, производимых приобретениями DIA.

В этом протоколе есть несколько важных шагов, которым следует внимательно следовать. Поскольку основной целью протокола является обогащение для нескольких ПТМ одновременно, шаг по обогащению антител-сродства (раздел 2) имеет решающее значение для успеха эксперимента. При выполнении стихов на бисере необходимо обеспечить, чтобы ни один из бисера не аспирированы случайно. Обеспечение концентрации мочевины была разбавлена до 1 М до пищеварения с трипсина (шаг 1.8) также необходимо. Хотя 8 M мочевины требуется ранее в протоколе для растворимости белка, концентрации мочевины выше 1 М будет препятствовать ферментативной активности трипсина. Кроме того, важно последовательно проверять рН образца на протяжении всего протокола. Это особенно важно до пищеварения. Если рН образца и раствор трипсина не нейтрализуются надлежащим образом до инкубации, это может привести к неэффективному пищеварению, в результате чего многие участки расщепления могут быть пропущены, что приведет к меньшему количеству пептидных идентификаций.

Несколько изменений в протоколе могут быть полезны при подготовке образцов. Для белка лисат закуплено от 1 мг исходного материала, четверть бусин антител, предусмотренных в каждой трубке сканирования PTM может быть использован в качестве экономически эффективной альтернативы. Большее количество исходного материала может быть использовано для улучшения результатов, до тех пор, как количество антител бисера используются пропорционально. Еще одна модификация, которая может повысить рабочий процесс, чтобы переварить образцы с другой протеазой в дополнение к трипсин. Эта модификация приведет к большей изменчивости пептидов расщепляется, обеспечивая более широкий охват остатков белка. Хотя это и не обязательно, рекомендуется, чтобы трипсин быть одним из ферментов, используемых для анализа PTM из-за его высокой специфичности расщепления26.

Ограничение этого протокола заключается в том, что изучаемые ПТМ должны иметь аналогичные химии для того, чтобы обогащаться одновременно14. Процедуры для различных антител-конъюгированных шариков должны быть аналогичными, используя аналогичные растворители и решения, в том числе аналогичные условия elution, и предпочтительно от того же поставщика. По этой причине, метод, изложенный здесь последовательно использует ацетилирование и succinylation в качестве примера, оба из которых используют антитела конъюгированные бусы (Cell Signaling Technology, Inc). Хотя теоретически этот метод может применяться к любому числу ПТМ, потребуются дополнительные исследования для оценки точного ограничения протокола в этом отношении. Кроме того, поскольку это метод обогащения на основе антител, метод может обеспечить только относительную количественную оценку участков ПТМ.

По сравнению с существующими методами обогащения мультиПТМ этот рабочий процесс является более осуществимой и экономически эффективной альтернативой. В ходе этого эксперимента было отмечено, что эффективность этого метода очень хорошо сопоставляется с альтернативными методами, такими как индивидуальное или серийное обогащение. На рисунке 2B показано, что среднее резюме для модифицированных пептидных пиковых зон было фактически уменьшено в методе одного горшка по сравнению с одно-PTM обогащения и серийных PTM обогащения13. Мы также проанализировали экспериментальные результаты оценки количественных показаний на уровне сайта для ацетилирования или сучинки. Кроме того, анализ корреляции Спирмана(рисунок 2C,D) показал, что обогащение PTM-одного горшка выполнено аналогично рабочим процессам по обогащению одного PTM. Это также относится к корреляциям пептид- и фрагментов. Одно и то же наблюдение проводилось для всех трех корреляций при сравнении одного горшка с серийным обогащением PTM.

Этот протокол позволяет исследователям сделать увлекательное биологическое понимание перекрестного разговора PTM быстрым и экономически эффективным образом. Компонент DIA рабочего процесса позволяет исследователям понять больше о PTMs, так как он предоставляет информацию о локализации сайта и преодолевает такие проблемы, как низкая заполняемость места PTMs. Ионы прекурсоров, как правило, исключаются с DDA, что особенно важно при изучении PTMs, так как заполняемость сайта часто низка до такой степени, что эти пептиды не выбираются для MS/MS, но все еще содержат важную информацию. Последующие эксперименты могут быть проведены для оценки верхнего предела, сколько ПТМ могут быть обогащены одновременно с помощью этого метода. Будущее улучшение этого рабочего процесса может включать в себя разработку более продвинутых программных платформ для дальнейшей автоматизации анализа локализации сайта и заполняемости сайта PTM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем поддержку со стороны NIH общий инструментальный грант для системы TripleTOF в Институте Бака (1S10 OD016281). Эта работа была также поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (R01 AI108255 до B.S.) и Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и почек (R24 DK085610 Эрику Вердину; R01 DK090242 Эрику Гетцману). X.X. была поддержана грантом от Национальных институтов здравоохранения (NIH грант T32GM8806, Джудит Кампизи и Лиза Эллерби), Н.Б. была поддержана постдокторской стипендией от Фонда Гленн для медицинских исследований.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M биокарбонатный буфер триэтиламмония (TEAB)Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАT7408
Ацетонитрил, Burdick and Jackson LC-MS gradeBurdick and Jackson, Muskegon, MI, США36XL66
Bioruptor sonicatorDiagenode, Денвилл, Нью-Джерси, СШАB01020001
C18 предколоночный чип (200 µ m x 6 мм Чип ChromXP C18-CL, 3 мкм, 120 А)SCIEX, Фрамингем, Массачусетс, США5015841
чип C18-CL (75 & микро; m x 15 см ChromXP, 3 & микро; м, 300 & Аринг;)SCIEX, Фрамингем, Массачусетс, США804-00001
Дитиотреитол (DTT)Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАD9779-5G
Термомиксер Eppendorf CompactEppendorf AG, Гамбург, ГерманияT1317-1EA
Eppendorf Tube (2,0 мл Safelock)Eppendorf AG, Гамбург, Германия22363352
Муравьиная кислотаSigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАF0507-500ML
Стандарт пептида нормализации с индексированным временем удержания (iRT)Biognosys AG, Шлирен, Цюрих, ШвейцарияKi-3002-2
Йодоацетамид (IAA)Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАI1149-25G
mapDIAпрограммное обеспечение для веб-ссылки для устранения помех наборов данных DIA
Метанол, Бурдик и Джексон LC-MS сортБердик и Джексон, Маскегон, Мичиган, СШАBJLC230-4
PURELAB flex 1 диспенсер для сверхчистой водыVWR International, Раднор, Пенсильвания, США89204-088
mProphet в Skylineвключен в Skylineинтегрированные статистические алгоритмы для оценки FDR
Oasis HLB SPE картриджиWaters Corp., Милфорд, Массачусетс, СШАкартриджи WAT094225для обессоливания белковых лизатов, материал до 50 мг
Фосфатно-солевой буферный растворLife Technologies10010023
Pierce BCA AssayThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США23225
ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine'SCIEX, Framingham, MA, СШАпрограммное обеспечение скачать SCIEXMS database search engine
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764Cell Signaling Технология13764Бусины антител для обогащения аффинности
PTMScan Ацетил-Лизин Мотив [Ac-K] Набор #13416Технология клеточной сигнализации13416бусины антител для обогащения аффинности
Секвенирование лиофилизированный трипсинLife Technologies23225
Skyline - 'Программное обеспечение для количественной протеомики'ЛабораторияMacCoss (академический)программное обеспечениес открытым исходным кодомПрограммное обеспечение для количественной протеомики (академическое)
Spectronaut - 'Программное обеспечение для количественного анализаDIA'Biognosys AG, Шлирен, Цюрих, ШвейцарияSW-3001Программное обеспечение для количественного анализа DIA / локализация сайта PTM
Thermo Scientific Savant SPD131DDA концентратор SpeedvacThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, СШАSPD131DDA-115инструмент для концентрирования жидкого объема образцов
TissueLyser IIQiagen, Hilden, Германия85300прибор для эффективного лизиса ткани
Трифторуксусная кислота (TFA)Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАT6508-1L
TripleTOF 6600: ортоганоловый квадрупольный времяпролетный (QqTOF)масс-спектрометрSCIEX, Фрамингем, Массачусетс, СШАПо цитатемасс-спектрометр высокого разрешения
Ultra Plus nano-LC 2D системаВЭЖХSCIEX, Eksigent Division, Фрамингем, Массачусетс, СШАхроматографической сепарациимодели #845
UreaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, СШАPI29700
Water, Burdick and Jackson LC-MSBurdick and Jackson, Muskegon, MI, США600-30-76
ZipTip C18 Pipette Tips, P10Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRLZTC18S096Наконечники C-18 с нагрузкой на смолу для обессоливания пептидных смесей
Система

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604(2019).">Christensen, D. G., et al. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604(2019).
  2. Post-translational modifications in signal integration. Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).">Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. Post-translational modifications in signal integration. Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).
  3. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).">Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).
  4. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).">Swaney, D. L., et al. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).
  5. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).">Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).
  6. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).">Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).
  7. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).">Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  8. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).">Mocciaro, A., Rape, M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).
  9. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).">Lopez-Otin, C., Hunter, T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).
  10. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).">Du, Z., et al. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).
  11. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).">McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).
  12. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).">Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).
  13. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).">Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).
  14. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123(2018).">Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123(2018).
  15. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).">Wang, G., et al. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).
  16. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).">Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  17. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).">Rardin, M. J., et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).
  18. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).">Rardin, M. J., et al. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).
  19. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).">Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).
  20. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).">Sadhukhan, S., et al. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).
  21. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291(2017).">Collins, B. C., et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291(2017).
  22. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).">Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
  23. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).">Meyer, J. G., Schilling, B. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).
  24. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).">MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  25. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).">Sticker, A., Martens, L., Clement, L. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).
  26. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).">Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Post Translational ModificationsSimultaneous EnrichmentAcetylation SuccinylationData Independent AcquisitionMass SpectrometryAntibody BeadsPeptide ElutionSite LocalizationPTM CrosstalkMouse Liver Lysate

Related Articles