Методическая статья

Подготовка белка Производство синтетических клеток с использованием клеток бесплатные бактериальные экстракты, липосомы и эмульсии передачи

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 апреля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод, материалы, оборудование и шаги для подготовки РНК и белка, производящих синтетические клетки. Внутренний водный отсек синтетических клеток содержал бактериальный лизат S30, инкапсулированный в липидный двухслойный (т.е. стабильные липосомы), используя метод переноса эмульсии воды в масле.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подход снизу вверх для сборки синтетических клеток является эффективным инструментом для изоляции и исследования клеточных процессов в клеточной среде. Кроме того, развитие систем самовыражения без клеток продемонстрировало способность к восстановлению производства белков, транскрипции и процессов перевода (ДНК-РНК-белок) контролируемым образом, используя синтетическую биологию. Здесь мы описываем протокол для подготовки системы свободного выражения клеток, в том числе производство мощного бактериального лизата и инкапсуляции этого лизата внутри богатых холестерином липидов на основе гигантских пузырьков (GUV) (т.е. стабильные липосомы), чтобы сформировать синтетические клетки. Протокол описывает методы подготовки компонентов синтетических клеток, включая производство активных бактериальных лизатов, с последующим детальным поэтапным препаратом синтетических клеток на основе метода переноса эмульсии воды в масле. Они облегчают производство миллионов синтетических клеток в простой и доступной манере с высокой универсальностью для производства различных типов белков. Полученные синтетические клетки могут быть использованы для исследования производства белка/РНК и деятельности в изолированной среде, в направленной эволюции, а также в качестве контролируемой платформы доставки лекарств для производства терапевтических белков внутри организма по требованию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтетические клетки являются искусственными клетками, как частицы, имитирующие одну или несколько функций живой клетки, такие как способность делиться, формировать мембранные взаимодействия, и синтезировать белки на основе генетического кода1,2,3. Синтетические клетки, которые прилагают системы синтеза белка без клеток (CFPS), обладают высокой модульностью из-за их способности производить различные белки и рнковые последовательности после изменений в шаблоне ДНК. Представляя привлекательную альтернативу современным подходам к производству белка, системы CFPS основаны на клеточном лицезе, очищенных компонентах или синтетических компонентах и включают в себя все транскрипции и переводческих механизмов, необходимых для синтеза белка, таких как рибосомы, РНК-полимераза, аминокислоты и источники энергии (например, 3-фосфогцерат7,8,9и аденина трифосфат)4,5,69 , 9 , 9 , 9,9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , Инкапсуляция системы CFPS внутри липидных пузырьков позволяет просто и эффективно производить белки без зависимости от живой клетки10. Кроме того, эта платформа позволяет синтез пептидов, которые могут деградировать внутри естественных клеток, производство белков, которые являются токсичными для живых клеток, и модифицировать белки с неестественными аминокислотами11,12. Синтетические клетки были использованы в качестве модели для исследовательских целей исследования минимальных компонентов клеток, необходимых для обеспечения клеточной жизни с эволюционной точки зрения1,13. Синтетические клетки также были использованы для создания и реализации генетической цепи и в качестве моделей для направленной эволюции14,15,16. Другие исследования были сосредоточены на способности синтетических клеток имитировать биологическую активность естественных клеток, с целью заменить поврежденные естественные клетки, такие как бета-клетки у пациентов с диабетом17. Кроме того, способность этих CFPS инкапсулировать синтетические клетки для производства различных терапевтических белков иллюстрирует его потенциал, чтобы быть включены в клиническое использование18.

Здесь мы описываем протокол лабораторного масштаба снизу вверх(рисунок 1)для производства РНК и белково-производящих синтетических клеток на основе системы CFPS, инкапсулированной в липидной везикуле. Это показывает потенциальное использование синтетических клеточных платформ в качестве новых систем доставки лекарств для производства терапевтического белка препарата in vivo19. Предыдущие исследования исследовали оптимизацию реакции CFPS и процессы подготовки лизата клетки4,,8,,20. Кроме того, некоторые методы были применены для клеточного размера липосомы подготовки, таких как микрофлюидные и полимерной основе капель стабилизации методы21,22,23, которые также отличаются в липидном составе липосомы липосом24,25,26. В представленном протоколе синтетические клетки производятся с использованием метода переноса эмульсии воды в масле, а инкапсуляция осуществляется при низких температурах (Злт; 4 КС)5,,10,,24,,27,28. Эти мягкие условия были признаны благоприятными для сохранения биофункциональной целостности молекулярного механизма, а именно рибосом и белков27,,29,30. Липидный состав частиц состоит как из холестерина, так и из 1-пальмитоила-2-олеойл-сн-глицеро-3-фосфохолина (ПОПК). Первый находится во всех мембранах клеток млекопитающих и имеет важное значение для стабильности, жесткости и проницаемости сокращения мембраны, а последний имитирует млекопитающего фосфолипидного состава11,13. Клеточная транскрипция и перевод молекулярного механизма извлекаются из штамма BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), который преобразуется с pAR1219 плазмид, переэкспрессирующий полимеразу T7 РНК для увеличения потенции CFPS и синтеза белка. Эта система была использована для производства диагностических и терапевтических белков, с молекулярными весами до 66 kDa in vitro и in vivo19,31. Следующий протокол обеспечивает простой и эффективный метод для производства синтетической клеточной системы, который может решить широкий спектр фундаментальных вопросов, связанных с синтезом белка в природе, а также может быть использован для применения наркотиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстрация полного протокола производства синтетических клеток представлена на рисунке 1. В соответствии с потребностями пользователя, выражение белка (раздел 3.2) и синтетическое образование клеток (раздел 4) части протокола также могут осуществляться независимо (с некоторыми адаптациями).

1. Подготовка lysate S30-T7

  1. Полоса пластины E. coli BL21 (DE3) бактерии преобразованы с T7 РНК полимеразы, выражающие pAR1219 плазмид на пластине LB-агар дополнен 50 мкг /мЛ ампициллин для получения отдельных колоний.
  2. Подготовьте стартовое решение: привить одну колонию в 5 мл LB-медиа, дополненную 50 мкг/мл ампициллин в колбе Erlenmeyer 100 мл и расти на ночь с помощью напольного инкубатора шейкера при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию. Подготовка дубликатов.
  3. Прививать каждый 5 мл стартер отдельно в 500 мл ТБ СМИ дополняется 50 мкг /мл ампициллин в 2 L Erlenmeyer колбу с перегородками и выращивать его с помощью напольного инкубатора шейкер на 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию, пока не достигнет ОД600 0,8-1. Периодически отслеживайте с помощью спектрофотометра.
  4. Добавьте 2-3 мл 100 мМ запаса IPTG (для достижения 0,4 - 0,6 мм) для индукции экспрессии Полимеразы РНК T7 и продолжайте расти до тех пор, пока она не достигнет OD600х 4.
  5. Перенесите раствор с каждой колбы Эрленмейера в две стерилизованные центрифуги 250 мл.
  6. Центрифуга каждый на 7000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, бактериальные гранулы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующим шагам.
  7. Повторно приостановить каждый гранулы в 250 мл холодного (4 кВ) S30 lysate буфера и центрифуги на 7000 х г в течение 10 минут при 4 градусах По Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: S30 lysate буфер используется для поддержания стабильности белка после того, как лиза клетки выполняется с помощью гомогенизатора в шаге 1.9. С этого шага вперед все шаги до 1.12 должны выполняться последовательно и быстро.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем перейти к следующему шагу, предварительно охладить советы и 1,5-миллилитровые флаконы, которые будут необходимы для хранения лизата
  8. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановите все гранулы вместе в 15 мл холодного s30 lysate буфера. Фильтр подвески с помощью марлевой площадки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл раствора связано с гомогенизатором мин. объем. Следует отметить, что концентрация бактерий также имеет важное значение.
  9. Гомогенизировать при рабочем давлении 15000 пси, с давлением воздуха 4 бара (два прохода) для поломки клеток. Избегайте разбавления раствора для более концентрированного и активного лизата.
  10. Добавьте 100 л 0,1 М ДТТ (ПРЕСТЕРЕ) на 10 мл гомогенизированной подвески.
  11. Centrifuge подвески на 24700 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
  12. Выполните следующий шаг быстро для сохранения активности лизата: разделить супернатант один за другим на 200 аликотов в предварительно охлажденных флаконах 1,5 мл и немедленно заморозить их жидким азотом. Хранить при -80 градусах по Цельсию для дальнейшего использования.
    ВНИМАНИЕ: DTT классифицируется как раздражающий и вредный и поэтому следует относиться с осторожностью.

2. Подготовка липидов в масляном растворе

  1. Растворите ПОПК и холестерин в хлороформе (CAUTION) отдельно, каждый до конечной концентрации 100 мг/мл. Вихрь каждый флакон отдельно.
    1. Объедините компоненты в стеклянном флаконе 2 мл: добавьте 50 л ПОПК в хлороформ, 50 л холестерина в хлороформе и 500 л минерального масла. Для 100 л синтетических клеток, 2 флакона липидов в масле не требуется.
    2. Вихрь, а затем тепла около 1 ч при 80 градусов по Цельсию в химическом капоте, чтобы испарять хлороформ. Убедитесь, что полное испарение произошло, следуя указанному времени/условиям и контролируя объем раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате липидов в масле раствор может храниться при комнатной температуре до двух недель. Для улучшения результатов рекомендуется использовать свежий препарат перед каждым экспериментом. Соотношения липидов и холестерина могут быть изменены в соответствии с желаемым составом мембраны. Высокая концентрация холестерина может привести к образованию агрегатов в окончательном растворе синтетических клеток.
      ВНИМАНИЕ: Хлороформ классифицируется как раздражающий и вредный и поэтому следует лечить с осторожностью и в районах с выкопом дыма.

3. Препараты внешних, предвнутренних и кормовых растворов

  1. Подготовка биржевых решений
    1. Подготовьте фондовые решения, перечисленные в таблице 2, с использованием ультрачистой воды (UPW).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы должны быть подготовлены заранее и храниться при -20 градусов до дальнейшего использования. Реагент 7 имеет тенденцию к форме агрегатов. Отопление до 37 градусов по Цельсию снизит агрегацию. Небольшая агрегация не сильно повлияет на реакцию. Раствор реагента 8 молочный и мутный.
  2. Внешнее решение
    1. Растворите глюкозу в DNase/RNase-free H2O до конечной концентрации 200 мМ.
    2. Для 100 л внутреннего раствора подготовьте 1,6 мл внешнего раствора.
  3. Предварительное внутреннее решение
    1. Добавить реагенты 1-14 в зависимости от количества и концентрации, перечисленные в таблице 2. Например, для окончательного объема синтетических клеток в 100 л, подготовить 100 л внутреннего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: UPW должны быть добавлены для завершения окончательного необходимого объема. На этом этапе смесь может храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких часов.
  4. Решение для кормления
    1. Добавьте все реагенты в зависимости от количества и концентрации, перечисленных в таблице 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1:1 соотношение кормления решение: внутреннее решение. Для окончательного синтеза синтетических клеток в 100 л, подготовить 100 л кормления раствора. Рекомендуется подготовить небольшой избыточный объем наружного, внутреннего и кормового раствора.

4. Подготовка синтетических клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие тома корректируются для подготовки 100 л синтетических клеток.

  1. Синтетические клетки, производящие белок
    1. В трубке 15 мл поместите 12 мл внешнего раствора и медленно добавьте сверху слой 500 л липидов в масляном растворе. Инкубировать при комнатной температуре 20 мин.
    2. Для завершения подготовки внутреннего раствора: смешайте ингредиенты внутреннего раствора на дробленом льду до конечного объема в 100 л путем оттаивания и добавления S30-T7 Lysate (реагент 15) и плазмида ДНК (реагент 16) в хранит смесь.
    3. Ко второму 2 мл стеклянного флакона с 500 л липидов в масляном растворе добавьте 100 л внутреннего раствора. Пипетка вверх и вниз энергично в течение 1 минуты и вихрь еще на минуту на пятом уровне.
      1. Инкубировать в течение 10 минут на дробленом льду и медленно добавлять полученную эмульсию в верхней части фазы масла в трубке 15 мл (от 4.1.1).
    4. Центрифуга в течение 10 мин при 100 х г и 4 кв с, а затем центрифуга в течение 10 мин при 400 х г и 4 кв. c. К концу центрифугации следует наблюдать гранулы в нижней части трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование размахивая ведро центрифуга ротор предпочтительнее здесь для приобретения лучшего покрытия второго слоя липидов во время воды в масле капель "проход через межфазы. В случае, если нет наблюдаемых гранул, скорость центрифугирования может быть увеличена до 1000 х г. В противном случае смотрите раздел Обсуждение, в который говорится о конкретной серьезности внешнего решения.
    5. Извлеките гранулы.
      1. Удалите лишний слой масла.
      2. Используйте обрезанный наконечник пипетки, нагруженный примерно 400 злител внешнего раствора, чтобы извлечь гранулы. Отпустите внешний раствор при прохождении через фазу масла, чтобы собрать только гранулы в ваквоковой фазе.
        1. Протрите кончик после извлечения гранул, чтобы избежать переноса остатков масла и перенесите гранулы в чистую трубку площадью 1,5 мл.
    6. Центрифуга в течение 10 мин при 1000 х г и 4 градусах По Цельсию, удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в 100 кЛ раствора для кормления (1:1 соотношение внутренних: кормящих растворов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированный угол центрифуги ротор может быть использован здесь также.
    7. Для экспрессии белка, инкубировать в течение 2 часов при 37 градусов без тряски.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации варьируется между различными белками.
    8. Оцените количество произведенного белка с помощью подходящего метода в соответствии с свойствами белка цели.
  2. Рекомендуемые контрольные группы
    1. Внутреннее решение и подтверждение активности lysate
      1. Подготовьте полное внутреннее решение (с помощью lysate ДНК и S30-T7).
      2. Немедленно инкубировать реакцию выше с помощью напольного инкубатора шейкер ажиотаж при 250 об/мин или термомиксер при 1200 об/мин, при постоянной температуре 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации, чтобы соответствовать времени инкубации синтетических клеток.
    2. Синтетические клетки
      1. Отрицательная контрольная группа: Подготовьте протокол, представленный в 4.1 с внутренним раствором без ДНК.
      2. Положительный контроль: Подготовьте протокол, представленный в 4.1 с внутренним раствором, содержащим плазмидt T7, кодируя для гена репортера.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте положительную контрольную группу, состоящую из гена репортера, например sfGFP, наряду с испытательными группами, чтобы обеспечить эффективность инкапсуляции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для подготовки синтетических клеток путем инкапсуляции системы S30-T7 CFPS на основе BL21 E. coli внутри липидных пузырьков. Схематическое описание процесса подготовки, включающий изображение каждого этапа, представлено на рисунке 2. Успех процесса подготовки синтетических клеток зависит от правильной производительности каждого этапа и осуществляется по различным параметрам. Протокол должен быть скорректирован с учетом производства конкретного белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол вводит простой и доступный метод для производства больших количеств белково-производящих синтетических клеток. Урожайность активных ячеек зависит от тщательного и точного выполнения протокола с акцентом на несколько критических шагов. В разделе подготовки лизата этого метода, важно достичь соответствующей плотности бактерий до лиза клетки для достижения достаточного количества белков в бактериальном лизате. Во-вторых, процесс лизиса должен быть выполнен при 4 градусах По Цельсию, а лизат быстро заморожен жи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана ERC-STG-2015-680242.

Авторы также признают поддержку Центра интегрированного рака Technion (TICC); Институт нанотехнологий Рассела Берри; Лорри И. Локи Междисциплинарный центр наук и инженерии о жизни; министерство экономики Израиля за грант Камин (52752); Министерство науки и космонавтики Израиля - Канцелярия главного ученого (3-11878); Израильский научный фонд (1778/13, 1421/17); Израильская онкологическая ассоциация (2015-0116); Немецко-израильский фонд научных исследований и разработок для гранта GIF Young (I-2328-1139.10/2012); программа Европейского союза FP-7 IRG для гранта на профессиональную интеграцию (908049); Фосалипидский исследовательский центр Грант; Фонд Розенблатта по изучению рака, грант Фонда семьи Маллат; и Фонд семьи Унгер. А. Шредер признает алон и Тауб стипендий. О. Адир признает стипендии Шермана и Гутвирта. Г. Чэнь признает стипендию Шермана. Н. Крински признает баронесса Ариан де Ротшильд женщин докторской программы от Ротшильд Кесарево фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<стронг>А. Реагенты, необходимые для этапа 1 (получение лизата S30-T7)
кишечная палочка BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076TargeTron вектор для трансформации.
Стоковый раствор 50 мг/мл ампициллинаSigmaA9518хранится при температуре -20°С.
10 г/л Bacto-tryptoneBD Bioscience 211705Для приготовления тарелки из агара Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 г/л хлорида натрия (NaCl)Bio-Lab19030591
5 г/л бакто-дрожжевого экстрактаBD Bioscience 212750
15 г/л Агар агар очищенныйMerck1.01614.5007
50 &; г/мл АмпициллинSigmaA9518
10 г/л Бакто-триптонBD Bioscience 211705Для приготовления среды Luria Bertani (LB) (20 мл).
10 г/л хлорида натрия (NaCl)Bio-Lab19030591
5 г/л бакто-дрожжевого экстрактаBD Bioscience 212750
50 &микро; г/мл АмпициллинSigmaA9518
12 г/л Бакто-триптонBD Bioscience 211705Для приготовления потрясающих бульонов (ТБ) среды (1 л).
24 г/л бакто-дрожжевого экстрактаBD Bioscience 212750
4% (v/v) Глицерин безводныйBio-Lab7120501
2,32 г/л K2HPO4Спектр химикатаP1383
12,54 г/л KH2PO4Спектр химикатаP1380
  50 & микро; г/мл АмпициллинСигмаА9518
Стоковый раствор изопропила 100 мМ &бета;-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) INALCOINA-1758-1400Фильтрованный с использованием 0,2 & микро; m гидрофильный шприцевой фильтр PVDF.
Стоковый раствор 0,1 М дитиотреитола (DTT)TCID1071Отфильтрован с использованием 0,2 &микро; m гидрофильный шприцевой фильтр PVDF.
10 мМ трис-ацетат при pH = 7,4SigmaT1503S30 буфер для лизата (1,5 л)
14 мМ ацетат магнияMerck1,05819,0250
60 мМ ацетат калияCarlo Erba470147
1 мМ DTTTCID1071
0,5 мл/л 2-меркаптоэтанолSigmaM6250
Оборудование, необходимое для этапа 1
100 мл стерилизованные колбы ЭрленмейераThermo Scientific50-154-28462 колбы
2 л стерилизованные колбы Эрленмейера с перегородкамиKIMAX-KIMBLE256302 колбы
Встряхиватель напольный инкубаторMRCTOU-120-2Лабораторный шейкер инкубатор 450x450мм, 400об/мин, 70 градусов; C
ЦентрифугаThermo Scientific75004270(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Ротор с фиксированным углом.
Должен обеспечивать не менее 13 000 x g.        * Предварительно охлажден до 4 °C.
Гомогенизатор высокого давленияAVESTINEmulsiFlex-C3предварительно охлажден до 4°С.
-80oC морозильная камераSO-LOWU85-18
Стерилизованные пластиковые пробирки объемом 1,5 млEppendorf30120086Желательно предварительно охлажденные до -20 °C.
СпектрофотометрTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
96-луночная прозрачная пластинаThermo Scientific167008
Стерилизованный градуированный цилиндрCorning
Стерилизованные центрифужные пробиркиEppendorf30120086Желательно предварительно охлажденные до -20 °C.
Стерилизованные наконечники для пипетокCorningПредпочтительно предварительно охлажденные до -20°С.
Ведро для колотого льдаBel-ArtM18848-4001
Малый бак для жидкого азотаNALGENE4150-4000<
strong>B. Реагенты, необходимые для этапа 3 (липиды в приготовлении масляного раствора):
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC)Липоид556400порошок
холестеринасигмаC8667Порошок
хлороформаBio-Lab3082301
минеральное маслоSigmaM5904Легкое масло
<>сильноОборудование, необходимое для шага 2
вихревой смесительScientific industriesSI-0256
Нагревательный блокTECHNEFDB03ADПредварительно нагрет до 80 °C.<бр/> Должен обеспечить контролируемую температуру.
Стеклянные флаконы с винтовым горлышком объемом 2 млCSI Analytical InnovationsVT009M-1232Для больших масштабов используйте соколы объемом 50 мл и выпаривайте хлороформ с помощью ротационного испарителя.
9 мм Винтовая крышкаCSI Analytical InnovationsC395R-09LC
>C. Реагенты, необходимые для этапа 3 (внутренние и питательные реакционные смеси):
HEPESSpectrumH10891 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH буфер
Гидроксид калия (KOH)Frutarom55290
1 M Ацетат магнияMerck1.05819.0250Кофактор и стабилизатор отрицательного заряда.
1 М ацетата калияCarlo Erba470147Стабилизатор отрицательного заряда.
5.2 М ацетат аммонияMerck1.01116.1000Стабилизирует отрицательный заряд.
50% (w/v) Полиэтиленгликоль 6000 (PEG)Merck8.07491.1000Увеличивает концентрацию макромолекул.
0,5 М 3-фосфоглицерат (3-PGA)SigmaP8877Вторичный источник энергии.
50 мМ Аминокислотная смесь ISigmaLAA21-1KTАминокислотная добавка.
Содержит: по 50 мМ каждой из следующих 17  натуральных аминокислот - аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, пролин, серин, треонин и валин.
50 мМ Аминокислотная смесь IISigmaLAA21-1KTАминокислотная добавка.
Содержит: по 50 мМ каждой из следующих 3 природных аминокислот - триптофан, фенилаланин и тирозин.
100 мМ Аденинтрифосфат (АТФ)SigmaA3377Нуклеотиды и источник энергии.
50 мМ гуанидинтрифосфат (ГТФ)SigmaG8877Нуклеотиды и источник энергии.
100 мМ Уридин трифосфат (UTP)ACROS ORGANICS226310010добавка нуклеотидов.
100 мМ изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG)INALCOINA-1758-1400Индукция экспрессии генов.
2 М. СахарозаДж.Т. Бейкер1933078Генерация градиента плотности.
2 М глюкозаSigma16301Генерация градиента плотности.
H2O UltraPure Water (UPW)Био-лаборатория2321777500ДНКазы и Свободный от РНКазы
лизат S30-T7__Получен на этапе 1.                                                                                                                                              Источник транскрипции и Translation components.
Хранить при -80 ° c, разморозить на разбитом льду непосредственно перед использованием. 
Запас ДНК-плазмиды по выбору__Содержит последовательность для требуемого белка.
В рамках T7 promotor
D. Оборудование, необходимое для этапа 4 (подготовка синтетических клеток)
Шейкер напольный инкубатор или термомиксерMRCTOU-120-2Лабораторный шейкер инкубатор 450x450 мм, 400 об/мин, 70 &d; C
PHMT Грант Bio ТермомиксерPSC18
ЦентрифугаThermo Scientific75004270(75003629) - TX-400 4 x 400 мл Качающееся ведро Ротор.< чел./> Подходит для пробирок размером 15 мл.<чел/> Предпочтительно качающиеся ведра.<чел/> Должен обеспечивать не менее 1000 г г.<бр/> Предварительно охлажденный до 4 °C.
Настольная центрифугаThermo Scientific75002420(75003424) - ротор 24 x 1,5/2,0 мл с ClickSeal.
Подходит для флаконов Eppendorf.
Предварительно охлажденный до 4 °C.
Вихревой смесительScientific industriesSI-0256
Ведро для дробленого льдаBel-ArtM18848-4001
мл стеклянные флаконы с винтовым горлышкомCSI Analytical InnovationsVT009M-1232
Стерильные пластиковые пробирки 15 млThermo Scientific339651
Стерилизованные 1,5 мл пластиковые пробиркиEppendorf30120086
Стерилизованные наконечники для пипетокCorningСтерилизованные автоклавом.
<strong, 2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи