Пользовательская многофотонная микроскопическая платформа для живого изображения мыши Корнеа и Конъюнктивы

Summary

Здесь представлена многофотонная микроскопическая платформа для визуализации глазной поверхности живой мыши. Флуоресцентная трансгенная мышь обеспечивает визуализацию ядер клеток, клеточных мембран, нервных волокон и капилляров в глазной поверхности. Нелинейные сигналы второго гармонического поколения, полученные из коллагеновых структур, обеспечивают безымянные изображения для стромальных архитектур.

Abstract

Обычный гистологический анализ и системы клеточной культуры недостаточны для полного моделирования физиологической и патологической динамики in vivo. Мультифотонная микроскопия (MPM) стала одним из самых популярных методов визуализации биомедицинских исследований на клеточном уровне in vivo, преимущества включают высокое разрешение, глубокое проникновение тканей и минимальную фототоксичность. Мы разработали платформу MPM изображений с индивидуальным держателем глаз мыши и стереотаксис этап для изображения глазной поверхности in vivo. Двойной флуоресцентный белок репортер мыши позволяет визуализировать ядра клеток, клеточные мембраны, нервные волокна и капилляры в глазной поверхности. В дополнение к многофотонным сигналам флуоресценции, приобретение второго гармонического поколения (SHG) одновременно позволяет характеристику коллагеновой стромальной архитектуры. Эта платформа может быть использована для интравитальной визуализации с точным позиционированием по всей глазной поверхности, включая роговицу и конъюнктиву.

Introduction

Структуры глазной поверхности, включая роговицу и конъюнктиву, защищают другие более глубокие глазные ткани от внешних нарушений. Роговица, прозрачная передняя часть глаза, функционирует как рефракционная линза для направления света в глаз, так и в качестве защитного барьера. Эпителий роговицы является внешним слоем роговицы и состоит из различных слоев поверхностных клеток, клеток крыла и базальных клеток. Корнеальная строма состоит из сложно упакованных коллагеновых ламелл, встроенных в кератоциты. Корнеловый эндотелий, один слой плоских шестиугольных клеток, играет важную роль в поддержании прозрачности роговицы, сохраняя строму роговицы в относительно обезвоженном состоянии через свои насосные^{функции 1}. Лимбус образует границу между роговицей и конъюнктивой, и является резервуаром эпителиальных стволовых клеток роговицы². Высоко васкуляризованная конъюнктива помогает смазыть глаза, производя слизь и слезы³.

Клеточная динамика структур поверхности роговицы традиционно изучается либо гистологическим анализом, либо культурой клеток в пробирке, которые не могут адекватно имитировать динамику клеток in vivo. Таким образом, неинвазивный подход к живой визуализации может преодолеть такой разрыв. Благодаря своим преимуществам, которые включают высокое разрешение, минимальный фотопамаж и более глубокую глубину изображения, MPM стал мощным условием в различных областях^{биологических исследований 4,,5,,6,,7,,8.} Для визуализации роговицы, MPM предоставляет клеточную информацию из внутренней аутофторесценции, полученной из внутриклеточного NAD (P)H. Сигналы второго гармонического поколения (SHG), полученные из не-центросимметрических волокон I коллагена под фемтосекундным лазерным сканированием, обеспечивают коллагеновые стромальные структуры без дополнительных процедур^{окрашивания 9.} Ранее мы и другие группы использовали MPM для визуализации роговицы животных и человека^{9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.}

Трансгенные линии мыши, экспонирующие флуоресцентные белки в конкретных популяциях клеток, широко используются для различных исследований в клеточной биологии, включая развитие, гомеостаз тканей, регенерацию тканей и канцерогенез. Мы использовали трансгенные штаммы мыши помечены флуоресцентными белками для in vivo^{изображения роговицы 9,10}, волосяные^{фолликулы 10} и эпидермис¹⁰ по MPM. Двойной флуоресцентный штамм мыши с клеточной мембраной, помеченной tdTomato и ядром клетки с тегами EGFP, выведен из двух штаммов мыши: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sor^tm1Ytchn/J,#021847)¹⁶ и mT-mG (Gt(ROSA26)^{ACTB-tdTomato-EGFP}, #007676)^17. R26R-GR трансгенная линия мыши содержит двойной флуоресцентный белок репортер конструкций, в том числе гена синтеза H2B-EGFP и mCherry-GPI якорный ген синтеза сигнала, вставленный в gt (ROSA)26Sor локус. Трансгенный штамм mT-mG является клеточной мембраной tdTomato и EGFP флуоресцентных мышей Cre-репортер. До рекомбинации Cre белок клеточной мембраны с экспрессией флуоресценции tdTomato широко присутствует в различных клетках. Этот трансгенный штамм мыши позволяет нам визуализировать ядра-EGFP и мембраны с tdTomato без возбуждения Cre. Две самки (R26R-GR⁾и один самец (mT-mG^{) трансгенная}мышь были выведены вместе, чтобы произвести достаточно мышей для экспериментов. Их потомство с R26R-GR^q/-;mT-mG^{q/- генотип,} двойной флуоресцентный штамм мышей, были использованы в этом исследовании. По сравнению с одной флуоресцентной линии^{мыши репортера, как описано ранее 9,10}, это двойное флуоресцентное напряжение мыши репортер дает нам 50% сокращение приобретения изображений времени.

В этой работе мы описываем подробный технический протокол для виво-изображения глазной поверхности шаг за шагом с помощью нашей платформы визуализации и двойных флуоресцентных трансгенных мышей.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Национального университета Тайваня и Мемориальной больницы Чан Гун.

1. Установка мультифотонной микроскопии

1. Создайте систему, основанную на вертикальном микроскопе с погружением в воду 20x 1.00 NA цели(рисунок 1A).
2. Используйте Ti: Сапфировый лазер (с настраиваемой длиной волны) в качестве источника возбуждения. Установите длину волны лазерного выхода на уровне 880 нм для EGFP и 940 нм для tdTomato(рисунок 1A).
3. Включите два дихроических зеркала (495 нм и 580 нм) для разделения SHG/EGFP и EGFP/tdTomato(рисунок 1A). Спектрально отделить сигналы SHG, EGFP и tdTomato фильтрами полосы 434/17nm, 510/84nm и 585/40nm (Рисунок 1A).
4. Для того, чтобы оптимизировать качество изображения и избежать фотоотравливания и повреждения тканей, установите мощность лазера около 35 мВт для визуализации роговицы и 50 мВт для лимбуса. Измерьте мощность лазера до того, как лазер пройдет оптическую систему. Точная мощность лазера на образцах составляет около 8-9 мВт. Полная микроскопическая конструкция показана на рисунке 1A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний предел мощности лазера установлен до 70 мВт, чтобы избежать фото-отбеливания и повреждения тканей.

2. Подготовка животных к живой визуализации

1. Для эксперимента используйте 8-12-недельных мышей. Внутримышечно вводят 50-80 мг/кг плитки HCl и zolazepam HCl для общей анестезии. Проверьте на отсутствие реакции на вывод рефлекс, щипать ноготь. Достаточная анестезия важна для обеспечения стабильного мониторинга скорости дыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в возрасте 8 недель или выше рекомендуется, потому что их глазные яблоки созрели.
2. Поместите мышь под наркозом на нагретой стадии и вставьте зонд мониторинга температуры в анус.
   ВНИМАНИЕ: Зонд должен быть полностью вставлен в аниаляционную полость без воздействия воздуха, чтобы избежать перегрева нагревателя и индукции теплового удара.

3. Глаз проведение для живого изображения глазной поверхности

1. Для живого изображения глазной поверхности используйте специально разработанный стереотаксис держателя мыши, состоящий из двух частей: держатель головы для стабилизации головы и держатель для глаз, чтобы втянуть веки и разоблачить всю глазную поверхность(рисунок 1B-D).
2. Вставьте ушные батончики во внешний слуховой мясо и поддерживайте трехозорную фиксацию держателя головы(рисунок 1B,D).
3. Актуально нанесите раствор 0,4% оксибупрокаина гидрохлорида в солевой раствор и оставьте его на 3 мин для обезболить глазную поверхность.
4. Убедитесь, что глазное яблоко выступает надлежащего ручного опрокидывания век. В противном случае может возникнуть ишемия и кровотечение глазного яблока.
5. Аккуратно поместите петлю полиэтиленовой трубки подводки для глаз вдоль края век, чтобы разоблачить глазную поверхность. Стабилизировать глазное яблоко с держателем глаза состоит из No 5 Дюмон типсы с его кончиками покрыты петлей полиэтиленовой трубки (Рисунок 1C, D).
6. Винт force с помощью ручки в дистальных типсов глазного держателя, чтобы сохранить глазное яблоко стабильной (Рисунок 1D).
7. Нанесите гель для глаз с рефракционным индексом 1.338 на поверхность роговицы в качестве среды погружения для поддержания влажности глазной поверхности каждый час. Кроме того, регулярное применение геля для глаз каждый час позволяет избежать затуманивания роговицы во время визуализации.
8. Поверните глазное яблоко с держателем, который заблокирован на степпер-моторизованной сцене для визуализации по всей поверхности роговицы от центральной роговицы до периферическойобласти (рисунок 1C,D).
   ВНИМАНИЕ: Как избыточное, так и недостаточное количество геля для глаз может повлиять на качество изображений во время визуализации. Таким образом, дополняя гель для глаз каждый час, чтобы сохранить поверхность влажной регулярно имеет важное значение для визуализации.

4. Приобретение изображений с серийным изображением

ПРИМЕЧАНИЕ: Установите первый и последний слайд в каждом стеке, чтобы уменьшить падение артефактов движения.

1. Перед тем, как сделать снимки, изображение целевого поля с источником ртутного света.
2. Нажмите на символ программного обеспечения микроскопа, чтобы включить программное обеспечение.
3. Выберите правильный прирост PMT и цифровой выигрыш, чтобы визуализировать клеточную структуру на глазной поверхности.
4. Установите первый слайд и последний слайд, чтобы приобрести стек.
5. Введите числовые значения для разрешения изображения и z-шага, например, 512 x 512 и 1 мкм в качестве z-шага.
6. Нажмите на кнопку "Пуск", чтобы собрать z-серийные изображения.
7. Приобретайте живые изображения дважды в одной и той же области, во-первых, при возбуждении 880 нм для сбора сигналов SHG/EGFP, а во-вторых, при возбуждении 940 нм для сбора сигналов EGFP/tdTomato.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание двух стеков обеспечивает 3 канала изображения. Разрешение изображения и размер формата сканирования были 512 х 512 пикселей и 157 мкм x157 мкм, соответственно.

5. Обработка изображений и 3D реконструкция

1. Загрузите z-серийные изображения в программное обеспечение^{Фиджи 18}.
2. Выберите плагин Медианный 3D-фильтр на Фиджи, чтобы уменьшить фоновый шум.
3. Выберите фильтр «Нерезка» пакета на Фиджи, чтобы отточить изображения.
4. Нажмите" Auto" в яркости / контрастности, чтобы автоматически оптимизировать качество изображений.
5. Сохраните изображения в качестве последовательности изображений, чтобы иметь возможность экспортировать z-серийные изображения.
6. Загрузите z-серийные изображения в коммерческое программное обеспечение (например, Avizo lite) для 3D-реконструкции с использованием рендеринга громкости.
7. На всех изображениях MPM присутствуют сигналы EGFP, tdTomato и SHG в псевдозеленом, красном и циановом цвете соответственно.
8. Захват 3D-структуры изображения на снимок.

Results

Используя эту живую платформу визуализации, мышь глазной поверхности могут быть визуализированы на клеточном уровне. Для визуализации отдельных одиночных клеток на глазной поверхности мы использовали двойных флуоресцентных трансгенных мышей с EGFP, выраженными в ядре и tdTomato, выраженных в клеточной мембране. Богатая коллагеном строма роговицы была выделена сигналами SHG.

В эпителии роговицы были визуализированы поверхностные клетки, клетки крыла ибазальные клетки (рисун...

Discussion

Эта специально построенная платформа MPM изображений с программным обеспечением управления была использована для интравитальной визуализации эпителиальных органов мыши, включая^{кожу 10,волосяной фолликул 10} и^{глазную поверхность 9,10} (Рисунок 1A). С самого начала нашего проекта система использовалась для гибкого изменения оптических компонентов для различных экспериментов. Эта методология...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Программное обеспечение AVIZO Lite	Thermo Fisher Научная		версия: 2019.3.0
Полосовые фильтры	Semrock	FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40
Дихроичные зеркала	Semrock	FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36
Galvano	Thorlabs	GVS002
Jade BIO программное обеспечение	SouthPort Corporation	Jade BIO
Оксибупрокаина гидрохлорид	Sigma	O0270000
PMT	Hamamatsu	H7422A-40
Полиэтиленовая трубка	BECTON DICKINSON	427401
Стереотаксический держатель для мыши	Step Technology Co., Ltd	000111
Ti: Сапфировый лазер	Spectra-Physics	Mai-Tai DeepSee
Вертикальная микроскопия	Olympus	BX51WI
Vidisic Gel	Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH	D13581
Zoletil	Virbac	VR-2831