Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Простое обнаружение первичной силии с помощью иммунофлуоресценции

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61155

⸱

15 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiobiology, Faculty of Military Health Sciences in Hradec Kralove, University of Defence, 2Department of Clinical Biochemistry and Diagnostics, University Hospital, 3Department of Oncology, Thomayer Hospital, Charles University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, Faculty of Medicine, Charles University

В этой статье

Краткое содержание

Первичные реснички являются внеклеточными структурами, связанными с центриолом. Первичное обнаружение ресничок с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания является относительно простой процедурой, которая приводит к чрезвычайно высококачественным изображениям. В этом протоколе фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцентном или конфокальцаторном микроскопе.

Аннотация

Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1 клеточного цикла, ресорбируются до митоза. Первичные реснички можно визуализировать с помощью очень сложных методов, включая электронную микроскопию передачи, 3D-изображение или программное обеспечение для автоматического обнаружения первичных ресничок. Тем не менее, иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок необходимо для выполнения этих методов. Эта публикация описывает протокол для легкого обнаружения первичных ресничок in vitro путем окрашивания ацетилированного альфа-тубулина (аксонема) и гамма-тубулина (базального тела). Этот иммунофлюоресцентный протокол окрашивания относительно прост и приводит к высококачественным изображениям. В настоящем протоколе описывается, как четыре клеточные линии (C2C12, MEF, NHLF и фибробласты кожи), выражают первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены флуоресцентным или конфокальные микроскопы.

Введение

Первичные реснички сенсорные, одиночные, мембранные, немотильные структуры, связанные с матери центриоля клетки. Первичные реснички находятся на большинстве позвоночных клеток, за исключением красных кровяных телец,адипоцитов 1, и гепатоцитов2. Первичные реснички образуются как удлиненный аксонем, состоящий из микротрубочек, основным компонентом которых является З-тубулин. Аксонем растет из базального тела, которое структурировано из З-тубулина. Длина первичных ресничок колеблется от 2 до 10 мкм; однако, его размеры могут меняться во время гликилирования, голодания, гипоксии, цитотоксического стресса, или после воздействия ионизирующего излучения3,,4,,5,,6,,7. Как правило, клетки имеют только один первичный цилий, который участвует в морфогенезе и клеточной сигнализации пути важны для пролиферацииклеток и дифференциации 8,9.

Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1, и ресорбируются перед входом в митоз в процессе, связанном с деацетилированием тубулина при посредничестве HDAC6 (гистон диацетилаза 6)10. Точный момент первичной ресорбции реций зависит от типа клетки и экспрессии генов, непосредственно участвующих в этом процессе, таких как Аврора A, Plk1, TcTex-111,12,13. В зависимости от типа клетки, первичные реснички выражают различные типы рецепторов, ионных каналов и активных сигнальных путей. К ним относятся наиболее важные сигнальные рецепторы, влияющие на пролиферацию и выживание, EGFR, PDGFR и FGFR. Также включены некоторые из сигнальных путей, которые могут повлиять на функцию одного или нескольких органов, в том числе Ежик, Нотч, и Wnt. Благодаря этим рецепторам и сигнальных путей, первичные реснички также выполнять химиосенсорную функцию. Эта функция позволяет первичным реснички обнаружить конкретные лиганды для Notch, гормоны, и биологически активных веществ, таких как серотонин или соматостатин. Другие специфические функции, выставленные первичными реснички разной длины включают реакцию на изменения температуры, гравитации и осмолальности14.

Первичные реснички могут быть визуализированы с помощью различных методов, таких как живая визуализация, электронная микроскопия передачи, 3D-изображение, или с помощью программногообеспечения для автоматического обнаружения первичных ресничок 5,15,16,17. Тем не менее, эти методы являются высокоспециализированными и текущих исследований потребностей основных, быстрых и простых методов для окрашивания первичных ресничок на каждом этапе исследований. Описанный является простым и полезным методом для обнаружения первичных ресничок в культурных клетках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка культурных средств массовой информации, решений и блюд

  1. Автоклав крышки (22 х 22 мм). Приготовьте 6 хорошо пластин. Оттепель плода бычьей сыворотки (FBS) и антибиотик пенициллин / стрептомицин и тепло культуры средней до комнатной температуры (RT). Использование трипсина-ЭДТА (0.25%) и 1x PBS (фосфат буферный солевой раствор с кальцием и магнием) для прохождения клеток.
  2. Приготовьте свежий 4% параформальдегид (PFA) в dH2O (800 мг ПФА в 20 мл dH2O). PFA должен быть только что подготовлен к каждому эксперименту. Перемешать и нагреть раствор при температуре 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут в капюшоне. Охладить на RT. Добавить 1 М гидроксида натрия, пока раствор не станет ясным (рН 7,2-7,4). Хранить при 4 градусов по Цельсию в течение 1 недели.
    Примечание: PFA является токсичным; всегда носите адекватное средства индивидуальной защиты и подготовить в химическом капюшоне.
  3. Подготовка 500 МЛ культуры средств массовой информации, DMEM (Dulbecco в модифицированной иглы среды) содержащие 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, и 2% глутамина.
  4. Приготовьте 13 мл 1% желатинового раствора в стерильном dH2O (130 мг желатина в 13 мл dH2O). Используйте 2 мл 1% желатина для каждой хорошо в 6 хорошо пластины. Держите стерильными.
  5. Очистите капот ламинарного потока с использованием 70% этанола. Поместите необходимый материал внутри капота ламинарного потока перед началом эксперимента.

2. Культура клеток для окрашивания иммуноцитохимии

  1. Оттепель клеток (в данном исследовании C2C12, MEF, NHLF, и фибробласты кожи) с использованием стандартных методов и пластины их в колбе T75 дополнены 10-12 мл подготовленных средств массовой информации. Инкубация при 37 градусах по Цельсию/5% CO2/90% относительная влажность (RH) до тех пор, пока клетки не достигнут 70% слияния.
  2. Удалите клетки из инкубатора и поместите их в капот ламинарного потока. Удалите культурные средства массовой информации и промыть клетки кратко 2x с 1x PBS. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в колбу T75 и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Периодически проверяйте перевернутый микроскоп для мониторинга отслоения клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от клеточной линии и, следовательно, должно быть определено эмпирически.
  3. Аккуратно перерасходовать клетки в 10 мл культурных средств массовой информации, трубы тщательно, чтобы создать одну подвеску клетки. При необходимости снова промыть колбу.
  4. Поместите подвеску клетки в коническую трубку и центрифугу 5 мл при 200 х г. Декант супернатант, добавить 10 мл культуры средств массовой информации, и осторожно повторно гранулы. Возьмите 20 МКЛ клеточной суспензии и смешайте в соотношении 1:1 с трипан-синим и посчитайте в цитометре по стандартному методу.
  5. Поместите один coverslip внутри каждого хорошо 6 хорошо пластины с помощью пинцета. Пальто крышки с желатином, наливая 2 мл в колодцы. Это поможет клеткам прикрепиться к крышкам. Снимите раствор желатина и дайте высохнуть воздухом в течение нескольких минут. Крышки теперь готовы к выращиванию клеток. Немедленно начните культивирование.
  6. Семя 100000 фибробластов в каждой хорошо и добавить 2 мл культурных средств массовой информации. Инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию/5% CO2/90% RH. На данный момент, клетки могут рассматриваться в соответствии с потребностями пользователя. Лечение, чтобы вызвать цилиацию были ранееописаны 4,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный номер посева зависит от времени удвоения клеток и должен быть определен соответствующим образом.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок in vitro

  1. Тепло 4% параформальдегида к RT. Подготовка Пастер пипетки, 1x PBS (RT), контейнер для отходов, 15 МЛ конические трубки, микропипеты (0,5-10 йл, 20-200 МЛ, и 100-1000 йл) и советы. Возьмите клетки из инкубатора и поместите их на скамейку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура окрашивания не должна проводиться в стерильных условиях. Все решения должны быть на RT.
  2. Удалите мультимедиа из каждого хорошо. Оставьте крышку внутри колодец. Очень аккуратно мыть клетки 3x с 2 мл 1x PBS. Используя пипетку Pasteur, добавьте 2 мл 4% PFA в каждую колодец, чтобы исправить клетки. Инкубировать в течение 10 минут на RT. Удалить PFA и мыть 3x с 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте достаточный объем, чтобы покрыть весь обложку в инкубационые периоды. Никогда не позволяйте клеткам высохнуть. Никогда не наливайте ни одного из решений непосредственно на крышку.
  3. Подготовка 0,5% Triton X-100 в 13 мл 1x PBS 10 мин перед использованием. Добавить 2 мл в каждый колодец. Инкубация в течение 15 мин. Вымойте осторожно 4x с 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Triton X-100 нерастворим в PBS на RT. Нагрейте 0,5% Triton X-100 раствора до 37 градусов по Цельсию в водяной бане, чтобы растворить его.
  4. Сыворотка козла оттепели за 5 минут до использования. Разбавить козлиную сыворотку в 1x PBS в соотношении 1:20 в качестве блокирующего раствора. Добавьте 150 йл к каждому крышке и инкубировать в течение 20 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости продлите период блокировки до 60 минут. Не мыть клетки после блокирования с козьей сыворотки.
  5. Оттепель первичных антител (т.е. антиацетилированных альфа-тубулин и анти-гамма-тубулин) за 5 минут до использования. Разбавить антитела отдельно в 1x PBS следующим образом: мышь антиацетилированных альфа-тубулин в соотношении 1:800 и кролика анти-гамма тубулин в соотношении 1:300. Удалите блокирующий раствор. Не мыть. Добавьте 150 МКЛ обоих разбавлений антител в крышки и инкубировать в течение 60 мин на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если инкубация на ночь использовать 500-1000 йл первичных антител решений, печать 6 хорошо пластины с парафиновой пленкой, и хранить при 4 градусов по Цельсию. Кроме того, используйте 150 МКЛ антител и инкубировать в камере влажности.
  6. Удалите первичные антитела. Вымойте крышки очень мягко 3x с 2 мл 1x PBS. Подготовка вторичных антител в 1x PBS путем отдельного разбавления Cy3 овец анти-мышь и Alexa Fluor488 коза анти-кролик в соотношении 1:300. Добавьте 150 йл обоих вторичных разбавлений антител к крышкам. Инкубировать в течение 45 минут на RT в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать в темноте, чтобы избежать фотоотбивания. Другие комбинации вторичных антител могут быть использованы по мере необходимости.
  7. Подготовка решения DAPI (4', 6-diamidino-2-фенилиндол) в соответствии с инструкциями производителя. Храните лишние aliquots при -20 градусов по Цельсию. Разбавить 10 йл от акции aliquot (1:5,000) в 50 мл 1x PBS. Добавьте 2 мл этого разбавления в крышки. Инкубировать в течение 5 минут на RT в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно инкубировать клетки в темноте, чтобы избежать фотоотбивания. Разбавление DAPI может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 месяца.
  8. Подготовьте 2 иглы, слайды, пинцет и монтажные средства массовой информации. Наклеить ярлык слайдов.
  9. Удалите раствор DAPI из скважин. Вымойте 3x с 1x PBS. Положите одну каплю монтажных средств массовой информации на каждом слайде. Используйте иглу, чтобы аккуратно поднять крышку со дна хорошо. Переверните крышку с помощью пинцета и аккуратно поместите его над каплей монтажа мультимедиа. Аккуратно удалите пузырьки.
  10. Защитите горки от света и храните их на ночь при 4 градусах Цельсия.
  11. Используйте флуоресцентный или конфокальный микроскоп с высоким увеличением, чтобы визуализировать первичные реснички.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут храниться в темное время суток при 4 градусов по Цельсию в течение 2 месяцев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок является относительно простой процедурой, которая приводит к высококачественным изображениям. В этих экспериментах фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцентном или конфокальцаторном микроскопе в соответствии с описанным выше протоколом. Первичный цилий был обнаружен с помощью ацетилированного З-тубулина и З-тубулина. Оценка первичных ресничок может проводиться на различных уровнях, и любое изменение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Некоторые авторы описали различные методы обнаружения первичных ресничок, иногда также описывая различные методы фиксации, которые могут повлиять на их обнаружение6,,20,,21,22. Несмотря на это, трудно найти полный и простой протокол для обнаружения. Наличие такого метода, несомненно, будет иметь большую помощь в изучении первичного исследования ресничок, особенно на ранних стадиях исследований,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечегораскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Министерством обороны Чешской Республики - Долгосрочный план развития организации Медицинские аспекты оружия массового уничтожения факультета военных медицинских наук, Университет обороны; Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики (Специальный исследовательский проект No: СВ/ ФВЗ201703) и ПРОГРЕС No40/06. Спасибо также Даниэлю Диасу за его добрую помощь в пересмотре английского языка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночный планшетTPP92406Размеры 128x86x22 мм
Alexa Fluor488Jackson ImmunoResearch111-546-047AffiniPure F(ab')? Фрагмент козьего антикроличьего IgG
антитубулина &гамма;Sigma-AldrichT5192Поликлональный кролик против мыши IgG2a
C2C12ATCCCRL-1772Миобласт (мышь)
Cy3Sigma-AldrichC2181Антимышиный IgG (цельная молекула) F(ab′)2 фрагмент; Антитело Cy3, полученное у овец
Dapi (4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид)Sigma-AldrichD9542
Dulbecco´ s Модифицированный Eagle´ СредаThermo Scientific11960044высоким содержанием глюкозы, без глутамина, Gibco
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферный растворSigma-AldrichD8662с MgCl2 и CaCl2, стерильно отфильтрованный, подходит для клеточной культуры
Фетальная бычья сывороткаThermo Scientific16000044стерильно отфильтрованная, Gibco
L-глутаминSigma-AldrichG7513
MEF ATCCSCRC-1039Мышиный эмбриональный фибробласт
Моноклональный антиацетилированный тубулинSigma-AldrichT7451Моноклональное антиацетилированное антитело к тубулину, полученное у мышей
NHLFLonzaCC-2512Первичные фибробласты легких (человек)
Нормальная козья сывороткаJackson ImmunoResearch005-000-121
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127-500Gпорошок
Пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP078110 000 единиц пенициллина и 10 мг стрептомицина на мл в 0,9% NaCl, стерильно-фильтрованный
ProLong Diamond Antifade MountantThermo ScientificP36961
Фибробласты кожилюбезно подарены Карловым университетом, медицинским факультетом в Градце Крá lové.
Квадратная крышкаThermo Scientific22X22-1.5Боросиликатное стекло, 22x22мм, квадратная
Triton X-100Sigma-Aldrich11332481001
трипсин-ЭДТА (0.25%)Thermo Scientific25200072стерильно-фильтрованный, Gibco

Ссылки

  1. Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
  2. Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
  3. Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
  4. Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
  5. Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
  6. Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
  7. Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
  8. Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
  9. Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
  10. Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
  11. Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
  12. Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
  13. Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
  14. Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
  15. Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
  16. Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
  17. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
  18. Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
  20. Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
  21. Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
  22. Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
  23. Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
  24. Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
  25. DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Простое обнаружение первичной силии с помощью иммунофлуоресценции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.