Методическая статья

Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61167

⸱

10 мая 2020 г.

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для изоляции человека и животных желудочков кардиомиоцитов от вибрато-вырезать миокарда ломтиками. Высокие урожаи клеток, терпимых к кальцию (до 200 клеток/мг), можно получить из небольшого количества тканей (lt;50 мг). Протокол применим к миокарду, подвергаемому воздействию холодной ишемии на срок до 36 ч.

Аннотация

Изоляция желудочковых сердечных миоцитов от сердца животных и человека является фундаментальным методом в кардиологических исследованиях. Кардиомиоциты животных обычно изолируются коронарной перфузией с пищеварительными ферментами. Тем не менее, изоляция человеческих кардиомиоцитов является сложной задачей, потому что человеческие образцы миокарда, как правило, не позволяют коронарной перфузии, и альтернативные протоколы изоляции привести к низкой урожайности жизнеспособных клеток. Кроме того, образцы миокарда человека встречаются редко и доступны только в учреждениях с кардиохирургией на месте. Это препятствует переводу находок с животных на кардиомиоциты человека. Описано здесь надежный протокол, который позволяет эффективно изоляции желудочковых миоцитов от человека и животных миокарда. Для увеличения соотношения поверхности к объему при минимизации повреждения клеток, ломтики миокардной ткани толщиной 300 мкм генерируются из образцов миокарда с вибромом. Ткань ломтиками затем переваривается с протеазы и коллагеназы. Крысиный миокард использовался для установления протокола и количественной оценки урожайности жизнеспособных, терпимых к кальцию миоцитоцитов путем подсчета потоко-цитометрических клеток. Сравнение с широко используемым методом тканей-куска показало значительно более высокие урожаи родообразных кардиомиоцитов (41,5 и 11,9 против 7,89 и 3,6%, р 0,05). Протокол был переведен на неудачный и несовершеный миокард человека, где урожайность была такой же, как в крысином миокарде, и, опять же, заметно выше, чем при методе тканевой кусок (45,0 и 15,0 против 6,87 и 5,23 клетки/мг, p lt; 0,05). Примечательно, что с представленным протоколом можно изолировать разумное количество жизнеспособных кардиомиоцитов человека (9–200 клеток/мг) от минимального количества тканей (lt;50 мг). Таким образом, метод применим к здоровому и отсутствию миокарда как из сердца человека, так и из сердца животных. Кроме того, можно изолировать возбудимые и контрактильные миоциты из образцов тканей человека, хранящихся до 36 ч в холодном кардиоплегическом растворе, что делает метод особенно полезным для лабораторий в учреждениях без кардиохирургии.

Введение

Семенной метод, который проложил путь к важной идеи в кардиомиоцитов физиологии является изоляция живых желудочков кардиомиоцитов из нетронутыхсердец 1. Изолированные кардиомиоциты могут быть использованы для изучения нормальной клеточной структуры и функции, или последствия экспериментов in vivo; например, для оценки изменений в клеточной электрофизиологии или возбуждении-сокращении связи в животных моделях сердечных заболеваний. Кроме того, изолированные кардиомиоциты могут быть использованы для клеточной культуры, фармакологических вмешательств, передачи генов, тканевой инженерии и многих других применений. Поэтому эффективные методы изоляции кардиомиоцитов имеют основополагающее значение для фундаментальных и трансляционных сердечных исследований.

Кардиомиоциты мелких млекопитающих, таких как грызуны, и от крупных млекопитающих, таких как свиньи или собаки, обычно изолированы коронарной перфузией сердца с растворами, содержащими сырые коллагеназы и/или протеазы. Это было описано как "золотой стандарт" метод для кардиомиоцитов изоляции, в результате чего дает до 70% жизнеспособных клеток2. Подход также был использован с человеческим сердцем, в результате чего приемлемые кардиомиоцитыдает 3,,4,,5. Однако, поскольку коронарная перфузия возможна только в том случае, если имеется нетронутое сердце или большой клин миокарда, содержащий ветку коронарной артерии, большинство образцов сердца человека не подходят для такого подхода из-за их небольшого размера и отсутствия соответствующей сосудов. Таким образом, изоляция человеческих кардиомиоцитов является сложной задачей.

Образцы миокарда человека в основном состоят из кусков тканей переменного размера (примерно 0,5 х 0,5 х 0,5 см до 2 х 2 х 2 см), полученных через эндомиокардабиопсии 6,перегородки миэктомии 7, ВАЗимплантации 8, или от explantedсердца 9. Наиболее распространенные процедуры для изоляции кардиомиоцитов начинаются с заминки ткани с помощью ножниц или скальпеля. Контакты от клетки к клетке затем нарушаются погружением в буферы без кальция или с низким содержанием кальция. За этим следуют несколько шагов пищеварения с сырыми экстрактами ферментов или очищенных ферментов, таких как протеазы (например, трипсин), коллагеназа, гиалуронидаза или эластаза, что приводит к распаду внеклеточной матрицы и освобождению кардиомиоцитов. В заключительном, критическом шаге, физиологическая концентрация кальция должна быть тщательно восстановлена, или повреждение клеток может произойти из-закальция-парадокса 10,,11,,12. Такой подход к изоляции удобен, но обычно неэффективен. Например, одно исследование показало, что почти 1 г ткани миокарда требуется для получения достаточного количества кардиомиоцитов, пригодных для последующихэкспериментов 13. Возможной причиной низкой урожайности является относительно жесткий метод дования тканей. Это может особенно повредить кардиомиоциты, расположенные на краю куска, хотя эти миоциты, скорее всего, будут освобождены от энзиматического пищеварения.

Другим аспектом, который может повлиять на эффективность изоляции и качество клеток, полученных из человеческих образцов, является продолжительность ишемии тканей. В большинстве протоколов в качестве предпосылки для хороших результатов упоминается короткое время транспортировки в лабораторию. Это ограничивает изучение желудочковых кардиомиоцитов человека в лабораториях с близлежащими средствами кардиохирургии. В совокупности эти ограничения препятствуют проверке важных выводов, полученных от моделей животных в кардиомиоцитах человека. Поэтому желательно улучшить протоколы изоляции, которые позволяют высокой урожайности кардиомиоцитов из небольшого количества тканей, предпочтительно без серьезных повреждений после длительного времени транспортировки.

Описано здесь протокол изоляции, основанный на энзиматическом пищеварении тонких ломтиков миокарда ткани, генерируемых вибромой14,15. Мы демонстрируем, что изоляция от ломтиков тканей является гораздо более эффективным, чем от тканей куски фарш с ножницами. Описанный метод не только позволяет высокую урожайность жизнеспособных человеческих кардиомиоцитов из небольшого количества миокардной ткани, но и применим к образцам, хранящимся или транспортируемым в холодном кардиоплегическом растворе до 36 ч.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с крысами были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Mittelfranken, Бавария, Германия. Сбор и использование образцов сердечной ткани человека было одобрено Институциональными советами по обзору Университета Эрлангена-Нюрнберга и Рур-Университета Бохума. Исследования проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией. Пациенты дали письменное информированное согласие до сбора тканей.

Самки крыс Wistar (150-200 г) были получены на коммерческой основе, под наркозом путем введения 100 мг/кг тиопентал-натрия интраперитонически, и усыпляется шейки матки дислокации следуют торакотомии и иссечение сердца. Образцы сердечной ткани человека были собраны из лево-желудочковой аперической ядры во время имплантации механических вспомогательных устройств, из перегородки миэктомии, из тетралогии коррекционной хирургии Фалло или из свободной левой желудочковой стенки эксплантированных сердец. Следующий протокол описывает изоляцию от желудочковой ткани человека. Изоляция крысиных кардиомиоцитов была выполнена соответственно, но с различными ферментами (см. таблицу материалов). Схематический рабочий процесс протокола иллюстрируется на рисунке 1.

1. Подготовка буферов, растворов и ферментов

  1. Подготовка буферов и решений, перечисленных в таблице 1.
  2. Разогреть растворы 1, 2, 3 и модифицированный раствор тирода до 37 градусов по Цельсию. Храните раствор для резки при 4 градусах Цельсия до его использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1-2 ломтиков миокарда в общей сложности около 15 мл, 8 мл и 5 мл растворов 1, 2 и 3 необходимы для изоляции в одном 35 мм ткани культуры блюдо. Масштабируйте соответственно для одновременных изоляций миоцитов в нескольких блюдах. Раствор для резки можно заморозить и держать при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
  3. Взвесить 1 мг протеиназы XXIV (см.Таблицу материалов) в предварительно облицованную 15 мл центрифуг трубки и хранить на льду до использования. Это для обработки одного образца. Масштабируйте сумму соответствующим образом. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
  4. Взвешивание 8 мг коллагеназы CLSI (см. Таблица материалов) в предварительно облицованную 15 мл центрифуг трубки и хранить на льду до использования. Это для обработки одного образца. Масштабируйте сумму соответствующим образом. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
    ВНИМАНИЕ: Носите маску для лица или работать под капотом дыма, чтобы избежать вдыхания ферментного порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активность ферментов может варьироваться в разных количествах. Таким образом, оптимальная концентрация может отличаться и должна быть определена с каждым недавно приобретеннымферментом 16.

2. Хранение и транспортировка миокардной ткани

  1. Хранить и транспортировать образцы сердца человека в охлаждее, 4 КК резки раствора(таблица 1).
  2. Используйте тот же раствор для дальнейшей обработки тканей и вибромной нарезки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия и хирургические образцы сердца должны быть немедленно переданы в раствор резки при 4 градусов по Цельсию, а затем могут храниться или транспортироваться при 4 градусов по Цельсию максимум за 36 ч до применения этого протокола.

3. Обработка и нарезка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для нарезки тканей следует Фишер и др.15.

  1. Обрезка блока тканей
    ВНИМАНИЕ: Сердечная ткань человека потенциально заразна. Всегда используйте защитный износ и следуйте правилам безопасности вашего учреждения. Тщательно обработать использованные лезвия и выбросить в контейнерах безопасности.
    1. Поместите образец в 100 мм ткани культуры блюдо заполнены 20 мл холодного раствора резки и держать на охлажденной, 4 градусов по Цельсию пластины.
    2. Удалите избыток фиброзной ткани и эпикардиального жира скальпелем. В случае трансмурального образца удалите трабекулы и слои тканей вблизи эндокарда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиброзная ткань жесткая и выглядит белой. Толстяк, как правило, мягкий и выглядит белым желтым. Слои ткани Трабекула и эндокарда можно определить по их свободному составу тканей и неприсоединивой ориентации по сравнению с миокардом эпикардиальных слоев
    3. Для оптимальной обработки вибромы вырежьте прямоугольные блоки тканей примерно на 8 мм х 8 мм х 8 мм скальпелем из более крупного образца ткани. Для небольших биопсий пропустить этот шаг и перейти к агарозы встраивания.
  2. Встраивание сердечной ткани в низкоплавильную агарозу
    1. Отварить 400 мг низкоплавильной точки агарозы в 10 мл раствора резки в стеклянном стакане.
      ВНИМАНИЕ: Носите перчатки и защитные очки, чтобы избежать ожогов. Ручка горячей стеклянной посуды только с износом теплозащиты.
    2. Заполните шприц 10 мл горячим, растворенным гелем агарозы. Печать шприца и дайте агарозе уравночные в 37 градусов по Цельсию водяной бане, по крайней мере 15 мин.
    3. Используйте типсы, чтобы поместить обрезанный образец сердца или биопсию в чистое блюдо культуры ткани 35 мм с эпикардием лицом вниз и удалить избыток жидкости с стерильным тампоном.
    4. Налейте уравновешенную агарозу (шаг 3.2.2) на ткань, опорожнив шприц. Закрепим ткань от движения щипсями при заливке агарозы. Убедитесь, что ткань полностью погружена в агарозу.
    5. Немедленно поместите блюдо на лед и дайте агарозе затвердеть в течение 10 минут.
  3. Нарезка миокарда
    1. Накрените новое лезвие бритвы к держателю лезвия вибромы и откалибровать виброму, регулируя z-отклонение лезвия, если это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует вибром с инфракрасным калибровочные устройства для выравнивания лезвия в горизонтальном положении с минимальным z-отклонения (измеренное отклонение lt;0.1 мкм).
    2. Используйте скальпель, чтобы выкавырить блок агарозной ткани, который подходит владельцу образца вибромы. Для обеспечения стабильности убедитесь, что ткань по-прежнему достаточно погружена в агарозу (края агарозы - 8 мм).
    3. Зафиксировать блок агарозы к держателю образца с тонким слоем клея цианоакрилата и нежным давлением.
    4. Поместите держатель образца с тканью в вибромную ванну. Заполните ванну раствором для резки и держите при 4-6 градусов по Цельсию на протяжении всей обработки дробленым льдом, заполненным внешним охлаждающим баком вибромы.
    5. Создать 300 мкм толщиной ломтики с прогресся скоростью 0,1 мм / с, колеблющейся частотой 80 Гц, боковой амплитуды 1,5 мм, и угол лезвия 15 ". При обработке ломтиков, держать агарозу вместо самой ткани, чтобы избежать повреждения тканей. При необходимости храните ломтики в растворе для резки при 4 градусах Цельсия максимум 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты ориентированы параллельно эпикардию. Поэтому важно, чтобы сократить параллельно эпикардии, чтобы избежать чрезмерного повреждения миоцитов. Для изоляции рекомендуется отказаться от первых 1-3 ломтиков, так как для изоляции следует использовать только однородные ломтики постоянной толщины. Для небольших биопсий тканей, однако, только отказаться от первого ломтика.
    6. Проверьте выравнивание кардиомиоцитов под стандартным световым микроскопом с увеличением в 40-100 раз.

4. Пищеварение тканей

  1. Поместите тепловую пластину на лабораторный шейкер и подогрейте ее до 37 градусов по Цельсию. Запустите лабораторный шейкер при 65 об/мин.
  2. Растворите протеиназу (подготовленную в шаге 1.3) в 2 мл раствора 1 (шаг 1.1 и 1.2) и инкубировать при 37 градусах цельсия до использования. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
  3. Растворите коллагеназу (подготовленную в шаге 1.4) в 2 мл раствора 1 (шаг 1.1 и 1.2) и инкубировать при 37 градусах цельсия до использования. Не смешивайте протеиназу и коллагеназу.
    ВНИМАНИЕ: Носите защитные очки и перчатки, потому что растворенные ферменты могут вызвать повреждения кожи и глаз.
  4. Добавьте хлорид кальция (CaCl2) в коллагеназу, содержащую раствор (подготовленный в шаге 4.3) к окончательной концентрации 5 МКМ.
  5. Используйте типсы для переноса ломтика ткани из вибромной ванны в чистую 60-мм культурную тарелку из ткани диаметром 60 мм, наполненную 5 мл предварительно обрезаемого раствора (шаг 1.1 и 1.2) и держите на льду.
  6. Аккуратно удалите агарозу из миокарда с помощью лезвия или типса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте избыточного напряжения и стрижки нагрузку на ломтики миокарда, потому что они могут повредить кардиомиоциты.
  7. Для выполнения первоначального мытья, поместите чистую 35 мм ткани культуры блюдо на тепловой пластине и заполнить его с 2 мл довоенной (37 градусов по Цельсию) раствор 1. Перенесите 1-2 ломтика миокарда в приготовленное блюдо с типсами. Аспирировать раствор с 1 мл пипетки и выполнять шаги мытья 2x, чтобы удалить остатки режущего раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не аспирировать сердечные ломтики. Растворы и ломтики должны оставаться при постоянной температуре 35 градусов по Цельсию на взволнованной тепловой плите. При необходимости отрегулируйте температуру тепловой плиты.
  8. Удалить раствор 1 из блюда и добавить 2 мл раствора протеиназы (шаг 4.2). Инкубировать в течение 12 минут на тепловой плите при 65 об/мин.
  9. Вымойте 2x с 2 мл довоенированного раствора 1 (37 градусов по Цельсию).
  10. Удалить раствор 1 из блюда и добавить 2 мл раствора коллагеназы (шаги 4,3 и 4,4). Инкубировать не менее 30 минут на тепловой плите при 65 об/мин.
  11. Проверьте бесплатно отдельные миоциты на 30, 35, 40 минут и т.д., поместив блюдо под легким микроскопом. Работайте быстро, чтобы избежать значительного охлаждения раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое время пищеварения может варьироваться в зависимости от конституции тканей и степени фиброза. Как только ткань становится заметно мягкой и разобщается легко, когда мягко вытащил, оптимальное время пищеварения было достигнуто. При наличии достаточного количества тканей, несколько ломтиков можно усваить параллельно с различным временем пищеварения.
  12. Когда ткань переваривается и отдельные миоциты видны (шаг 4.11), мыть 2x с 2 мл довоенного раствора 2 (37 градусов по Цельсию) и заполнить снова с 2 мл.

5. Диссоциация тканей

  1. Отмежеваться переваренной ткани ломтиками с типсами, тщательно потянув волокна друг от друга.
  2. Аккуратно пипетка несколько раз с одноразовым пипеткой Pasteur (диаметр открытия 2 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование типсов и пипетки может вызвать механический стресс и вызвать повреждение кардиомиоцитов. Тем не менее, это важный шаг для разделения клеток. Используйте тонкие типсы, чтобы свести к минимуму повреждение клеток и тщательно разобщить ломтики на более мелкие кусочки.
  3. Проверьте наличие освобожденных родообразных кардиомиоцитов под световым микроскопом.

6. Реинтродукция физиологической концентрации кальция

  1. Медленно увеличьте концентрацию кальция с 5 МКМ до 1,5 мМ при агитации при температуре 35 градусов по Цельсию на тепловой пластине. Используйте 10 мМ и 100 мМ. CaCl2 фондовых решений. Рекомендуемые шаги: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1200, 1500 МКМ. Разрешить клеткам адаптироваться к повышенным уровням кальция в 5 мин инкубационых интервалов между каждым шагом.
  2. Удалите непереваренные куски ткани тщательно с типсами или фильтровать подвеску клетки через нейлоновую сетку с размером 180 мкм поры в конце увеличения кальция.

7. Удаление механического размеханого агента

  1. Остановите агитацию и медленно удалите одну треть раствора (700 мкл) сверху с помощью пипетки 1000 мкл. Избегайте аспирации кардиомиоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если непереваренная ткань была удалена, кардиомиоциты будут накапливаться в центре блюда, что облегчает стремление клеточного раствора. Если нет, перенесите клеточный раствор в трубку центрифуги 15 мл и дайте клеткам отбросить осадок в течение 10 мин при 35 градусов по Цельсию, затем аспирировать 700 мкл супернатанта и выбросить, повторно использовать клетки, перенести их обратно в 35-мм культурную тарелку ткани и продолжить шаг 7.2.
  2. Добавьте 700 МКЛ раствора 3 в клетки, возобновите агитацию на тепловой плите и инкубировать в течение 10 мин.
  3. Повторите шаги 7.1 и 7.2.
  4. Перенесите раствор в центрифугу 15 мл трубки и дайте кардиомиоцитам от осадки в течение как минимум 10 минут и максимум 30 минут при комнатной температуре или спина при 50 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант полностью и resuspend в измененном растворе Tyrode или желаемого буфера экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты могут храниться в растворе модифицированноготирода (таблица 1) в течение нескольких часов при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 перед использованием.
  5. Прояви качество клеток стандартным световым микроскопом при увеличении в 40 и 200 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 30-50% кардиомиоцитов должны быть стержнеобразными, гладкими без мембранных пятен и отображать четкие перекрестные полосы. Только 5-10% жизнеспособных клеток должны показывать спонтанные сокращения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для проверки эффективности изоляции протокол использовался с крысиным миокардом, и полученное в результате этого число жизнеспособных миоцитов сравнивали с числами, полученными в результате изоляции через коронарную перфузию и изоляции от небольших кусков ткани (изоляция куска, Рисунок 2). Изоляция и изоляция от ломтиков тканей выполнялись из тех же сердец. Для изоляции через коронарную перфузию, однако, все сердце было использовано. Коронарная перфузия дала преимущественно стержнеобразные и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя изоляция живых кардиомиоцитов была создана более 40 лет назад и до сих пор является необходимым условием для многих экспериментальных подходов в кардиологических исследованиях, она остается сложной техникой с непредсказуемыми исходами. Кардиомиоцитная изоляция через перфузию коронарных артерий с ферментным раствором обычно используется для сердец мелких животных и дает большое количество жизнеспособных клеток. Однако для этого требуется относительно сложная система и экспертиза. Кроме того, большинство образцов ткан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Андреаса Диндорфера из Вальтер-Брендель-Центр экспериментальной медицины, LMU Мюнхен, за помощь в нарезке протокола. За предоставление образцов миокардной ткани мы хотели бы поблагодарить Газали Минабари и Кристиана Хейма из кафедры кардиохирургии, университетской больницы Эрланген, Хендрика Милтинга из Института Эриха и Ханны Клессманн, Рур-Университета Бохума и Муханнада Алкассара из кафедры детской кардиологии Университетской больницы Эрлангена. За поддержку цитометрии потока мы хотели бы поблагодарить Симона Вёлькла и коллег из центра трансляционных исследований (TRC), Университетской больницы Эрлангена. Мы также хотели бы поблагодарить Лоренца МакКарго и Селин Грёнингер из Института клеточной и молекулярной физиологии Эрлангена за отличную техническую поддержку.

Эта работа была поддержана JK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований), Междисциплинарный центр клинических исследований (ИЗКФ) в университетской больнице Университета Эрланген-Нюрнберга, и Universit'tsbund Эрланген-Нюрнберг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химикаты>
2,3-бутандионмоноксимКарл Рот3494,1Чистота>99%
Бычий сывороточный альбуминКарл Рот163,2
CaCl<суб>2Карл Рот5239,2
Моногидрат креатинаАльфа АезарB250009
глюкозаMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3
KClCarl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
L-глутаминовая кислотаFluka Biochemica49450
Низкая температура плавления агарозыCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OКарл РотA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClКарл Рот9265.1
NaHCO3Roth8551.2
ПараформальдегидSigma AldrichP6148
ТауринSigma AldrichT8691
Dyes
Di-8-ANEPPSThermo Fisher ScientificD3167
Fluo-4 AMThermo Fisher ScientificF14201
FluoVoltThermo Fisher ScientificF10488
Enzymes
Коллагеназа CLS типа IWorthingtonLS004196Используется для тканей человека в концентрации 4 мг/мл
(активность: 280 Ед/мг)
Коллагеназа CLS типа IIWorthingtonLS004176Используется для тканей крыс в концентрации 1,5 мг/мл
(активность 330 Ед/мг)
Протеаза XIVSigma AldrichP8038Используется для тканей крыс в концентрации 0,5 мг/мл
(активность ≥ 3,5 Ед/мг)
Протеиназа XXIVSigma AldrichP5147Используется для тканей человека в концентрации 0,5 мг/мл
(активность: 7-14 Ед/мг)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)BD Bioscience649225
Центрифужная пробирка, 15 млCorning430790
, 50 млCorning430829
Компактный шейкерЭдмунд Бьюумл; hlerKS-15 B controlНаправление перемешивания: горизонтальное
Одноразовые пластиковые пастер-пипеткиCarl RothEA65.1Для тритурации клеток используйте только пипетки с внутренним диаметром наконечника ≥ 2 мм
ЩипцыFST11271-30
HeatblockVWRBARN88880030
Нейлоновый сетчатый фильтр, 180 &; mMerckNY8H04700
TC Dish 100, StandardSarstedt83.3902
TC Dish 35, StandardSarstedt83.3900
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001включает VibroCheck для инфракрасной коррекции z-отклонения
Carl Центрифужная пробирка

Ссылки

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи