Оптогенетическая активация афферентных путей в срезах мозга и модуляция реакций летучими анестетиками

Summary

Срезы мозга ex vivo могут быть использованы для изучения влияния летучих анестетиков на вызванные реакции на афферентные входы. Оптогенетика используется для независимой активации таламокортикальных и кортикокортикальных афферентов к непервичной неокортексе, а синаптические и сетевые реакции модулируются изофлураном.

Abstract

Анестетики влияют на сознание частично через свои действия на таламокортикальные цепи. Однако степень, в которой летучие анестетики влияют на различные клеточные и сетевые компоненты этих цепей, остается неясной. Срезы мозга ex vivo обеспечивают средство, с помощью которого исследователи могут исследовать дискретные компоненты сложных сетей и распутывать потенциальные механизмы, лежащие в основе воздействия летучих анестетиков на вызванные реакции. Чтобы изолировать потенциальные эффекты лекарств, специфичных для типа клеток и путей, в срезах мозга исследователи должны быть в состоянии независимо активировать пути афферентных волокон, идентифицировать неперекрывающиеся популяции клеток и применять летучие анестетики к ткани в водном растворе. В этом протоколе описаны методы измерения оптогенетически вызванных реакций на два независимых афферентных пути к неокортексу в срезах мозга ex vivo. Внеклеточные реакции регистрируются для анализа сетевой активности, а целевые записи зажимов цельноклеточного пластыря проводятся в соматостатин- и парвальбумин-положительных интернейронах. Описана доставка физиологически значимых концентраций изофлурана через искусственную спинномозговую жидкость для модуляции клеточных и сетевых реакций.

Introduction

Летучие анестетики повсеместно используются в различных клинических и академических условиях уже более века. Различные классы анестетиков имеют уникальные, часто не перекрывающиеся молекулярные мишени ^1,2,3, но почти все они вызывают бессознательное состояние. Хотя их поведенческие эффекты вполне предсказуемы, механизмы, с помощью которых анестетики вызывают потерю сознания, в значительной степени неизвестны. Анестетики могут в конечном итоге влиять как на уровень, так и на содержание сознания посредством действий на кортикоталамические цепи, нарушая интеграцию информации по всей корковой иерархии ^4,5,6,7,8,9. В более широком смысле, модуляция кортикоталамических цепей может играть роль в экспериментально¹⁰ или фармакологически¹¹ измененных состояниях сознания, а также может быть вовлечена в сон¹² и в патофизиологические расстройства сознания^13,14.

Неуловимость механизмов, лежащих в основе потери и возвращения сознания во время анестезии, может быть частично объяснена нелинейными, синергетическими действиями анестетиков на клеточном, сетевом и системном уровнях¹⁵. Изофлуран, например, подавляет активность в выбранных областях мозга 16,17,18, ухудшает связь между удаленными областями мозга 19,20,21,22,23 и уменьшает синаптические реакции специфическим для пути способом ^24,25 . Какие эффекты анестетиков, от молекулярного до системного уровня, необходимы или достаточны для потери сознания, остается неясным. В дополнение к существенным клиническим исследованиям сознания с использованием неинвазивных методов 19,20,26, важно, чтобы экспериментаторы стремились распутать различные клеточные и сетевые взаимодействия, которые обслуживают сознательный опыт.

Упрощая сложные взаимодействия, обнаруженные в неповрежденном мозге, срезы мозга ex vivo позволяют изучать изолированные компоненты динамических систем мозга⁹. Препарат с уменьшенным срезом сочетает в себе преимущества относительно неповрежденных анатомических структур локальных нейронных цепей с универсальностью манипуляций in vitro. Однако до недавнего времени методологические ограничения препятствовали изучению синаптических и цепных свойств дальнобойных входов в срезах мозга ^27,28; извилистый путь кортикоталамических волоконных трактов сделал активацию независимых афферентных путей практически невозможной с помощью электрической стимуляции.

Изучение влияния анестетиков на препараты среза мозга создает дополнительные проблемы. При отсутствии интактной дыхательной и кровеносной системы обезболивающие средства должны применяться в ванне, а концентрации тщательно сопоставляться с расчетными концентрациями в месте воздействия. Для многих внутривенных анестетиков медленная скорость уравновешивания в тканях делает традиционные фармакологические исследования трудоемкими^29,30. Исследование влияния летучих газовых анестетиков в препаратах ex vivo является более сговорчивым, но также представляет собой проблемы. К ним относятся преобразование ингаляционных доз парциального давления в водные концентрации и необходимость модифицированной системы доставки лекарственного средства в ткани через искусственную спинномозговую жидкость³¹.

Здесь описаны методы, с помощью которых исследователи могут извлечь выгоду из хорошо документированных физико-химических свойств летучего анестетика изофлурана для доставки лекарств в срезы мозга ex vivo, активировать специфические для пути и слоя входы в область коры, представляющую интерес, с высоким пространственно-временным разрешением и проводить одновременные ламинарные записи и целевые записи зажимов пластырей из отдельных популяций нейронов. В совокупности эти процедуры позволяют исследователям измерять летучие анестетик-индуцированные изменения в нескольких наблюдаемых электрофизиологических свойствах ответа, от синаптического до локального сетевого уровня.

Protocol

Все процедуры с участием животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Медицинской школой Университета Висконсина-Мэдисона и Комитетом по уходу за животными и их использованию.

1. Разведение мышей для экспрессии флуоресцентного репортерного белка в субпопуляциях интернейронов

1. Пара гомозиогичных, cre-зависимых tdTomato самцов мыши с гомозиготной самкой SOM-Cre или гомозиготной pv-Cre самкой мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие специфические нейронные популяции могут быть нацелены с использованием соответствующих линий Cre.
2. Позвольте гетерозиготному потомству созреть, по крайней мере, до 3-недельного возраста, прежде чем продолжить. Для экспериментов, описанных здесь, генотипирование не является необходимым, так как гомозиготные родители производят потомство, которое является гетерозиготным как для клеточного типа-специфического Cre-рекомбиназы, так и для Cre-зависимых репортерных аллелей.

2. Выполнение односторонней стереотаксической инъекции вирусной конструкции

1. Отрегулируйте параметры съемника микропипетки для инъекционных пипеток, как указано в руководстве по эксплуатации прибора (рекомендуемые настройки см. в таблице 1 ). Потяните стеклянную микропипетку.
2. Разбейте кончик острого конца пипетки так, чтобы диаметр наконечника составлял примерно 30 мкм с минимальным сужением на несколько миллиметров.
3. Используя ранее задокументированные процедуры, определитесь с соответствующим титром и объемом вируса, который будет введен. В экспериментах, описанных здесь, инъекции 1,0 мкл (титр: 3,1-5,7 TU/мл) в одностороннем порядке давали хорошие результаты.
4. Наполните весь объем пипетки минеральным маслом. Загрузите пипетку на микрошприц и пропустите небольшое количество минерального масла через наконечник, чтобы наконечник не засорился.
5. Передняя засыпка не менее 1,0 мкл вирусной конструкции. Рекомбинантным аденоассоциированным вирусным вектором, используемым в этих экспериментах, был AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Устройте стерильную драпировку в хирургической зоне. Стерилизуйте инструменты для стереотаксической процедуры и поместите их на драпировку.
7. Обезболивают SOM-tdTomato или PV-tdTomato гетерозиготным животным с использованием изофлурана (3% для индукции, 1,5-2% для поддержания) и кислородной смеси. Периодически подтверждают хирургический уровень анестезии с защемлением пальцев ног на протяжении всей операции. Убедитесь, что животное не выходит за рамки хирургического плана анестезии, контролируя дыхание каждые 10-15 минут.
8. Побрить верхнюю часть головы животного. Нанесите 70% изопропиловый спирт и раствор на основе йода обильно на хирургическую область и офтальмологическую мазь на глазницы для предотвращения высыхания мембраны. Вводят бупивакаин/лидокаин (соотношение 1:1, 1,0 мг/кг) подкожно в хирургический участок для местного анестетика.
9. Поместите животное в стереотаксическую рамку.
10. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез вдоль сагиттальной оси кожи, покрывающей дорсальную поверхность черепа. Втягивайте кожу с помощью щипцов. Увлажняйте череп 0,9% физиологическим раствором по мере необходимости.
11. На поверхности черепа слегка отметьте пересечение передней и боковой координат крестом карандашом. Просверлите отверстие по соответствующим координатам в поперечной плоскости (в мм относительно Брегмы, для инъекции поясной коры (Cg): передней 0,2, боковой 0,3; для задней таламусной (Po) инъекции: задняя 2,25, боковая 3,4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка должна выходить за пределы отверстия заусенца, чтобы обеспечить руководство для точного размещения пипетки.
12. Включите и уравновесьтесь воздушным столом.
13. Перепозиционирование электродного манипулятора стереотаксической рамки под 0° для инъекций в Cg или 45° в корональной плоскости для инъекций в Po.
14. Прикрепите шприцевой насос к электродному манипулятору. Прикрепите контроллер микрошприцевого насоса к шприцевому насосу.
15. Перемещайтесь кончиком пипетки вблизи (но не касаясь) поверхности мозга, на пересечении отметин, созданных в Шаге 2.11. Выдвигайте пипетку со скоростью примерно 1 мм/с вдоль ее продольной оси в мозг либо на 0,9 мм (инъекция в Cg), либо на 3,1 мм (инъекция в Po). Подождите 10 минут, прежде чем продолжить.
16. Вводят 1,0 мкл вирусной конструкции в течение 10 мин (100 нл/мин). Если наблюдается попадание вируса из места введения пипетки, замедляют скорость инъекции до 50 нл/мин.
17. После инъекции подождите 10 мин, прежде чем медленно втягивать инъекционную пипетку.
18. Шов для закрытия разреза кожи головы и введения 2-5 мг/кг мелоксикама подкожно.
19. Прекратить прием изофлурана и контролировать животных во время выхода из наркоза. Позволяют восстанавливаться в соответствии с процедурами, описанными Комитетом по уходу за животными и их использованию, включая дальнейшее введение анальгетиков.

3. Подготовка острых срезов мозга

1. Подождите не менее 3 недель для экспрессии вирусной конструкции перед сбором ткани.
2. Подготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости для процедуры нарезки (нарезка искусственной спинномозговой жидкости, sACSF). Ингредиенты см. в таблице 2 .
3. На протяжении всей процедуры нарезки поставлять sACSF растворенной смесью 95% O₂/5% CO₂ , доставляемой через газовую дисперсионную трубку.
4. Подготовьте ледяную ванну для вибрационного микротома лезвия. Установите ледяную стадию образца на микротом и закрепите сапфировое лезвие на месте для сечения тканей.
5. Обезболивают мышь 3% изофлураном и кислородом до потери корректирующего рефлекса.
6. Обезглавить мышь с помощью гильотины и немедленно погрузить голову в sACSF при температуре 4°C. Чтобы сохранить здоровье тканей, выполните следующие шаги как можно быстрее.
7. Откройте полость черепа, сделав небольшой разрез у основания черепа и аккуратно удалив каждую пластину черепа. Аккуратно удалите подстилающую твердую мозговую оболочку.
8. Пока мозг все еще находится в полости черепа, используйте лезвие бритвы, чтобы удалить мозжечок. Сделайте второй вертикальный разрез вдоль сагиттальной плоскости в левом полушарии, только сбоку от средней линии.
9. Подготовьте тканевый блок к сечению.
   1. Осторожно поднимите мозг из полости черепа. Поместите мозг на фильтровальную бумагу плоской сагиттальной плоскостью вниз. Наведите фильтровальную бумагу на блокирующий шаблон и выровняйте мозг по контуру базового шаблона (дополнительный рисунок 1).
   2. Сделайте два параллельных разреза в корональной плоскости, как указано линиями на шаблоне. Добавьте небольшую каплю sACSF, чтобы фильтровальная бумага оставалась влажной, если это необходимо.
   3. Поместите тканевый блок в 4°C sACSF ненадолго, пока проводится этап 3.8.4.
   4. Нанесите небольшое количество суперклея на стадию ледяного образца.
   5. Поднимите тканевый блок от холодного sACSF. Используйте угол абсорбирующего полотенца, чтобы удалить избыток sACSF. Приклейте заднюю корональную плоскость тканевого блока к стадии образца, при этом дорсальная поверхность мозга обращена к сапфировому лезвию.
10. Соберите корональные срезы мозга толщиной 500 мкм. Поместите интересующие ломтики на нейлоновую сетку (дополнительный рисунок 2) при 34 °C sACSF и дайте контейнеру достичь комнатной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, описанных здесь, электрофизиологические записи были собраны из коронального сечения, центрированного примерно на 2,25 мм позади брегмы, для изучения непервичной сенсорной области, медиальной вторичной зрительной коры (V2MM).

4. Приготовление экспериментальных пакетов с искусственной спинномозговой жидкостью (eACSF), содержащих растворенный летучий анестетик изофлуран

1. Готовят 300 мл запасной смеси 3,0% изофлурана.
   1. В герметичный газовый мешок политетрафторэтилена добавляют ~100 мл 95% O₂/5% газовой смеси_CO2 в 20-30 мл жидкого изофлурана и небольшое количество 0,9% физиологического раствора. Подождите не менее 30 минут, чтобы обеспечить равновесие изофлурана между жидкой и газовой фазами.
   2. Определите количество насыщенного газообразного изофлурана, V_sat, чтобы добавить в запасной мешок, используя следующее уравнение:
      
      где P% _stock - целевой состав запасного газа (3% в данном случае), V_stock - конечный объем запасного газового мешка, P_{изофлуран} - парциальное давление изофлунана при комнатной температуре (~240 мм рт.ст.), а P_total - атмосферное давление (~760 мм рт.ст.).
   3. Добавьте расчетное количество насыщенного газа в пустой газовый мешок и заполните мешок объемом 95% O₂/5% газовой смеси CO₂ , чтобы довести общий объем запасного мешка до 300 мл.
2. Подготовьте 2 л искусственной спинномозговой жидкости для перфузии среза во время эксперимента (экспериментальный ACSF, eACSF). Ингредиенты см. в таблице 2 . Растворить 95% O₂/5% CO₂ газовой смеси в растворе.
3. Приготовьте два отдельных пакета растворов Control и Isoflurane.
   1. В пустой газовый мешок политетрафторэтилена добавить 600 мл eACSF и 600 мл газовой смеси 95% O₂/5% CO₂ . Пометьте этот пакет как Контрольный.
   2. В другой пустой газовый мешок политетрафторэтилена добавьте 300 мл eACSF. Пометьте этот пакет как Изофлуран.
   3. Выберите физиологически значимую уравновешенную концентрацию изофлурана в газовой фазе. Эксперименты проводились с использованием концентраций газа, эквивалентных 1,3% изофлурана. Мыши теряют корректирующий рефлекс и, предположительно, сознание при 0,9% вдыхания изофлурана.
   4. Используйте следующее уравнение для расчета эквивалентной концентрации газовой фазы при комнатной температуре, P%(T_{комната})³¹:
      
      где P%_{(тело T}) - физиологически значимая концентрация газовой фазы, выбранная на этапе 4.3.3,_{T-комната} составляет 25 °C, а_T-тело - 37 °C.
   5. Используйте следующее уравнение для определения объема газа из запасного газового мешка, V_запаса, для добавления в раствор Изофлурана.
      
      где_{V-раствор} - объем eACSF в изофлурановом мешке (300 мл), P%(T_{комната}) вводится из уравнения (2), λ - коэффициент разделения Оствальда на солевой раствор изофлурана (λ = 1,2³²), а _{P% -} концентрация газовой фазы запасного газового мешка (P%_stock = 3,0%).
   6. В мешок для раствора изофлурана добавьте объем газа из запасного газового мешка, V_запаса, рассчитанный на этапе 4.3.5.
   7. В мешок для раствора изофлурана добавьте объем газовой смеси 95% O₂/5% CO₂ , чтобы довести общий объем газа в мешке для раствора изофлурана до 300 мл.
4. Встряхните пакеты Control и Isoflurane на шейкере в течение не менее 1 ч, чтобы обеспечить равновесие фазы изофлурана.
5. После того, как все данные были собраны, правильная концентрация может быть проверена с помощью монитора анестезирующего газа для измерения эквивалентной концентрации газа изофлурана над оставшимся раствором в пакете.
6. Сообщайте об экспериментальных концентрациях летучих газов в водных единицах, поскольку миллимолярные концентрации более устойчивы к изменениям температуры. Используйте следующее уравнение для преобразования концентрации газовой фазы при комнатной_{температуре}, P%(T комнатная), в эквивалентную водную_{концентрацию (C в водном растворе}, в мМ)³¹:
   
   где α - коэффициент разделения соляной соль/газ Бунзена для изофлурана при 25°C³².

5. Подготовка аппаратного и программного обеспечения для многоканальной записи

1. Настройте 16-канальную систему сбора данных в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора многоканальных записей может использоваться несколько коммерчески доступных усилителей и систем сбора данных. В экспериментах, описанных здесь, аналоговые сигналы доставляются через панель сравнения электродов на два усилителя, где они усиливаются (2000x) и фильтруются (0,1-10 кГц). Аналоговые входы в систему сбора данных оцифровываются на частоте 40 кГц.
2. Прикрепите соответствующий 16-канальный адаптер головной ступени к микроманипулятору микроскопа. Ориентируйте адаптер так, чтобы порты разъема были направлены вниз.
3. Отрегулируйте угол работы этого микроманипулятора таким образом, чтобы он был ориентирован вниз к записывающей камере, под углом примерно 70° относительно горизонтали.
4. Подключите вход головной ступени к зонду 16 x 1 для электрофизиологии in vitro через адаптер головной ступени, закрепленный на микроманипуляторе.
5. Подключите выходной разъем головного каскада к системе сбора данных.
6. Установите соответствующее программное обеспечение для сбора данных. Сконфигурируйте 15 входных каналов в соответствии с входными сигналами от первых 15 многоканальных контактов зонда. Сконфигурируйте оставшийся канал для приема входных данных от внутриклеточного электрода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе и анализе данных необходимо учитывать карты электродов и адаптеров, чтобы убедиться, что соответствующий сигнал соответствует контакту электрода, с которого он был собран.

6. Настройка протоколов световой стимуляции

1. Настройте систему доставки света и установите сопутствующее программное обеспечение.
2. Откройте программное обеспечение. Выберите конфигурацию аппаратной проводки, в которой источник триггера (цифровой / TTL-выход) подает сигнал Trigger In в систему доставки света, а система доставки света обеспечивает сигнал Trigger Out на светодиод 470 нм.
3. Установите мощный объектив. Используя цифровую камеру, откалибруйте мощный объектив для использования с системой подачи света.
4. Создайте новую последовательность профилей световой стимуляции.
   1. Создайте шаблон выбора. В экспериментах, описанных здесь, круг диаметром 150 мкм используется для обеспечения послойной активации клемм аксона.
   2. Чтобы создать последовательность профилей, скопируйте и вставьте этот профиль для каждого из любого количества испытаний.
   3. Создайте список осциллограмм, содержащий формы сигналов любой интенсивности света, длительности импульса или номера импульса.
   4. Случайным образом назначайте формы сигналов каждому профилю. Каждый профиль с присвоенной ему формой сигнала соответствует одному триггерному импульсу от входа Digital TTL или одному испытанию.
   5. Сохраните последовательность профилей.
5. В программном обеспечении для сбора данных создайте новый протокол.
   1. Задайте для числа пробных версий равное количеству профилей в только что созданной последовательности профилей.
   2. Выберите сигнальные входы, соответствующие тем, которые настроены на шаге 5.6. Настройте протокол, который обеспечивает один цифровой выход TTL, записывая с этих 16 входных каналов в течение соответствующего периода времени до и после цифрового триггера.

7. Размещение многоканального зонда в срезе мозговой ткани ex vivo

1. Перфьюз пузырьков eACSF (не в герметичных пакетах) при 3-6 мл/мин.
2. Перенесите срез мозга, содержащий интересующую область, на сетку сетки в перфузионной камере микроскопа. Якорь с платиновой арфой (см. Дополнительный рисунок 3).
3. Поверните сетку сетки таким образом, чтобы линия контактов электрода на дистальном конце многоканального зонда была примерно перпендикулярна поверхности пиала.
4. При широкоугольном освещении и под тонким контролем микроманипулятора опустите многоканальный зонд к поверхности среза.
5. Поверните башню куба фильтра, чтобы задействовать соответствующий куб фильтра для визуализации флуоресцентного репортерного белка, экспрессируемого в аксонных терминалах корковых афферентов. При необходимости поверните срез, чтобы более точно выровнять зонд с поверхностью пиала.
6. Расположите зонд чуть выше плоскости среза, ~200 мкм ниже конечного целевого положения вдоль оси X, оставив по меньшей мере один канал за пределами границы регистрируемой области ткани.
7. Медленно вставьте зонд в срез, переместив манипулятор вдоль его продольной оси. Чтобы свести к минимуму повреждение ткани, только продвигайте зонд до такой степени, что острые кончики видны только под поверхностью ткани. Это сведет к минимуму повреждение ткани, в то же время гарантируя, что контакты электродов находятся в контакте с тканью.

8. Зажим пластыря целевых нейронов и получение конфигурации всей клетки

1. Переключите источник eACSF на пакетное решение Control.
2. Определите флуоресцентно меченую ячейку для записи целевого зажима пластыря.
   1. Ограничьте диафрагму диафрагмы до наименьшего диаметра. Задействуйте объектив с низким энергопотреблением и сфокусируйте ткань.
   2. Центрируйте свет над областью ткани, прилегающей к многоканальному зонду (но не перекрывающей его).
   3. Включите мощный (40x или 60x) объектив погружения в воду, соблюдая осторожность, чтобы избежать контакта между многоканальным зондом и объективом.
   4. Поверните башню куба фильтра, чтобы задействовать соответствующий набор фильтров, чтобы обеспечить визуализацию клеток, экспрессирующих cre-зависимый флуоресцентный маркер.
   5. Определите флуоресцентно меченую ячейку в качестве мишени для записи зажимов. Поднимите объектив, чтобы создать достаточно места для опускания патч-пипетки.
3. Загрузите патч-пипетку (см. таблицу 1) внутренним раствором (таблица 2) и установите пипетку в держатель электрода. Используя шприц 1 мл, примените положительное давление, соответствующее ~ 0,1 мл воздуха.
4. Опустите пипетку в раствор. Поместите наконечник пипетки в фокус под визуальным руководством.
5. Получите запись всей клетки из целевой ячейки, используя шаги, ранее продемонстрированные³³.
6. Если планируется оценить изменения внутренних свойств ячейки (например, входное сопротивление, скорость срабатывания потенциала действия в ответ на текущие шаги), проведите эти записи. В противном случае перейдите к протоколу стимуляции аксонов ниже.

9. Послойно-специфическая оптогенетическая активация аксонных терминалей

1. Манипулируйте полем зрения в плоскости x-y, чтобы выровнять профиль световой стимуляции с требуемым местоположением на срезе.
2. Загрузите протокол светового стимула и подготовьте систему доставки света к получению цифрового импульса TTL.
3. Оптогенетически активируют аксонные терминали, одновременно регистрируя потенциалы внеклеточного поля и флуктуации внутриклеточной мембраны.
4. Переключите источник eACSF на раствор Изофлурана и промойте препарат в течение 15 мин. При необходимости соберите спонтанные записи во время стирки.
5. Повторите шаги 9.2-9.3.
6. Переключите источник eACSF на Контрольный раствор и смойте препарат в течение 20 мин. При необходимости соберите спонтанные записи во время промывки.
7. Повторите шаги 9.2-9.3.

Results

Временная шкала шагов, описанных в протоколе, показана на рисунке 1. Корковые входы, поступающие из корковых областей более высокого порядка или из непервичных таламических ядер, имеют частично перекрывающиеся терминальные поля в слое 1 непервичной зрительной коры²⁴. Чтобы выделить независимые таламокортикальные или кортикокортикальные афферентные пути, вводили вирусный вектор, содержащий ChR2 и флуоресцентный репортер eYFP, в Po или Cg. Клетки в радиусе инъекции погл...

Discussion

В этой рукописи описан протокол оценки внутри- и внеклеточных реакций на избирательно активированные афферентные пути в срезах мозга ex vivo.

Использование оптогенетических инструментов и параллельных схем записи позволяет исследователям исследовать реакцию местного населения на афферентные входы из отдаленных областей мозга, одновременно регистрируя из целевых популяций интернейронов. Использование оптогенетической технологии позволяет сохранять и активировать аксонные терминалы афферентных п...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-кратный широкоугольный объектив	Olympus	MPLFLN2,5-кратный
40-кратный водоиммерсионный объектив	Olympus	LUMPLFLN40XW
смесь 95% O2/5% CO2 Воздушный	газ	Z02OX95R2003045
зонд A16	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16-канальный зонд
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Лаборатория Карла Дейссерота, UNC Vector Core
Анестезирующий газоанализатор (POET II)	Criticare	602-3A
ATP, соль магния	Sigma Aldrich	A9187	внутриклеточный раствор
B6. Cg-gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Лаборатория Джексона	007914	Cre-зависимая мышь tdTomato
B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	Лаборатория Джексона	008069	PV-Cre мышь
Танцовщица живота Шейкер	Thomas Scientific	1210H86-TS	для балансировки герметичных газовых мешков
Бетадин раствор	Дженерик марки
Отбеливатель	Дженерик		хлорирования серебра патч-электрод
Бупивикаин
Хлорид кальция (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
(запись патч-зажима)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Боросиликат, Внутренний диаметр: 1,1 мм, Внешний диаметр: 1,7 мм, Длина: 90,0 мм
Капиллярное стекло (вирусные инъекции)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3,5 "
Управление младшим микроманипулятором	Luigs and Neumann	SM8	для управления младшим микроманипулятором
	Luigs and Neumann	SM7	для управления многоканальным электродом и подвижный стол
Digidata 1440A + Clampex 10	Молекулярные приборы	1440A	Дигитайзер и программное обеспечение
E-3603 трубки	Fisher Scientific	14171208	для подачи 95% O2/5% газовой смеси CO2 в инкубационную камеру + приложение давления во время зажима пластыря
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	внутриклеточное решение
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel	Neuralynx	Ушедшая
в отставку пломбировочная игла	World Precision Instruments	50821912	для наполнения пластыря зажим пипетки
Фильтрующий куб для визуализации EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Фильтровальная бумага	Fisher Scientific	09801E	наложить на шаблон среза во время приготовления тканевого блока
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-1000	2,5x2,5 Коробка Нить
Газодисперсионная трубка	Sigma Aldrich	CLS3953312C
Стеклянный шприц (100 мл)	Sigma Aldrich	Z314390	для наполнения газопломбированных пакетов
Глюконовая кислота, Калийная соль (K-глюконат)	Dot Scientific	DSG37020	внутриклеточный раствор
Glucose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Натриевая соль	Sigma Aldrich	G8877	внутриклеточный раствор
Адаптер для зонда	NeuroNexus	A16-OM16	адаптер для подключения 16-канального зонда к входу в голову
Гемостатические щипцы	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, внутриклеточный раствор
HS-16 Headstage	Neuralynx	Вышедший
Изофлуран	Паттерсон Ветеринар	07-893-1389
Изопропиловый спирт (70%)	VWR International	101223-746
Младший микроманипулятор	Луигс и Нейман	210-100 000 0090-R	для манипуляций с патч-зажимным электродом
Модуль управления светодиодным источником света	Mightex	BLS-PL02_US	оптогенетическое управление источником света
Усилитель Lidocaine
Lynx-8	Neuralynx	Выведенный
из эксплуатации Lynx-8 Блок питания	Neuralynx	Выведенный
сульфат магния (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Красный фильтр кубик	Chroma	49008	для визуализации tdTomato флуоресцентный репортер
Meloxicam
Держатель для микропипеток	Fisher Scientific	NC9044962
Микрошприцевой насос	World Precision Instruments	UMP3-4
Минеральное масло	Дженерик марки
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A
Усилитель Азот (для воздушного стола)	Airgas	NI200
Нейлоновая сетка	Fisher Scientific	501460083	натянута на подкову из сплющенной платиновой проволоки, срез опирается поверх этого во время записи
Нейлон, вырезанный из колготок	Дженерик фирменного		мелкого кусочка для создания слайса платформы в инкубационной камере, отдельные волокна для создания платиновой арфы
Офтальмологическая мазь	Fisher Scientific	NC1697520
пипеткой	Dot Scientific	307	Для переноса ткани на оснастку
платиновая проволока	VWR International	BT124000	2 см, сплющенная, для изготовления платиновой арфы
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	оптогенетической системы доставки света, поставляется с программным обеспечением PolyScan2
Potassium Chloride (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Potassium Phosphate (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
Лезвие для бритвы	Fisher Scientific	12-640
Сапфировое лезвие (для вибратома)	VWR International	100492-502
Лезвие для скальпеля	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Герметичный газовый мешок	Fisher Scientific	109236
Подвижный стол для микроскопа	Luigs and Neumann	380FMU
Бикарбонат натрия (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Sodium Chloride (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, внутриклеточный раствор
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	Лаборатория Джексона	013044	мыши SOM-Cre
Стереотаксический инструмент	Kopf	Model 902	Dual Small Animal
Super Glue	Staples	886833	для фиксации тканевого блока на стадии образца во время подготовки среза
Хирургическое сверло	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Шприц Microtorque II
(1 мл) с наконечником LuerLock	Научный 309628 Fisher		для приложения давления во время зажима пластыря
Шприц (1 мл) со скользящим наконечником	WW Grainger, Inc.	19G384	для наполнения пластыря зажим пипетки
Шприцевые фильтры	VWR International	66064-414
Вертикальный микроскоп	Olympus	BX51
Вибрационный микротом	Leica Biosystems	VT1000S
полотенца Wypall	Fisher Scientific	19-042-427