Методическая статья

Подготовка тунца внеклеточной матрицы микроэковранции для оценки Шванн клеток фенотип спецификации

DOI:

10.3791/61496

⸱

2 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта методология призвана проиллюстрировать механизмы, с помощью которых внеклеточные матричные сигналы, такие как жесткость субстрата, состав белка и морфология клеток регулируют фенотип клеток Шванн (SC).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травматические травмы периферической нервной системы (PNS) в настоящее время не имеют подходящего лечения, чтобы восстановить полное функциональное восстановление. Клетки Шванн (SCs), как основные глиальные клетки PNS, играют жизненно важную роль в содействии регенерации PNS путем dedifferentiating в регенеративного фенотипа клеток после травмы. Однако, dedifferentiated состояние SCs является сложной задачей для поддержания в течение периода времени, необходимого для регенерации и влияет на изменения в окружающих внеклеточной матрицы (ECM). Поэтому необходимо определить сложное взаимодействие между ОК и различными ECM для обеспечения сигналов регенеративного потенциала УК. Для решения этой проблемы была разработана стратегия, в рамках которой различные белки ECM были адсоргированны на тунецовый полидиметилсилоксан (PDMS), который обеспечивал платформу, на которой можно модулировать жесткость и состав белка. СК были посеяны на тунецовые субстраты и критические клеточные функции, представляющие динамику фенотипа SC были измерены. Чтобы проиллюстрировать взаимодействие между экспрессией белка SC и клеточной морфологией, различные плотности посева СК в дополнение к отдельным микроконтакт печатных клеточных моделей были использованы и характеризуется иммунофлуоресценции окрашивания и западной пятно. Результаты показали, что клетки с меньшей площадью распространения и более высокой степенью клеточного удлинения способствовали более высоким уровням регенеративных фенотипических маркеров SC. Эта методология не только начинает разгадывать значительную связь между ЭКМ и клеточной функцией ОК, но и содержит руководящие принципы для будущей оптимизации биоматериалов в периферическом ремонте нервов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травмы периферической нервной системы (PNS) остаются серьезной клинической проблемой в здравоохранении, ставя под угрозу качество жизни пациентов и создавая значительное влияние через множество социально-экономическихфакторов 1,2. Клетки Шванн (SC), как основные глиальные клетки в PNS, обеспечивают необходимые молекулярные и физические сигналы, чтобы вызвать регенерацию PNS и помощь в функциональном восстановлении в коротких травм разрыва. Это связано с замечательной способностью SCs dedifferentiate в "ремонт" фенотип клеток из миелиниации или Фенотип Remak3. Ремонт SC является отличительным фенотипом клеток несколькими способами. После травмы, SCs увеличить их скорость распространения путем повторного ввода клеточного цикла и начать выражение нескольких транскрипционых факторов для облегчения reinnervation. Эти факторы, такие как c-Jun и p75 NTR, регулируются в то время как миелинирующие маркеры SC, такие как миелин основной белок (MBP), являются вниз регулируется4,5. Кроме того, УК изменить морфологию, чтобы стать удлиненными и выровнены друг с другом, чтобы сформировать Бюнгнер полосы по всей травмы сайта6. Это обеспечивает физический механизм наведения для аксонов, чтобы распространиться на правильную дистальную цель7. Однако, несмотря на способность, которой обладают РК, содействовать регенерации нервов при коротких травмах, результат функционального восстановления остается плохим при тяжелых травмах. Отчасти это связано с потерей внеклеточной матрицы (ECM) наведения сигналов, а также неспособностью ОК поддерживать регенеративный фенотип в течение длительных периодоввремени 8.

Процесс регенерации нерва и восстановления тесно связаны с состоянием базальной ламины после травмы. Базальная ламина представляет собой слой ECM вокруг нерва, который облегчает руководство и обеспечивает ECM-связанные сигналы для аксонов и ОК в тех случаях, когда он остается нетронутым после травмы9. Состояние ECM и его способность доставить матрицы связаны сигналы к клеткам является жизненно важным и ранее были изучены в различных контекстах10,11,12,13,14. Например, было показано, что жесткость ECM может направлять функции клеток, такие как пролиферация и дифференциация11,,15,,16. Состав ECM может также привести к четкой клеточной реакции и регулировать поведение клеток, таких как миграция и дифференциация через внутриклеточные сигнальные пути17,,18. Кроме того, морфология клеток, включая область распространения и клеточное удлинение, играет важную роль в регулировании функции и может регулироваться ECM-связанными сигналами19,,20. Многие предыдущие исследования были сосредоточены на стволовых клеток дифференциации в определенных линий, но РК обладают аналогичной способностью изменять фенотип из гомеостатических, взрослых SC в здоровом нерве, чтобы ремонт SC способны выделять белки и факторы роста при реконструкции ECM после травмы нерва5,21. Поэтому особенно важно определить механизмы, лежащие в основе взаимосвязи между врожденной регенеративной способностью SC и связанными ЭКМ сигналами для понимания, чтобы в конечном итоге использовать эту способность для регенерации нервов.

Для решения этой проблемы мы разработали подробную методологию для создания субстрата клеточной культуры, где механическая жесткость и тип лиганда могут быть легко настроены в физиологически соответствующих диапазонах. Polydimethyl siloxane (PDMS) был выбран в качестве субстрата из-за его высокой тунецовой механики по сравнению с полиакриламидным гелем, где максимальный модуль Янг составляет около 12 кПа контрастирует с PDMS около 1000 kPa22,23,24. Это полезно для работы под рукой, так как недавние исследования показали, что модули Янга седалищного нерва может превышать 50 кПа во время разработки, тем самым предполагая, что диапазон жесткости нервов в PNS шире, чем ранее изучены. Различные белки способны адсорбции на субстраты PDMS для анализа комбинаторной регуляции механики и лигандов на поведение SC. Это позволяет исследовать несколько микроокрументальных сигналов, присутствующих в процессе регенерации PNS, и сравнить высокую степень настраиваемости с работой, фокусясь исключительно на жесткости субстрата25. Кроме того, эти инженерии субстратов клеточной культуры совместимы с множеством методов количественного анализа, таких как иммуногистохимия, западная помарка, и количественная полимеразная цепная реакция (q-PCR).

Эта разработанная платформа клеточной культуры очень подходит для анализа механистических путей из-за высокого уровня индивидуальной настройки каждого сигнала, связанного с ECM. Кроме того, популярные методы микропаттернирования клеток, в том числе микроконтактная печать, могут быть достигнуты на субстратах, чтобы позволить для контролируемой клеточной адгезии для анализа формы клеток по отношению к другим ECM связанных сигналов24. Это имеет решающее значение, поскольку линейные узорчатые субстраты, которые способствуют удлинению популяций клеток, служат инструментом для имитации и изучения удлиненной и регенеративной ОБЛАСТИ в диапазонах Бюнгнера во время регенерации нервов. Кроме того, клеточная морфология является мощным регулятором нескольких функций клеток и потенциально может ввести смешанные экспериментальныерезультаты,если не контролируется26,27. Значительное внимание в настоящее время уделяется механизмам, регулирующим SC регенеративного фенотипа, регулируемых ECM сигналы28,29,30. Это необходимо для того, чтобы дать представление о дизайне биоматериалов, которые могут быть применены в качестве нервных каналов для помощи в регенерации нервов PNS. Эти подробные протоколы в конечном счете могут быть применены в качестве потенциального инструмента для расшифровки механизмов SC и других функций типа клеток, регулируемых ECM связаны сигналы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка и характеристика субстрата культуры тунецовой культуры

  1. Подготовка субстрата
    1. Смешайте основу PDMS elastomer и отбиваете агенты, энергично разъездяйте наконечник пипетки в соотношении между 10:1 и 60:1 до тех пор, пока пузырьки не будут однородно рассеяны внутри смеси. Удалите пузырьки с помощью вакуумной высыхания, пока пузырьки не рассеиваются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время полимеризации PDMS, отмывение агента перекрестные ссылки с базовым эластомером, чтобы обеспечить окончательные полимерные желаемые механические свойства. Коэффициенты crosslink могут быть скорректированы, чтобы изменить жесткость PDMS.
    2. Поместите каплю (0,2 мл) высушенного PDMS смеси на квадратный или круговой крышкой (например, 22 мм х 22 мм) и поверните крышку на спиновой шерсти при 2500 об/мин на 30 с.
    3. Инкубировать крышки либо в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 1-2 ч или комнатной температуры на ночь для PDMS укрепить.
    4. Лечить крышки с помощью УФ-Озон очиститель в течение 7 мин (УФ длина волны: 185 нм и 254 нм) для увеличения поверхности гидрофильной. Поместите его в стерилизованную 6-хорошую тарелку.
    5. Перед использованием для клеточной культуры, инкубировать субстраты в 70% этанола, по крайней мере 30 мин.
      ВНИМАНИЕ: УФ-озон очиститель может генерировать озона, который является вредным для человека. Работайте в химическом капюшоне или с той или иной формой вентиляции.
    6. Погрузите крышки в белковый раствор (10 мкг/мл коллагена I, фибронектина или ламинина) в течение 60 минут в стерильный инкубатор при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После уф-озонной обработки, поверхность PDMS все еще может быть гидрофобной. Поверните плиту скважины, чтобы гарантировать, что каждый налокотый раствор покрывается белковым раствором.
    7. Аспирировать белковый раствор и промыть крышку с фосфатом буферизированного солевого раствора (PBS) 3x.
    8. Повторно приостановить RT4-D6P2T Шванн клеточной линии (SCs) от проходимого блюдо с использованием коммерчески доступных EDTA решение (1x) с 2,5% трипсина и считать клетки с гемоцитометром. Семенные SCs на поверхности tunable PDMS при желаемой плотности клеток. Плотность посева SC может варьироваться для каждого приложения.
    9. Поддержание клеток в желаемых параметрах клеточной культуры (90% влажности, 5% CO2,37 градусов по Цельсию и т.д.) на протяжении длительного эксперимента. Используйте модифицированную Eagle Medium (DMEM) Dulbecco, дополненную 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином в качестве среды клеточной культуры.
  2. Препарат микропаттернированного субстрата
    1. Нарисуйте желаемую геометрию и клейкую зону клеток (900 мкм2,1600 мкм2 и 2500 мкм2) с помощью программного обеспечения с помощью компьютерной конструкции (CAD). Создайте хромированную фотомаск на основе этих шаблонов от коммерческого поставщика.
    2. В чистой комнате или без пыли окружающей среды, используйте стандартные методы фотолитографии для изготовления кремниевых пластин (протоколы подробно в другом месте31). Критические параметры для данного приложения таковы: Фотореалист: СУ-8 2010; Спин-профиль для разгона фотореалиста: 500 об/мин при 10 с с ускорением 100 об/с, затем 3500 об/мин на 30 с с ускорением 300 об/с; Энергия воздействия УФ-излучения: 130 мДж/см2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высота узоров на кремниевых пластинах составляет примерно 10 мкм после этих параметров. Потенциальные трещины по краю за пределами прямоугольных или треугольных узоров можно увидеть с помощью светового микроскопа после шага 1.2.2. Выпекание кремниевых пластин при 190 градусов по Цельсию в течение 30 минут помогает устранить трещины.
    3. Поместите узорчатые кремниевые пластины внутри круговой 150 мм диаметром х 15 мм высотой Петри блюдо и залить де-газированные PDMS (смешение соотношение 10:1), как подготовлено в шаге 1.1.1 на кремниевую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что толщина PDMS составляет не менее 5 мм для простоты обработки во время шагов микроконтактной печати.
    4. Затвердеть PDMS на кремниевых пластин в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в одночасье. Дайте PDMS остыть до комнатной температуры. Точно вырезать марки 30 мм х 30 мм квадратов, содержащих правильные узоры из кремниевых пластин с помощью хирургического скальпеля. Не повреждайте кремниевую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконовые пластины могут быть повторно повторно много раз на данный момент производить больше марок после очистки с изопропанол.
    5. Стериллизовать марки PDMS и тунецы (подготовлены в шаге 1.1.1 до 1.1.3) путем погружения их в 70% этанола в течение 30 мин.
    6. Чтобы подтвердить эффективность микропаттерна по маркам PDMS после микроконтактной печати, высушите поверхность марок PDMS с помощью фильтрованного воздушного потока и пипетки 50 мкг/мл BSA (Texas Red conjugated) решение для покрытия всей узорной стороны марки PDMS.
    7. Инкубировать марки PDMS раствором BSA на 1 ч при комнатной температуре, чтобы обеспечить адсорбцию белка.
    8. Высушите поверхность тунец с помощью фильтрованного воздушного потока, увеличьте поверхностную гидрофиличность, как описано в шаге 1.1.5.
    9. Воздух высушивает марки PDMS, чтобы удалить оставшееся решение BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы решение BSA было полностью удалено из штампа, поскольку любое оставшееся решение приведет к тому, что марки сползут на обложке во время микроконтактной печати.
    10. Принесите узорчатую сторону штампа в конформный контакт с тунецом для адсорбции BSA на поверхности крышки. Аккуратно нажмите штамп на крышку в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не применяйте чрезмерную силу на штампе, так как он будет согнуть и вызвать неспецифический контакт между печатью и крышкой. Соответствующее количество силы, применяемой на марке, имеет важное значение для успешной микроконтактной печати.
    11. Изучите микропаттерн с помощью флуоресценционного микроскопа с фильтром FITC (Fluorescein isothiocyanate).
    12. Для печати клеток клея областях, а не флуоресцентные узоры, заменить ламинин для белка BSA и повторить шаг 1,2,5 до 1,2,10.
    13. Удалите марки с крышки, передача coverslips в стерилизованной 6-хорошо пластины. Добавьте 2 л 0,2% w/v Pluronic F-127 раствор в каждый колодец, чтобы покрыть поверхность крышки и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Pluronic F-127 может быть адсоргируется на поверхность PDMS увеличения гидрофобности поверхности PDMS, чтобы блокировать клетки от сцепления.
    14. Aspirate Pluronic F-127 раствор и мыть 5x с PBS и 1x с клеточной культуры среды перед посевом клеток. Типичная плотность посева для СК составляет 1000 ячеек/см2.
    15. 45 мин после посева клеток, удалить клеточную культуру среды и мыть coverslips с PBS 2x, чтобы предотвратить несколько УК от придерживаясь той же модели. Поддержание клеток в желаемой среде клеточной культуры в течение 48 ч до количественной оценки.
    16. Для создания линейных клеточных клеточных клеточных субстратов для изучения выровненных ячеек следуйте шагу 1.2.1 до 1.2.4 для создания марок для микроконтактной печати.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры паза/хребта выровненных узоров на штампе составляют 50 мкм х 50 мкм для клеток, очерченных. Общие размеры марки 10 мм х 10 мм.
    17. Разрежьте марки на размеры, содержащие только желаемые шаблоны линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При создании марок в CAD, непаттернированная область штампа вокруг линии шаблонов будет соответствовать области клея клеток после микроконтактной печати. Таким образом, необходимо устранить непаттернированные участки при вырезании штампа, чтобы гарантировать, что каждый SC посеян на поверхности следует шаблонам.
    18. Следуйте шагу 1.1.1 до 1.1.3, чтобы подготовить тунец PDMS поверхности покрытия двух чашек Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет PDMS покрытие поверхности чашки Петри себя, а не на крышке.
    19. Следуйте шагу 1.2.5 до 1.2.10 для выполнения микроконтактной печати для печати линейных клеток клеток на одной из посуды с покрытием PDMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь поверхности 60 мм х 15 мм Петри блюдо может содержать линейные узорные области от 6 марок PDMS.
    20. Снимите марки и заполните чашку Петри 4 мЛ 0,2% w/v Pluronic F-127 раствором и инкубировать за 1 ч.
    21. После микроконтактной печати, промыть каждую сторону pdMS марки с 70% этанола 3x и сухой с воздухом. Поверните марки PDMS и следуйте шагу 1.2.5 до 1.2.10, чтобы распечатать непаттернированную область клея ячейки, используя непаттернированную сторону марки на второй чашке Петри. Повторите шаг 1.2.13.
    22. Aspirate F-127 решение из посуды, мыть 3x с PBS следуют с 1x мыть с использованием свежих средств культуры клеток. Семенные SC на посуде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева для линейного блюда составляет 5000 клеток/см2, а для непаттернированного блюда – 10 000 клеток/см2.
    23. Поддерживайте СК в желаемых условиях 48 ч и следуйте протоколам для подготовки СК облият32.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева клеток для непаттернированных блюд в 2 раза выше, чем для линейных блюд, так как линейное блюдо имеет только половину клеточного клея области непаттернированного блюда.
      1. Для подготовки лизатов перенесите адекватный радиоиммунопреципитациочный анализ (RIPA) в коническую трубку 10 мЛ конической центрифуги. Разбавленный протеазы и ингибитор фосфатазы (100x) в соотношении 1:100 в буфере RIPA, хорошо перемешать по пипетки.
      2. Вымойте клетки с ледяной PBS (1x) в течение 2 минут, добавьте 80 мл раствора, подготовленного с шага 1.2.23.1 на каждую область клея клетки (область, которая контактировала с марками PDMS и адсордным белком) в чашках Петри. Инкубировать клетки раствором на ледяной глыбе в течение 15 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Решение будет оставаться только на клеточной области клея из-за гидрофобности Pluronic F-127 адсорбции в другом месте. Эта функция позволяет успешно и достаточно извлечения белка для линии узорчатых ХК.
      3. Scrape SCs с сотовым скребком в течение 5 мин. Соберите лизат в помеченную 1,5 мл микроцентрифугую трубку.
      4. Микроцентрифуга обетует при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусов цельсия. Соберите супернатант с пипетки 1000 мл и перенесите на чистую микроцентрифугую трубку. Храните ячейку лисировать при -20 градусов по Цельсию.
  3. Характеристика субстрата
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для характеристики механики полимера на крышке, несколько методов, как правило, используются в том числе объемные испытания сжатия11,33 или атомной силы микроскопии тестирования34. В этом протоколе будет наметить массовое тестирование сжатия.
    1. Налейте предшественник PDMS желаемого коэффициента смешивания (шаг 1.1) в 30 мм чашку Петри, убедитесь, что толщина слоя PDMS в чашке Петри составляет не менее 20 мм.
    2. Снимите чашку Петри с затвердевшей PDMS из духовки 60 градусов по Цельсию после 1 ч и дайте остыть при комнатной температуре. Нарежьте полимер 10 мм х 10 мм квадратов. Измерьте толщину PDMS с помощью калиперов.
    3. Поместите PDMS на сцене измерительной машины силы сжатия. Подключите датчик силы сжатия (модель: 112C) для подачи датчика порта и крепите датчик к оси испытательного аппарата.
    4. Отрегулируйте высоту датчика примерно на 0,5 см над маркой PDMS с помощью "jog" управления на передней панели прибора.
    5. Откройте связанное программное обеспечение с помощью окна"Test Setup", выберите "Профиль Servo, и откройте окно"Сегмент". В окне"Сегмент" входные данные желаемого "Контрольная ставка" и "Конечная сумма" для теста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость управления определяет скорость, с которой датчик движется вниз к PDMS. Конечная сумма определяет общее расстояние, которое проходит датчик.
    6. Используйте кнопку«Я»,расположенную на панели управления программного обеспечения, чтобы сбросить все измерения в этой точке.
    7. Переместите датчик вниз, чтобы слегка связаться с PDMS до тех пор, пока не будут загружены 1-2 ньютона (N). Загрузка и расстояние, которое проходит датчик, будут отображаться в программном обеспечении.
    8. После использования кнопки«я»запустите измерение с помощью«Play»и сохраните силу записи файла и расстояние.
    9. Повторите шаги от 1.3.3 до 1.3.8 для каждого экспериментального состояния PDMS.
    10. Откройте файл и используйте следующую формулу для расчета модуля (E) PDMS для каждого соотношения. (Сила сжатия, зона печати PDMS, ∆L - расстояние от датчика, и L0 - оригинальная толщина марки PDMS).
      figure-protocol-1

2. Количественная оценка клеточных свойств на тунцом субстратах

  1. Анализ распространения
    1. Семенные СК на субстратах, приготовленные из шага 1.1.9 при плотности 5000 ячеек/см2 в 6-хорошой пластине. Разрешить SCs инкубировать на 48 ч в стандартных условиях клеточной культуры (37 градусов по Цельсию и 5% CO2).
    2. Разбавить 12 мл 10 мМ Бромодоксюридин (BrdU) фондовый раствор в 12 мл 37 х м/ с клеточной культурой среды, хорошо перемешать с пипеткой, чтобы сделать 10 qM BrdU маркировки раствора.
    3. Удалите среду клеточной культуры и смойте SCs 2x с ПОМОЩЬЮ PBS.
    4. Добавьте 2 мл раствора маркировки BrdU в каждый колодец и инкубировать SCs на 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации решения для маркировки BrdU зависит от конкретной скорости пролиферации клеток. Линия RT4-D6P2T SC имеет высокую скорость распространения, поэтому было использовано 2 ч инкубационного времени.
    5. Удалите раствор маркировки BrdU и смойте SCs 3x с помощью PBS. Добавьте 1 мл 3,7% формальдегида в PBS к каждому колодцу и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин для фиксации клеток.
      ПРЕДУГОИЯ: Формальдегид является канцерогеном человека; поэтому выполнять все работы внутри химического дыма капот с соответствующей защитой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При стирке с PBS, нет клеточной культуры среды в колодце, и, таким образом, поверхность PDMS может быть гидрофобной. Примите меры предосторожности, чтобы не полностью высушить поверхность субстрата, чтобы предотвратить повреждение клеток.
    6. Аспирировать формальдегидный раствор и промыть 3x с PBS (3 мин каждый). Удалить PBS и добавить 1 мл 0,2% Triton X-100 в PBS к каждому колодцу, чтобы permeabilize клеточной мембраны. Инкубировать SCs с раствором Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре.
    7. Удалите раствор Triton X-100 и смойте SCs 3x с ПОМОЩЬЮ PBS (по 3 мин каждый).
    8. Добавьте 1 мл 1 N HCl в каждый колодец и инкубировать на льду в течение 10 мин. Удалите 1 N HCl и добавьте 1 мл 2 N HCl в каждый колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Лечение HCl предназначено для гидролиза ДНК.
    9. Смешайте 182 мл 0,2 мМ Na2HPO4 и 18 мл 0,1 мМ лимонной кислоты для производства фосфата/лимонной кислоты буфера для извлечения антигена. Снимите 2 N HCl и добавьте 1 мЛ фосфат / лимонная кислота буфер в каждый колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    10. Вымойте SCs 3x с 0,2% Triton X-100 в PBS. Добавьте 2 л 3% из 3% крупного рогатого скота сывороток альбумин (BSA) в PBS в каждый колодец и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы часы неспецифические связывания антитела.
    11. Разбавленный BrdU первичного антитела спрягается с Alexa Fluor 488 в 3% BSA раствор в соотношении 1:300 для Окрашивания раствор BrdU. Инкубировать SCs с окрашивающим раствором на ночь при комнатной температуре, в то время как пластина покрыта алюминиевой фольгой.
    12. Для количественной оценки распространения, изображения SCs с помощью FITC и DAPI канал флуоресцентного микроскопа для обнаружения BrdU и ядер, соответственно. Сохранить изображения как "nd.2" файлы.
    13. Откройте файлы "nd.2" для каждого изображения, сделанного в одинаковых пространственных положениях.
    14. Откройте программное обеспечение для анализа изображений. Справа щелкните фон, чтобы открыть окно"Автоматизированные результаты измерений"и"Автоматизированное измерение"в разделе"Аналитический контроль".
    15. В меню"Граф и Таксономия"выберите"Графа". На изображении FITC нажмите на каждое ядро, показывающее зеленую флуоресценцию (brdU положительный) и правое нажатие на изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество положительных клеток BrdU отображается в окне«Автоматизация и измерения».
    16. Для изображений DAPI повторите шаг 2.1.14, чтобы подсчитать количество общих ядер. Рассчитайте процент положительных клеток BrdU для этого изображения.
    17. Повторите шаг 2.1.13 до 2.1.16 для других изображений для статистических целей и вычислить средний процент положительных клеток BrdU для каждого условия субстрата.
  2. Количественная оценка экспрессии c-Jun с помощью иммунофлуоресцентного анализа изображений
    1. Клетки, подготовленные внутри 6-х пластин с шага 1.1.9 и 1.2.23, фиксируются и пермяки с описанными ранее процедурами (шаг 2.1.5-2.1.7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного сравнения флуоресцентной интенсивности между клетками различных условий ECM, применять параметры камеры одинаково во всех образцах со всеми образцами, имеющими одинаковые параметры.
    2. Сохранить изображения как ".nd2" файлы.
    3. Откройте программное обеспечение для анализа изображений. Фон правого клика, чтобы открыть окно"Автоматизированные результаты измерений"и"Автоматизированное измерение"в разделе"Аналитический контроль".
    4. В"Автоматизированных результатах измерений",выберите"Данные объектов". Активировать кнопку«Продолжайте обновлять измерения».
    5. В верхней панели программного обеспечения, выберите "Мера" следуют "Объект особенности". Добавьте"Средняя интенсивность"к разделу "Выбранный для измерения".
    6. Откройте и объедините два файла изображений ".nd2", которые содержат изображения c-Jun и ядер.
    7. В верхней панели, выберите"ROI"и выберите "Draw Прямоугольная рентабельность инвестиций". Нарисуйте прямоугольную область, содержащую ядерную область одной клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: выражение c-Jun сконцентрировано в ядрах35.
    8. В верхней панели программного обеспечения, выберите "Binary" и "Определить порог", новое окно появится точно определить c-Jun флуоресцентной области.
    9. В новом окне нажмитекнопку "Полное изображение/использование ROI",чтобы переключить программу с полной модели изображения на модель ROI. Используйте"Интенсивность",чтобы настроить таблицу поиска, расположенную на левой стороне окна, для регулировки размера/формы выделенной области в прямоугольной рентабельности инвестиций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы размер/форма выделенной области были идентичны ядру.
    10. Нажмите кнопку"OK",чтобы получить среднее значение FITC в окне"Автоматизированные результаты измерения",а затем нажмите "Хранить данные".
    11. В окне"Автоматизированное измерение","Удалить объект",чтобы удалить красную выделенную область. На левой боковой панели используйте«Инструмент указания»для выбора прямоугольной рентабельности инвестиций и удаления.
    12. Повторите шаг 2.2.6 до 2.2.11 для измерения средней интенсивности FITC для каждой дополнительной ячейки.
    13. В оконной зоне"Автоматизированные результаты измерений",выберите"Сохраненные"и будут представлены все сохраненные данные. Используйте функцию«Экспорт»и выберите«Данные для Excel»,чтобы сохранить экспортируемую электронную таблицу и выполнить дополнительные вычисления.
  3. Количественная оценка ядерного удлинения
    1. Фикс и пермяки РК подготовлены с шага 1.2.22 после шагов 2.1.5-2.1.7. Выполните ядерное окрашивание с помощью монтажа среды с DAPI.
    2. Используя канал DAPI и 40-х объектив, получить изображения образца и сохранить как ".nd2" файлы.
    3. Следуйте шагу 2.2.3 и 2.2.4, чтобы открыть«Результаты автоматизированных измерений»и«Окно автоматизированного измерения»в программном обеспечении анализа изображений.
    4. В"Автоматизированные результаты измерения", используйте "Вариант" функция следуют "Выберите объект функция". В колонке"Feature" выберите "Удлинение" и добавьте к"Избранное для измерений"колонку. Используйте "Keep Updating Measurement", чтобы активировать эту функцию.
    5. Откройте файл изображений "nd.2", содержащий ядерные изображения. Вокне "Автоматизированное измерение"выберите функцию"Автоусекция"и выберите ядро. Правое нажатие на изображение и измеренное соотношение ядерного аспекта будут показаны в"Автоматизированные результаты измерений".
    6. Повторите шаг 2.3.5 для количественной оценки коэффициентов ядерного аспекта для других ядер в изображении. Выберите "Данные магазина" в окне "Автоматизированные результаты измерений".
    7. Повторите 2.3.5 до 2.3.6 для дополнительных изображений. Экспорт данных в файл электронной таблицы, как это было ранее сделано в 2.2.13 для анализа.
  4. Западная помарка для количественной оценки экспрессии белка
    1. Следуйте стандартным протоколам для западного анализа помарки, подробно описанных в другом месте32. Разбавления антител, используемых в исследовании показано ниже: Кролик анти-Июнь 1:2,000; Мышь анти-актин 1:1,000; Кролик анти p75NTR 1:1,000; Кролик анти миелин основной белок 1:1,000; Анти-мышь / кролик IgG, HRP-связанных антител 1:10,000.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для анализа и количественной оценки взаимодействия между жесткостью субстрата и составом белка на фенотипе SC был разработан субстрат клеточной культуры ОММС(рисунок 1A). Сжатие тестирования полимера на различной базе: лечение агентов отношения были использованы для количественной оценки янгиспис (E) субстрата (Рисунок 1B). Полученный диапазон значений модуля представляет физиологически значимые условия субстрата. После подготовки субстратов, РК были культуры и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SCs может способствовать регенерации нерва из-за их фенотипической трансформации и регенеративного потенциала после повреждения нерва. Однако, как ECM сигналы регулируют этот регенеративный потенциал остается в основном неясным, потенциально препятствуя не только развитие биоматериалов, которые направлены на содействие регенерации нервов, но и понимание механизмов, участвующих в регенерации нервов. Для того чтобы начать исследовать это взаимодействие, субстраты культуры клетки были созданы где сигналы ECM such as жесткос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщили о потенциальном конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку со стороны Университета Цинциннати. Авторы также поблагодарить Рона Фленникена из Университета Цинциннати Расширенный Характеристика материалы лаборатории для поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Альбумин из бычьей сыворотки (BSA), конъюгат Texas Red ThermoFisher ScientificA23017BSA окрашивание для выявления микропаттернов
Anti mouse IgG, HRP-связанные антителаCell Signaling Technology7076SАнтитело использовано для вестерн-блоттинга
Antirabbit IgG, HRP-связанное антителоCell Signaling Technology7074SАнтитело использовано для вестерн-блоттинга
BrdUThermo Fisher ScientificB23151Реагент, используемый для измерения пролиферации клеток
BrdU первичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificB35130Используется для визуализации BrdU в анализах пролиферации клеток
Коллаген IThermo Fisher ScientificA10483-01Белок, используемый для покрытия покровных стекол
Машина для испытания силы сжатияTestResourcesПрибор для количественной оценки механических свойств полимеров
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle MediumThermo Fisher Scientific11965092Среда для культивирования клеток
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаThermo Fisher Scientific16000044Среда для клеточной культуры
ФибронектинThermo Fisher Scientific33010-018Белок, используемый для покрытия покровных стекол
Флуоресценция микроскопNikonEclipse Ti2Флуоресцентный микроскоп
Halt Коктейль ингибиторов протеазы и фосфатазы (100X)Thermo Fisher Scientific78440Ингибитор протеазы и фосфатазы
LamininThermo Fisher Scientific23017015Белок, используемый для покрытия покровных стекол
Монтажная среда с DAPIThermo Fisher ScientificP36971Крепление покровного стекла и окрашивание ядер
Мышиное первичное антитело c-JunThermo Fisher Scientific711202Первичное антитело для визуализации белка c-Jun
Мышиное &бета;-Актин первичное антитело Технологияклеточной сигнализации3700SКонтроль нагрузки для экспериментов с вестерн-блоттингом
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122Среда для культивирования клеток дополнительная
Фоторезист SU 2010KAYAKUSU8-2010Фоторезист
Плуроновый F-127Sigma AldrichP-2443Блок неспецифического связывания белка
Кролик c-Jun первичное антителоТехнология клеточной сигнализации9165S Первичноеантитело для визуализации белка c-Jun
Основное антитело миелина кролика Основное антителоAbcamab40390Первичное антитело для визуализации MBP
Rabbit p75NTR Первичное антителоТехнология клеточной сигнализации8238SПервичное антитело для визуализации p75NTR
Родамина фаллоидинаThermo Fisher ScientificR415Визуализация цитоскелета клетки
Буфер RIPAAbcamab156034Буфер для лизиса клеток
RT4-D6P2T Шванновская клеточная линияATCCCRL-2768Клеточная линия, используемая в эксперименты
SYLGARD 184 PDMS основа и отвердительSigma Aldrich761036Настраиваемый полимер, используемый для покрытия покровных стекол
TrypsinThermo Fisher Scientific15090-046Реагент для диссоциации клеток
УФ-озоновый очистительNovascanПовышение гидрофизичности PDMS
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066Диссоциация клеток реагент

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33(2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335(2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247(2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065(2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308(2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337(2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

Похожие статьи