Мы описываем здесь протокол для характеристики белково-белковых взаимодействий между двумя сильно по-разному выраженными белками в живых Pseudomonas aeruginosa с использованием измерений FLIM-FRET. Протокол включает в себя бактерии штамма конструкций, бактерий иммобилизации, изображений и пост-изображения данных анализа процедур.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
FLIM-FRET Измерения белково-белковых взаимодействий в живых бактериях.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) контролируют различные ключевые процессы в клетках. Микроскопия флуоресценции в течение всей жизни (FLIM) в сочетании с переносом резонансной энергии Фюрстера (FRET) обеспечивает точную информацию о ИЦП в живых клетках. FLIM-FRET опирается на измерение распада флуоресценции донора FRET на каждом пикселе изображения FLIM, предоставляя количественную и точную информацию о ИЦП и их пространственных клеточных организациях. Мы предлагаем здесь подробный протокол для измерений FLIM-FRET, который мы применили для мониторинга ИЦП в живых Pseudomonas aeruginosa в конкретном случае двух взаимодействующих белков, выраженных с очень разными номерами копий, чтобы продемонстрировать качество и надежность метода при выявлении критических особенностей ИЦП. В этом протоколе подробно описаны все необходимые шаги для характеристики ИЦП - от бактериальных мутантных конструкций до окончательного анализа с использованием недавно разработанных инструментов, обеспечивающих расширенные возможности визуализации для простого толкования сложных данных FLIM-FRET.
Введение
Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) контролируют различные ключевые процессы вклетках 1. Роли ИЦП различаются в зависимости от состава белка, сродства функций и мест в клетках2. ИЦП могут быть исследованы с помощью различныхметодов 3. Например, ко-иммунопреципиентация является относительно простым, надежным и недорогим методом, широко используемым инструментом для выявления или подтверждения ИЦП. Тем не менее, изучение ИЦП может быть сложной задачей, когда взаимодействующие белки имеют низкий уровень экспрессии или когда взаимодействия являются переходными или актуальными только в конкретных сре....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Плазмидная конструкция
- Усиление двумя ПЦР (ПЦР1 и 3) последовательностей ДНК (использование геномной ДНК P. aeruginosa PAO1) из 700 базовых пар вверх и вниз по течению регионов, соответствующих месту вставки в геноме P. aeruginosa с полимеразой ДНК высокой точности. Добавьте сайты ограничения к грунтовки в синем и зеленом цветах и добавьте перекрывающуюся последовательность с mCherry к грунтовким красным цветом(рисунок 2).
- Для PvdA помечены на C-терминуса с eGFP, усилить 700 bp региона вверх по течению по отношению к остановке кодон грунтовки в синем, и усилить 700 bp вниз по течению региона, содержа....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эмпирические кумулятивные функции распределения (ecdf) жизней флуоресценции, измеренные для различных бактериальных штаммов, показаны на рисунке 8. Если ПРОИСХОДИТ ФРЕТ, экдфы смещаются в сторону более короткой продолжительности жизни(рисунок 8A.8B). Обратите внимание, что когда взаимодействие двух белков приводит к большому расстоянию между двумя флюорофорами, не может произойти ФРЕТ(рисунок 8C). Эту ситуацию нельз.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
FLIM-FRET предлагает некоторые ключевые преимущества по сравнению с интенсивностью на основе изображений FRET. Срок службы флуоресценции является неотъемлемым параметром флюорофора. Как следствие, он не зависит ни от локальных концентраций фторфоров, ни от интенсивности возбуждения света. Срок службы флуоресценции дополнительно также плохо зависит от фото-отбеливания. Особенно интересно узнать о ИЦП в клетках, где концентрации местных белков могут быть весьма неоднородными во всех подклеточных отсеках или регионах. FLIM-.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Мы признательны д-ру Людовику Ричерту за его ценную помощь в сборе данных FLIM, а также в техническом обслуживании и разработке установки FLIM. Эта работа финансировалась за счет грантов фонда pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN финансируется Фондом за Recherche M'dicale (FRM-SPF201809006906). YM признателен Институту Франции (IUF) за поддержку и предоставление дополнительного времени для исследований. IJS и JG признают Институт по доставке наркотиков в Страсбурге за его финансовую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 525/50 нм полосовой фильтр | F37-516, AHF, Германия | ||
| 680 нм короткий фильтр | F75-680, AHF, Германия | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Сульфат аммония (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq ДНК-полимераза 5U/μ L | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Фотодиод с волокном и лавинной связью | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Стеклянные покровные стекла (толщина No 1,5, 20&крат; 20 мм | Книтель стекло | MS0011 | |
| Высокоточная ДНК-полимераза Phusion 2U/μ L | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Отвар лизогенеза (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Сульфат магния гептагидрат (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Предметные стекла микроскопа (25&раз; 75 мм) | Нитевое стекло | MS0057 | |
| NucleoSpin Гель и ПЦР Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Плазмида | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Фосфат калия двухосновной (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Моноосновной фосфат калия (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Сукцинат (Динатрий) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, программное обеспечение SPCM | Becker & Hickl | ||
| Стерильная инокуляционная петля | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligaza 1U/μ L | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| модуль TCSPC | SPC830, Becker & Hickl, Германия | ||
| Ti:Сапфировый лазер | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
Ссылки
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
