FLIM-FRET Измерения белково-белковых взаимодействий в живых бактериях.

Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) контролируют различные ключевые процессы в^{клетках 1.} Роли ИЦП различаются в зависимости от состава белка, сродства функций и мест в клетках². ИЦП могут быть исследованы с помощью различных^{методов 3}. Например, ко-иммунопреципиентация является относительно простым, надежным и недорогим методом, широко используемым инструментом для выявления или подтверждения ИЦП. Тем не менее, изучение ИЦП может быть сложной задачей, когда взаимодействующие белки имеют низкий уровень экспрессии или когда взаимодействия являются переходными или актуальными только в конкретных средах. Изучение ИЦП, происходящих между различными ферментами пиовердина пути в P. aeruginosa требует, чтобы репрессии общего железа совместно фактором репрессора меха освобождается, чтобы выражение всех белков пиовердина путь, которые будут выражены в^{клетке 4,5,6}. Эта общая регулировка для всех протеинов путя приводит к в своевременных выражениях в клетке, как ожидается, для содействия их взаимодействию. Разнообразие с зрения размера, природы, уровней экспрессии и количества белков этого метаболического пути затрудняет изучение в восстановленных системах^6. Поэтому изучение ИЦП в их клеточной среде имеет решающее значение для дальнейшего понимания биологических функций белков в их родном контексте.

Лишь немногие методы, включая флуоресценцию позволяют исследовать ИЦП в живых^{клетках 7.} Среди различных параметров флуоресценции, которые могут быть измерены, срок службы флуоресценции (т.е. среднее время флюорофор остается в возбужденном состоянии, прежде чем излучать фотон), вероятно, является одним из самых интересных параметров для изучения в живых клетках. Срок службы флуоресценции флюорофора очень чувствителен к окружающей среде, и поэтому FLIM может предоставить химическую или физическую информацию о флюорофорной^{среде 8.} Это включает в себя наличие Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET), которые могут возникнуть в присутствии "приемщика" флуоресценции, расположенной на небольшом расстоянии от флуоресценции "донор". Передача энергии приводит к значительному сокращению срока службы донорской флуоресценции(рисунок 1A),что делает флуоресценцию пожизненной микроскопии (FLIM) мощным подходом к изучению белково-белковых взаимодействий непосредственно в живых клетках. FLIM может дополнительно предоставить пространственную информацию о том, где происходит взаимодействие в^{ячейках 7,8.} Такой подход чрезвычайно силен для изучения ИЦП в ситуациях, когда возможна маркировка флюорофорами двух взаимодействующих партнеров.

Для возникновения ФРЕТ - критические условия на расстоянии между двумя флюорофорами^{требуются 8,9.} Два фторфора не должны быть удалены друг от друга более чем на 10 нм. Поэтому при разработке экспериментов FLIM-FRET необходимо принимать предостережения, чтобы донор и приемник флуоресценции имели возможность находиться близко друг к другу в взаимодействующих комплексах. Хотя это может показаться сдерживающим, это на самом деле истинное преимущество, как расстояние зависимости FRET гарантирует, что два помеченных белков, проходящих FRET должны физически взаимодействовать (Рисунок 1A). Таким образом, трудности с получением четких ответов на вопросы о ИЦП в экспериментах по колокализации (два колокализованных белка не обязательно взаимодействуют) не являются проблемой с использованием FLIM-FRET.

Рисунок 1: Принцип анализа FLIM-FRET. Каждый пиксель многомерного изображения FLIM-FRET содержит информацию о распаде флуоресценции, зарегистрированном в данном конкретном месте (#counts - количество обнаруженных фотонов в канале t). (A) Классическое изображение FLIM, как правило, ложного цвета жизни закодированы 2D изображение (слева). Снижение среднего срока службы флуоресценции донора - как видно из изменения цветовой шкалы - можно наблюдать в присутствии ФРЕТ и является информативным о наличии ИЦП в этой пространственной области. (B) Перекрытие между спектром выбросов донора и спектром поглощения приемоктора необходимо для возникновения ФРЕТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Второе требование ДЛЯ ФРЕТ заключается в том, что спектр выбросов донора и спектр поглощения приемора должны перекрываться⁸ (рисунок 1B). Флуоресценция возбуждения донора должна быть на длинах волн, которые вносят очень мало в прямое возбуждение флуоресценции приемора. Не все комбинации флюорофоров возможны, и мы дополнительно рекомендуем преимущественно использовать доноров с моноэкспонентным распадом флуоресценции для облегчения интерпретаций FLIM-FRET^10. Несколько пар белков флуоресценции отвечают этим требованиям, в том числе популярная пара eGFP-mCherry¹¹ (для обзора палитры доступных флуоресцентных белковых пар FRET^{см. 12,13}).

FLIM-FRET позволяет измерять упадок флуоресценции донора FRET на каждом пикселе изображения FLIM(рисунок 1A). Существуют два основных метода определения срока службы флуоресценции, которые отличаются по приобретению и анализу: частотный домен (FD)¹⁴ и домен времени (TD). TD FLIM является более распространенным и осуществляется с использованием импульсного освещения в сочетании с различными возможными конфигурациями обнаружения, включая gating^{методы 15}, полоса^{камеры 16} или времени коррелированных одного фотона подсчета (TCSPC)^{методы 8}. Как для методов FD, так и для TD срок службы флуоресценции непосредственно не измеряется, а требует анализа измеренных данных для оценки продолжительности жизни (ы) или наличия взаимодействий. Для методов TCSPC наиболее широко используемый анализ основывается на установке распада с помощью одной или нескольких экспоненциальных функций с использованием наименее квадратных итеративных революций, которые минимизируют взвешенную сумму остатков.

Наконец, FLIM-FRET может быть выполнен как с помощью одного фотона или мультифотонных возбуждений. Последние имеют ряд преимуществ, таких как уменьшение аутофторесценции и фотодемаж из фокусной плоскости. Мультифотонные возбуждения позволяют также более длинную глубину возбуждения при работе в толстых 3D образцах⁸. Напротив, одно фотон возбуждение, как правило, более эффективным, как два фотона поглощения поперечных сечений флуоресцентных белков^{ограничены 17}.

Здесь мы предлагаем протокол для измерений ИЦП FLIM-FRET в живых P. aeruginosa в конкретном случае двух взаимодействующих белков (PvdA и PvdL), выраженных с очень разным количеством копий, чтобы продемонстрировать качество и надежность метода при выявлении критических особенностей ИЦП. Белки PvdA и PvdL участвуют в биосинтезе пиовердина. PvdA является L-орнитин N5-оксигеназа и синтезирует L-N5-формил-N5-гидроксиорнитин из L-орнитин по гидроксилации (PvdA) и формилирования (PvdF)¹⁸. PvdL является не рибосомным пептидным синтезом (NRPS) ферментом, состоящим из четырех модулей. Первый модуль катализает ациляцию миристической кислоты. Второй модуль катализает активацию L-Glu и его конденсации в миристический коА. Затем третий модуль конденсирует аминокислоту L-Tyr, которая затем изомерируется в D-Tyr. Наконец, четвертый модуль связывает L-Dab (Diaminobutyric кислоты) аминокислоты для формирования ацилатного трипептида L-Glu/D-Tyr/L-Dab⁶. PvdL, таким образом, отвечает за синтез трех первых аминокислот прекурсора пиовердина. Взаимодействие белка PvdA с PvdL удивительно, так как PvdL, в отличие от PvdI и PvdJ, не несет модуль, специфичный для L-N5-formyl-N5-гидроксиорнитин. Это взаимодействие предполагает, что все ферменты, ответственные за биосинтез прекурсора пиовердина, расположены в больших переходных и динамических^{многоэнзиматических комплексах 19,20.}

В этом докладе мы подробно объяснить, как построить бактериальных штаммов, выражаюющих родной двух взаимодействующих eGFP и mCherry помечены белками. Мы также описываем подготовку образцов и условия для эффективной визуализации клеток FLIM-FRET. Наконец, мы предлагаем пошаговую учебную программу для анализа изображений, включая недавно разработанный инструмент, предоставляющий расширенные возможности визуализации для простого толкования сложных данных FLIM-FRET. С помощью этого доклада мы хотели бы убедить не только предприимчивых, но и большинство биологов в том, что FRET-FLIM является доступным и мощным методом, способным решать свои вопросы о ИЦП непосредственно в родной клеточной среде.

1. Плазмидная конструкция

1. Усиление двумя ПЦР (ПЦР1 и 3) последовательностей ДНК (использование геномной ДНК P. aeruginosa PAO1) из 700 базовых пар вверх и вниз по течению регионов, соответствующих месту вставки в геноме P. aeruginosa с полимеразой ДНК высокой точности. Добавьте сайты ограничения к грунтовки в синем и зеленом цветах и добавьте перекрывающуюся последовательность с mCherry к грунтовким красным цветом(рисунок 2).
   1. Для PvdA помечены на C-терминуса с eGFP, усилить 700 bp региона вверх по течению по отношению к остановке кодон грунтовки в синем, и усилить 700 bp вниз по течению региона, содержащего стоп-кодон с грунтовки в зеленом цвете.
   2. Для PvdL помечены на N-терминуса с mCherry, усилить 700 bp области вверх по течению к pvdL гена, в том числе начала кодон, праймеры в синем, и усилить 700 bp вниз по течению области с грунтовки в зеленом цвете.

Рисунок 2: Обзор стратегии ПЦР и строительства плазмидов, используемых для строительства PvdA-mCherry. Смотрите текст для получения подробной информации - pvdA кодирует фермент, участвующий в биосинтезе siderophore pyoverdine, вторичного метаболита, участвуют в приобретении железа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Усиление eGFP кодирования ДНК (без начала и остановки кодонов) с грунтовки в красном с высокой точностью ДНК полимеразы.
3. Очистите продукты ПЦР на колонке очистки ПЦР(Таблица материалов).
4. Смешайте перекрывающиеся продукты ПЦР в равнозначном соотношении и выполните второй ПЦР с использованием грунтовок с сайтом ограничения, используемым для ПЦР 1 и 3 (зеленый и синий на рисунке 2).
5. Перенести продукт ПЦР в агарозу-1x TAE (Tris-Base Acetate EDTA pH 8.0) гель, вырезать соответствующую полосу и извлечь ампликон с pcR очистки комплекта(Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
6. Дайджест ПЦР ампликсон и pEXG2 плазмид с использованием соответствующих ферментов^{ограничения 21}.
7. Лигат плазмида и вставьте с T4 ДНК лигазы с использованием 90 нг плазмидного и молекулярного соотношения 1:1 (плазмида: вставка).
8. Преобразование плазмиды строительства в химически компетентных клеток E. coli TOP10 клеток путем смешивания перевязки продукта и 100 йл TOP10. Инкубировать компетентные бактерии / плазмидной смеси на льду в течение 30 минут, прежде чем приступить к 42 градусов теплового шока на 60 с. Затем поставь трубку на лед на 10 минут.
9. Добавьте 1 мл лисогенного бульона (LB) к бактериям и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
10. Бактерии плиты 100 йл на Агаре LB, содержащие 15 мкг/мл гентамицина.
11. Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
12. Экран наличие вставки колонии ПЦР: из одной изолированной колонии трансформатор, забрать минуту количество бактерий, которые будут добавлены в смесь ПЦР, содержащие грунтовки гибридизации на плазмиде таким образом, что наличие ампликона может быть обнаружено путем запуска продукта на агарозный гель (ДНК-полимераза). Из той же колонии, используемой для ПЦР, передать небольшое количество бактерий на свежей пластине, содержащей 15 мкг / мл гентамицина, которые будут изолированы и использованы для плазмидной экстракции. Наконец, изолировать и очистить плазмид (Таблицаматериалов) и проверитьвставку путем последовательности.
13. Храните бактерии TOP10, содержащие плазмиду в LB с 20% глицеролом в микротрубке 1,5 мл при -80 градусов по Цельсию и очищенную плазмиду при -20 градусов по Цельсию в трубке 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь

2. Вставка флуоресцентных тегов в хромосомный геном P. aeruginosa(рисунок 3)

1. Расти P. aeruginosa, TOP10 и E. coli помощник бактерий, каждый из 5 мл LB без антибиотиков при 30 градусов по Цельсию под орбитальной^{тряски ночь 22}. Создать флуоресцентные метки вставки в геном P. aeruginosa путем передачи плазмиды из E. coli TOP10 в штамм PAO1 и интеграции плазмиды в геном гомологичной рекомбинации. Второе событие пересечения вектора генерирует соответствующего мутанта.
2. Измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD_{600 нм)}бактериальной культуры и смешайте равное количество P. aeruginosa (500 МКЛ, ОД_{600 нм} и 1,0) с E. coli TOP10 pEXG2 (500 йл, ОД_{600 нм} и 1,0) и E. coli HB101 pRK600 помощник (500 йл, OD_{600 нм} и 1,0) в 1,5 мл microtube.
3. Центрифуга 5 мин при 9300 х г гранулировать бактерии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Онлайн-инструменты могут быть использованы для преобразования центробежной g-силы в вращение в минуту (об/мин) для регулировки скорости центрифуги.
4. Держите бактериальные гранулы и отбросить супернатант.
5. Переусердуйте гранулы, содержащие бактерии в 50 МКЛ LB.
6. Плита пятно (50 л) смеси на середине Агара LB (разогреть при 37 градусов по Цельсию) и инкубировать 5 ч при 37 градусов по Цельсию.
7. Ломать пятно с стерильной циклом прививки и повторного перерасхода в 1 мл LB.
8. Плита 100 Л этой бактериальной суспензии на Агаре LB, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникол для устранения Е. палочка палочки (E. coli TOP10 pEXG2 и E. coli HB101 pRK600 помощник чувствительны к хлорамфениколу, но P. aeruginosa естественно устойчива) и 30 мкг/мл гентамицина и инкубировать 2 дня при 37 градусов по Цельсию.
9. Resuspend одной колонии в 1 мл LB и инкубировать при 37 градусов по Цельсию под орбитальной тряски 4h.
10. Центрифуга 3 мин при 9300 х г и отбросить 950 МКЛ супернатанта. Resuspend гранулы в 50 л LB и изолировать смесь на LB агар, содержащий сахарозу и без NaCl.
11. Инкубировать на ночь при 30 градусов по Цельсию.
12. Обнаружить изолированные колонии на LB агар и LB агар, содержащий 15 мг / мл гентамицина для того, чтобы проверить чувствительность гентамицина.
13. Проверить eGFP или mCherry вставки ПЦР колоний (ДНК полимеразы) и секвенирования с использованием конкретных грунтовки.

Рисунок 3: Протокол строительства штаммов P. aeruginosa путем вставки флуоресцентных тегов. Для получения подробной информации можно посмотреть текст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Измерение пиовердина

1. Выращиваем бактерии в 5 мл ЛБ при 30 градусах цельсия под орбитальной тряской на ночь.
2. Пеллетные бактерии путем центрифугации, мыть и выращивать их в 5 мл SM (Succinate Medium, состав: 6 гзЛ^No1 К₂ЛПО₄, 3 гЗЛ^No1 _{КХ 2ПО 4}, 1 гЗЛ^No1 (NH₄)₂ SO₄, 0,2 г L^{No 1} MgSO₄, 7 H₂O и 4 г'Л^{No 1 натрия} сукчината с рН регулируется до 7,0, добавив NaOH) при 30 градусов по Цельсию под орбитальной тряски в одночасье. СМ является железом лишенной среды - отсутствие железа активирует экспрессию белков пиовердного пути, обычно подавляемого в присутствии железа.
3. Измерьте OD_{600 nm и разбавьте} бактерии снова в свежей среде SM на OD_{600 nm} й 0.1 и вырастите их на 30 C под орбитальной тряской всю ночь.
4. _{Измерьте OD 600 nm} для того чтобы обусловить количество бактерий в каждом образце.
5. Подготовь кварцевый кюветт, содержащий 100 МКЛ культуры P. aeruginosa и полный до 1 мл SM (900 МКЛ). Приготовьте кварцевый кювет, содержащий 1 мл среды SM (пустой).
6. Используя УФ-видимый спектрофотометр, измеряйте абсорбцию на максимуме пика поглощения. При рН 7.0 максимальное поглощение пиовердина будет происходить на уровне 400 нм. Определите концентрацию пиовердина (формы апо) в образце с использованием закона Пиво-Ламберта с использованием коэффициента вымирания молара на уровне 400 нм e и 19 000^{М -1см -1}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пиовердин можно количественно оценить в диапазоне абсорбанса от 0,1 до 1 евро (в зависимости от УФ-видимого спектрофотометра), в котором поглощение линейно увеличивается с концентрацией.

4. Культура бактерий и условия для клеток, чтобы выразить PvdA, PvdL и PvdJ

1. На 1-й день прививите трубку с 5 мл ЛБ из соответствующего глицеролового запаса бактерий и выращиваем бактерии в ночное время при 30 градусах Цельсия при 200 об/мин в орбитальном инкубаторе шейкера.
2. На второй день гранулы клетки центрифугации на 3000 х г в течение 3 мин и отказаться от супернатанта.
3. Повторное перерасход клеток в 10 мл SM.
4. Повторите шаги 4.2-4.3 один раз и вырастить бактерии в SM ночь на 30 градусов по Цельсию 200 об /мин.
5. На 3-й день разбавляют 1/10 культурой бактерий в свежем СМ.
6. Расти разбавленных бактерий снова на ночь в тех же условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие пиовердина можно обнаружить визуально, так как он окрашивается в желто-зеленые растущие средства массовой информации. Это показывает, что экспрессия белков пути пиовердина были активированы и что ферменты, представляющие интерес, выражаются в клетках.

5. Подготовка агарозной площадки(рисунок 4)

1. Поместите микроскопное стекло-слайд на плоскую горизонтальную поверхность. Упорядочить два стеклянных слайдов увенчанный двумя слоями клейкой лентой с каждой стороны первоначального слайда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите 1-2 мм пространство между тремя выровненными слайдами, чтобы предотвратить меленую агарозу, чтобы в конечном итоге распространиться на слайдах с клейкой лентой.
2. Пипетту и залить каплей 70 МКЛ 1% расплавленной агарозы на стекло-слайд. Добавить четвертый слайд на вершине, чтобы сгладить капли агарозы и нажмите вниз осторожно. Подожди минутку.
3. Смей верхнюю горку и падение с пипеткой около 3 йл бактерий в 3 до 4 пятен в разных местах на агарозы площадку.
4. Обложка с микроскопией стеклянные крышки (например, 22x22 мм #1,5 толщины).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плоскость и толщина coverslips имеют важное значение для работы с двух-фотон возбуждения. Точность coverslips с контролируемой равномерной плоскости и низкой аутофторесценции, как правило, хороший выбор.
5. Исправить крышку с расплавленным парафином, чтобы запечатать крышку на стеклянную горку. Начните с фиксации четырех углов крышки.

Рисунок 4: Агароза колодки подготовки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

6. Изображение с двухкориновой микроскопией установки

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем самодельные двух фотон возбуждения сканирования перевернутый микроскоп с 60x 1.2NA воды погружения цели, работающие в режиме десканированных флуоресценции сбора. Двухкориновая длина волны возбуждения установлена на уровне 930 нм. Он обеспечивается лазером Ti:Sapphire (скорость повторения 80 МГц, ≈ 70 fs шириной импульса), работающим на 10-20 мВт. Фотоны флуоресценции были собраны с помощью фильтра короткого прохода 680 нм и фильтра диапазона 525/50 нм, прежде чем быть направленным на волоконно-соединенный лавинный фото-диод, подключенный к одному модулю подсчета фотографий (TCSPC). Микроскоп также оснащен трансмиссионой лампой флуоресценции. Несколько микроскопов FLIM-FRET в настоящее время коммерчески доступны, и многие средства визуализации оснащены установками, способными выполнять измерения FLIM-FRET.

1. Используйте лампу флуоресценции, чтобы сосредоточить цель на монослой бактерий в образце и выбрать области, представляющие интерес.
2. Убедитесь, что возбуждающей лазерной затвор закрыт и что инфракрасный свет, поступающий от лазера блокируется и не попадают в микроскоп.
   Внимание: Тщательное внимание и постоянная бдительность должны быть предоставлены работы с ИК импульсных лазеров, как лазерный свет не может рассматриваться глазами, но любой и даже переходный прямой экспозиции или лазерного отражения может быть чрезвычайно вредным и создать необратимые повреждения глаз. Пожалуйста, обратитесь к местным процедурам лазерной безопасности и обучения перед использованием микроскопии установок.
3. Поместите слайд микроскопии на сцену с крышками, стоящими перед целью.
4. Убедитесь, что лампа флуоресценции ON.
5. Поверните башню кубика фильтра, чтобы выбрать кубик eGFP и откройте затвор лампы флуоресценции.
6. Отправьте свет флуоресценции к окуляру микроскопа.
   Внимание: Убедитесь, что соответствующие фильтры удаляются в светлом пути, чтобы отбросить прямой свет возбуждения, поступающий от лампы флуоресценции, которая может повредить глаза.
7. Сосредоточьте цель на бактериях с помощью ручки микроскопа.
8. Выберите область интереса к образцу, перевестив его с помощью джойстика, контролирующего моторизованную сцену
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фокусировка легче с высоко флуоресцентным образцом позволяет флуоресценции, чтобы увидеть непосредственно глазами.
9. Переключите возбуждение на лазер 2PE для измерений FLIM-FRET.
10. Отправьте путь выбросов флуоресценции обратно к детектору.
11. Поверните назад башню кубика фильтра, чтобы выбрать для дихроического куба для лазера 930 нм.
12. Установите мощность лазера до 20 мВт.
13. Установите размер области интереса до 30 мкм. Эта операция регулирует напряжение, работающее на гальво-зеркалах, и определяет диапазон их движений(рисунок 5).
14. Включите детектор и начните сканировать образец - кнопки запуска и остановки, контролирующие сканирование, также контролируют открытие и закрытие лазерного затвора как по соображениям безопасности, так и для ограничения фотооткрывателя образца(рисунок 5).

Рисунок 5: Схематическое представление интерфейса программного обеспечения для управления микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

15. При необходимости отрегулируйте фокус, слегка перемещая микроскоп тонкой ручкой фокусировки.
16. Выберите поле зрения для визуализации, тонко перемещая сцену из компьютерного интерфейса. Это может быть сделано на установку, перемещая крест на изображении в микроскоп управления программным обеспечением(рисунок 5), который будет определять новый центр изображения и нажав Move Stage. Хорошее поле зрения для приобретения соответствует изображению с 10-30 неподвижными бактериями, все правильно сфокусированы (все бактерии находятся на одной плоскости). Если вы заинтересованы в извлечении данных FLIM-FRET для отдельных клеток, убедитесь, что бактерии хорошо индивидуализированы (сегментация изображений будет намного проще).
17. Откройте программное обеспечение SPCM (коммерческое программное обеспечение для сбора данных) и убедитесь, что скорость подсчета фотонов не слишком высока, чтобы избежать эффекта нагромоения, который может повлиять на измерения продолжительности жизни. При необходимости, снизить интенсивность лазера, чтобы сохранить скорость подсчета фотона низким (около 1% от скорости повторения лазера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффект Pile-Up описывает эффект фотонов, потерянных при высоких скоростях подсчета фотонов из-за мертвого времени устройств соотнесенного по времени единого фотона (TCSPC). Если Pile-Up происходит, измеренный средний срок службы становится искусственно короче с возможно дополнительным более коротким компонентом, который может появиться в распаде из-за перенапись быстро излучающих фотонов.
18. Отрегулируйте параметры приобретения, включая время сбора денег (обычно для сбора достаточного количества фотонов требуется от 60 до 180 с).
19. Нажмите кнопку «Пуск» и дождись завершения приобретения.
20. Сохраните данные.
21. Прекратите сканирование образца и выключите детектор.
22. Выберите другое поле зрения в образце и повторите шаги 6.14-6.22 или изображение нового слайда микроскопии, повторив шаги 6.1-6.22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: P. aeruginosa может жить и делить до 6-8 часов при комнатной температуре на агарозной площадке (соответствующей, наконец, 4 удвоения времени при температуре 20 градусов по Цельсию). В идеале, не ждите слишком долго, чтобы выполнить FLIM-FRET измерения, чтобы избежать наблюдения площадку полностью покрыта бактериями.

7. Анализ данных

Рисунок 6: Основная панель окна анализа данных программного обеспечения SPCImage. Интенсивность изображения (синий ящик), пожизненное изображение (фиолетовый ящик), пожизненная гистограмма (в правом верхнем направлении), кривая распада в выбранном положении (зеленая коробка) и параметры распада в выбранном положении (голубой ящик) репрезентативного распада PvdA-eGFP, записанного в живой P. aeruginosa с помощью карты приобретения bh SPC830 на самодельных двух-фотон-Excitation-FLIM-FRET. Экспериментальная кривая распада пикселя, указанная на рисунке выше, ее моно-экспоненциальная подгонка (красная кривая), деконволутная распад от ее рассчитанной инструментальной функции реакции (зеленая кривая), можно увидеть в зеленой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1. Базовый анализ
   1. Запустите программное обеспечение SPCImage.
   2. Импорт сохраненный файл SPCM. Интенсивность изображения отображается на левой верхней панели программного обеспечения(рисунок 6 синий ящик).
   3. Изучите окно кривой распада(рисунок 6 зеленой коробки), которое отображает данные о распаде, соответствующие пикселю, выбранному на изображении интенсивности(рисунок 6 синего ящика). Фотон номера каждого канала времени отображаются как синие точки и припадок распада обращается как красная линия. Обратите внимание, что после загрузки данных программное обеспечение отображает самый яркий пиксель изображения. Переместите синий крест через изображение, чтобы исследовать пиксели с меньшей интенсивностью. Окно распада автоматически обновляется в каждом новом положении пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение инструментальной функции реагирования (IRF) системы лазерного сканирования очень трудно. IRF, рассчитанный на основе восходящего края кривых распада флуоресценции в данных FLIM, может быть использован для деконволюции распада. Это вариант, выполненный по умолчанию в SPCimage(рисунок 6 зеленая кривая).
   4. Отрегулируйте диапазон установки, перемещая стартовые и окончание каналов фитинговой коробки (T1 и T2 в зеленой коробке). T1 следует начинать с первых нескольких каналов роста распада и T2 определить последний канал в конце распада и может быть выбран в качестве одного из последних каналов распада с рядом фотонов выше фотоны рассчитывать смещения (т.е. уровни фотонов рассчитывается до распада поднимается).
   5. Выберите биннинг, изменив значение Bin. Распад кривой интегрирует фотонирование выбранного пикселя вместе с областью i пикселей вокруг положения курсора, определяемого параметром ячеек (увеличение binning увеличит количество фотонов в распаде и может быть полезно для достижения количества фотонов, необходимых для многореациаляциаций моделей).
   6. Отрегулируйте значение порога. Пиксели, не имеют по крайней мере одного канала с количеством фотонов выше порогового значения, не будут включены в процедуру установки. Конечно, чем больше количество пикселей, чтобы соответствовать, тем дольше анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные FLIM могут содержать огромное количество пикселей и каналов времени. Последние версии программного обеспечения позволяют использовать графический процессор (Graphics Processor Unit) для параллельной обработки большого количества пикселей, что значительно сокращает время обработки. Может быть интересно настроить параметры binning и порога используя изображения соответствующие к конструкциям бактерий exhibiting самая низкая интенсивность флуоресценции (например, с бактериальными напряжениями с самыми низкими уровнями выражения). Это позволит обеспечить, чтобы соответствующие распада, наблюдаемые в этих образцах, соответствовали критериям фильтрации и были включены в анализ. Эти параметры могут быть использованы для всех изображений.
   7. Отрегулируйте, при необходимости, параметры распада (циановая коробка). Пусть сдвиг меняется, большую часть времени рассеяния и смещения могут быть установлены до нуля, если взглянуть на функции распада показывают, что их вклад является незначительным. Смещение можно оценить, глядя на первые каналы распада - обратите внимание, что визуализация в течение длительного времени из-за низкой флуоресценции в образце обычно приводит к ненулевой смещения. Рассеяние происходит в основном в толстых образцах и в противном случае может считаться незначительным.
   8. Перед запуском пригонки выберите подходящий алгоритм. Откройте окно настроек алгоритма в вариантах модели Show/Hide. Выберите алгоритм максимальной оценки вероятности (MLE)(рисунок 7A).
   9. Вы запустите установку изображения, нажав на | Decay. После завершения срока службы закодированное изображение FLIM отображается в панели изображений продолжительности жизни(рисунок 6 фиолетовый ящик).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На окне кривой распада(рисунок 6 зеленый ящик) можно увидеть значение продолжительности жизни, которое соответствует каждому пикселю изображения, перемещая синий крест.
      ПРИМЕЧАНИЕ: для автоматической обработки большого количества аналогичных файлов данных FLIM можно использовать режим пакетной обработки.
   10. Проверьте качество подходят глядя на остатки (в идеале распределены случайным образом около 0) и Чи квадратное значение близко к 1.
   11. Установленные данные могут экспортироваться в различных форматах. Чтобы экспортировать файлы в файлах txt, перейдите на файл | Экспорт. В окне экспортных опционов(рисунок 7B), выберите Выберите все, а затем нажмите Экспорт.
   12. Наконец сохранить файл анализа. Аналитические файлы сохраняются в качестве файлов и могут быть вновь открыты непосредственно в SPCImage.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В частности, в случаях несбалансированных количеств доноров/приемов FLIM-FRET может выявить субнаселения в смеси взаимодействующих белковых комплексов- в частности, когда концентрации двух партнеров очень различны, что приводит к смесям сложных и свободных видов. Не взаимодействующие виды (характеризующиеся распадом, очень похожим на только распад донора) могут подвергаться дискриминации со стороны взаимодействующих видов при условии пространственной неразумности компонентов донорской жизни в наборе данных. Аналогичным образом, могут образовываться нестоихометрические взаимодействующие комплексы либо с большим числом доноров, либо с более приемом флуоресценции. Флуоресценции распада таких комплексов, как правило, трудно интерпретировать. Участок диаграммы FLIM может быть использован для предоставления важной информации о стоитиометрии и режиме^{связывания ИЦП 20,23.} Участок диаграммы FLIM является графическим представлением самого короткого компонента продолжительности жизни в качестве функции его амплитуды. Он может быть использован для визуализации пикселей с аналогичными подписями распада. Чтобы сделать такие представления, экспериментальные распада флуоресценции должны быть оснащены двумя экспоненциальными модели. Следующие шаги могут быть руководством через этот процесс.
   13. Начните с анализа данных донора только строительство. Это позволит определить стоимость жизни донора. В идеале, измерить это значение в течение нескольких изображений, записанных в тех же условиях, как донор / принимает конструкций для получения надежного значения жизни для донора.
   14. После того, как определяется, подходят флуоресценции распада доноров / приемов конструкций с двух-экспоненциальной модели. В поле параметра цианового распада(рисунок 6),установите количество компонентов до 2. Зафиксировать параметр t2(ps) к надежному значению срока службы донора, определяемому в шаге 1, и проверить коробку, чтобы зафиксировать этот параметр.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Важно исправить долгоижизненную жизнь No 2 для того, чтобы ограничить чрезмерное приспособление, чтобы улучшить установку конвергенции, и получить более надежные два экспоненциальных^{подходят параметры 24,25,26}.
   15. Сохранить файл и экспортные данные, как файлы й.asc, как в шаге 7.1.11.

Рисунок 7: (A) Настройки алгоритма для установки распада с экспоненциальными моделями. Выбор MLE (алгоритм максимальной вероятности или оценка максимальной вероятности, MLE) в качестве подходящих моделей и (B) окна экспортных опционов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Расширенный анализ изображений FLIM в R
   1. Установите R (https://cran.r-project.org) и RStudio (https://rstudio.com) при необходимости.
   2. Откройте RStudio и создайте новый проект.
   3. Перемести весь анализ файла в папку под названием "данные" в основной папке проекта.
   4. Откройте новый файл скрипта (или откройте дополнительный скрипт FLIM_analysis. Р).
   5. Установите специальный пакет flimDiagRam для анализа данных flim https://github.com/jgodet/flimDiagRam. Позвоните в пакет в рабочем пространстве. (См. уведомление HowTo_FlimDiagRam)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установка пакетов должна быть сделана только один раз. После установки пакеты могут быть вызваны из любого нового сеанса R. Загрузка R-пакетов от github требует установки пакета 'devtools'. Установка «девтулов» может занять несколько минут. Пакет flimDiagRam может быть использован для представления параметров и распределения данных FLIM, для извлечения данных FLIM на уровне отдельных индивидуализированных ячеек, для сравнения результатов FLIM в условиях или штаммах и для изучения данных FLIM с использованием передовых инструментов визуализации, таких как график диаграммы FLIM.
   6. Используйте пошаговую прокомментировал код и данные доступны для самостоятельного воспроизведения всех подсемейок, представленных в разделе Результаты представителя ниже. Этот учебник можно найти в уведомлении, HowTo_FlimDiagRam на https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf. Код можно легко перенести для анализа данных.

Эмпирические кумулятивные функции распределения (ecdf) жизней флуоресценции, измеренные для различных бактериальных штаммов, показаны на рисунке 8. Если ПРОИСХОДИТ ФРЕТ, экдфы смещаются в сторону более короткой продолжительности жизни(рисунок 8A.8B). Обратите внимание, что когда взаимодействие двух белков приводит к большому расстоянию между двумя флюорофорами, не может произойти ФРЕТ(рисунок 8C). Эту ситуацию нельзя отличить от отсутствия взаимодействия между двумя партнерами в FLIM. Поэтому важно, когда расстояние между красителями не может быть предсказано от молекулярных моделей или известных архитектур комплекса, рассмотреть возможность маркировки белков в разных положениях, чтобы максимизировать шансы на зондирование взаимодействия. Аналогичным образом, из-за большой разницы в выражениях белка между PvdA (высоко выраженный) и не-рибосомный пептид синтетазы PvdL (несколько копий на клетки), тот же комплекс PvdA/PvdL не приводит к аналогичным данным FLIM-FRET. На самом деле, несбалансированные стоихиометрии могут усложнить интерпретацию данных FLIM-FRET. В зависимости от того, какой белок маркирован донором, несбалансированные стоихиометрии приводят к различиям в вкладе свободных по сравнению с связанными донорскими белками в зарегистрированном распределении сроков службыфлуоресценции (рисунок 8A,8B).

Рисунок 8: Иллюстрация изменений, происходящих в донорской означает распределение флуоресценции жизни в ответ на FRET (единая экспоненциальная модель). Представление взаимодействий PvdL (серая форма) с PvdA (синяя форма) (A и B) или PvdJ (желтая форма) (C) белки помечены eGFP (зеленый) или mCherry (красный) флуоресцентные белки. Эмпирические кумулятивные функции распределения (нижние графики) могут четко выделить различия между распределением продолжительности жизни флуоресценции. (A) При наличии избытка PvdA помечены с донором флуоресценции, среднее распределение жизни доноров eGFP доминируют доноры, которые не проходят FRET, но и интегрировать срок службы немногих доноров, проходящих FRET с mCherry-PvdL. В этой ситуации распределение смеси на протяжении всей жизни (зелено-оранжевая кривая) близко к пожизненному распределению той же смеси, образованной только с неоцеливой PvdL (зеленая кривая). (B)Если порядок маркировки изменен и избыток PvdA помечены с приеморами присутствует, среднее распределение жизни регулируется передачи видов, в том числе, возможно, доноров, которые проходят FRET с несколькими приеморами (оранжевая кривая). Таким образом, это распределение сильно отличается от того же комплекса, сформированного с необрязаемой PvdA (зеленой кривой). (C) Если не FRET происходит потому, что белки не взаимодействуют или потому, что расстояние между красителями слишком велика в комплексе, изменения в распределении жизни почти накладывается на донора только (сравните светло-зеленую кривую, соответствующую распределению срока службы флуоресценции PvdJ-eGFP/mCherry-PvdL к зеленой кривой, соответствующей PvdJ-eGFP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Сюжет диаграммы может быть использован для предоставления важной информации о стоихиометрии, как показано на рисунке 9. В PvdA-eGFP/mCherry PvdL мутант, количество доноров помечены PvdA гораздо выше, чем количество mCherry PvdL. Среди всех доноров, присутствующих в образце, лишь немногие из них взаимодействуют с PvdL. Вопреки среднему распределению значения FLIM, график диаграммы FLIM дает только конкретную информацию, содержащуюся в компоненте распада. На рисунке 9Aможно наблюдать одно значение tau1, сосредоточенное на уровне 2,3 нс, что составляет около 30-40% видов в смеси. Единое значение tau1 предполагает, что каждый донор PvdA-eGFP может передавать только с одним приемером mCherry PvdL.

От обратной маркировки (PvdA-mCherry/eGFP PvdL), большинство белков eGFP PvdL, как ожидается, будут взаимодействовать с PvdA-mCherry, из-за низкого количества PvdL по сравнению с PvdA. Это подтверждается значениями alpha1, которые смещаются в сторону более высоких значений. Кроме того, значения tau1 стали гораздоболее распределенными (рисунок 9B) с появлением недолговечных видов с продолжительной жизнью до 1,5 нс. Это говорит о том, что дополнительные передачи происходят по сравнению с ситуацией на рисунке 9A и, таким образом, что несколько белков PvdA могут связываться с одним белком PvdL. В результате для каждого комплекса срок службы eGFP будет зависеть от количества и распределения белков mCherry, с помощью которых eGFP переводит энергию. Взятые вместе, данные показывают, что каждый белок PvdL может взаимодействовать с несколькими белками PvdA

Рисунок 9: Диаграммы FLIM участков в случае превышения доноров (A) или принимаетелей (B) и несколько обязательных сайтов. Участок диаграммы FLIM дает конкретную информацию, содержащуюся в компоненте распада донора, переживающего ФРЕТ, извлеченный с помощью двух экспоненциальной подгонки. В PvdA-eGFP/mCherry-PvdL мутант (A), одно значение tau1 наблюдается и его амплитуда, учитывая рассеянное положение точек данных на горизонтальной оси является информативным о популяции доноров, участвующих в FRET. В системе PvdA-mCherry/eGFP-PvdL(B) значенияtau1 гораздо более распределены, что указывает на то, что один белок PvdL (серая форма) может взаимодействовать с несколькими белками PvdA (голубая форма). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторов нечего раскрывать.