Методическая статья

Биомиметическая модель рака печени для изучения взаимодействия опухоли и стромы в 3D-среде с настраиваемыми био-физическими свойствами

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61606

⸱

7 августа 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Uppsala University, 2Polymer Chemistry, Department of Chemistry-Ångström Laboratory, Uppsala University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой 3D биомиметическую модель с сопровождающим фиброзным стромальным отсеком. Подготовлено с физиологически релевантными гидрогелями в соотношениях, имитирующих био-физические свойства стромальной внеклеточной матрицы, активного посредника клеточных взаимодействий, роста опухоли и метастазов.

Аннотация

Гепатоцеллюлялярная карцинома (ГКК) является основной опухолью печени, развивающейся в результате хронических заболеваний печени. Хронические заболевания печени и воспаление приводит к фиброзной среде активно поддержки и вождения гепатокарциногенез. Таким образом, значительное значение имеет понимание гепатокарциногенеза с точки зрения взаимодействия между микро-средой опухолевой стромы и опухолевыми клетками. Трехмерные (3D) модели клеточной культуры предлагаются в качестве недостающего звена между современными моделями культуры клеток in vitro 2D и моделями животных in vivo. Нашей целью было разработать новую 3D биомиметическую модель HCC с сопровождающим фиброзным стромальным отсеком и сосудами. Физиологически соответствующие гидрогели, такие как коллаген и фибриноген были включены для имитации био-физических свойств опухоли ECM. В этой модели LX2 и HepG2 клетки, встроенные в гидрогелевую матрицу, были посеяны на перевернутой трансмембранной вставке. Клетки HUVEC затем были посеяны на противоположной стороне мембраны. Были подготовлены три рецептуры, состоящие из ЭКМ-гидрогели, встроенных в клетки, и био-физические свойства были определены реологией. Жизнеспособность клеток определялась анализом жизнеспособности клеток в течение 21 дня. Эффект химиотерапевтического препарата доксорубицин оценивался как в 2D-ко-культуре, так и в нашей 3D-модели в течение 72ч. Результаты реологии показывают, что био-физические свойства фиброзной, цирротической и HCC печени могут быть успешно имитирован. В целом результаты показывают, что эта 3D-модель более репрезентативна для ситуации in vivo по сравнению с традиционными 2D культурами. Наша 3D модель опухоли показала снижение реакции на химиотерапию, имитируя лекарственная устойчивость, обычно наблюдается у пациентов HCC.

Введение

Гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) составляет 90% всех первичных ракапечени 1,2. С 810000 смертей и 854000 новых случаев ежегодно сообщается он в настоящее время занимает пятое место наиболее распространенных раковых заболеваний во всем мире с одним из самых высоких показателейсмертности 1. Развитие HCC в основном связано с воспалением, связанным с хроническими заболеваниями печени, а именно, вирусный гепатит, хроническое чрезмерное потребление алкоголя, метаболический синдром,ожирение и диабет 1,3,4.  Воспаление, связанное с этими патологическими состояниями приводит к травме гепатоцитов и секреции различных цитокинов, которые активируют и вербуют печеночные клетки стеллата и воспалительные клетки, чтобы инициироватьфиброз 5. Клетки печеночные стеллат известны своей ключевой ролью в инициировании, прогрессировании и регрессии печеночным фиброзом. При активации они дифференцируются в миофибробласт, как клетки с контрактильными, провоспалительными и профибриногеннымисвойствами 6,7,8. В результате фиброз, в свою очередь, вызывает дисрегуляцию внеклеточной матрицы ремоделирования ферментной активности,создавая среду, характеризующуюсяобщей повышенной жесткостью сопровождается секрецией факторов роста, что еще больше способствует патогенезу HCC 9,10. Именно эта непрерывная патогенная обратная связь между гепатоцитами и стромальной средой, которая подпитывает начало рака, эпителиальный мезенхимальные переходы (ЭМТ), ангиогенез, метастатический потенциал, и измененнаяреакция препарата 11,12,13.  Поэтому понимание гепатокарциногенеза с точки зрения взаимодействия опухоли и микро-среды опухоли имеет большое значение не только с точки зрения механистического, но и с точки зрения лечения.

Двухмерные (2D) модели культуры клеток в пробирке в основном используются 80% биологов раковых клеток14. Однако эти модели не являются репрезентативными для истинной микро-среды опухоли, которая влияет нахимиотерапевтические реакции 14,15,16. В настоящее время 96% химиотерапевтических препаратов терпят неудачу во время клиническихиспытаний 14.  Такая высокая заболеваемость в скорости истощения наркотиков может быть связано с тем, что имеющиеся в пробирке предпоказ модели не в полной мере представляют наше текущее понимание и понимание сложности HCC и микрооквидения16. И наоборот in vivo животных моделей, присутствующих с ослабленной иммунной системой и расхождения во взаимодействии между опухолью и микропронимки посравнению с людьми 16,17. В среднем только 8% результатов, полученных в результате исследований на животных, могут быть надежно переведены из доклиническихв клинические условия 16,17. Поэтому очевидно, что оценка HCC требует разработки платформы in vitro, которая эффективно резюмирует сложность не только опухоли, но и микроокноронии. Платформы будут дополнять имеющиеся в настоящее время в пробирке доклинических моделей скрининга и уменьшить количество исследованийна животных в будущем 7,14.

Одной из таких платформ являются передовые трехмерные (3D) модели клеточной культуры. Множество из этих передовых 3D-моделей для изучения HCC появились в течение последнего десятилетия и различные обзоры были опубликованы. Доступные 3D-модели для изучения HCC включают многоклеточные сфероиды, органоиды, эшафот-модели, гидрогели, микрофлюиду и биопечать. Из них многоклеточные сфероиды являются одной из самых известных моделей, используемых в исследовании развития опухоли. Сфероиды являются недорогой моделью с низкой технической сложностью и в то же время эффективно имитируя архитектуру опухоли in vivo18,19,20. Многоклеточные сфероиды внесли свой вклад в огромное количество информации о HCC17,21,22. Тем не менее, стандартизированное время культуры не хватает, как многоклеточные сфероиды хранятся в культуре от 7 до 48 дней. Значительное значение имеет увеличение времени в области культуры. Эйленбергер обнаружил, что различия в сфероидном возрасте глубоко влияет на Sorafenib (ингибитор киназы, используемый для лечения рака печени) диффузивностьи токсичность 23. В то время как Wrzesinski и Фей обнаружили, что 3D сфероиды гепатоцитов требуют 18 дней, чтобы восстановить ключевые физиологические функции печени после трипсинизации и продолжает проявлять стабильную функциональность в течение 24 дней послеэтого восстановления 24,25.

Некоторые из более продвинутых 3D моделей HCC включает в себя использование человека decellularized печени леса и био-печатных лесов. Mazza и его коллеги создали естественный 3D эшафот для моделирования HCC с использованием децеллюляризованной печени человека, не подходящей длятрансплантации 26. Эти природные леса могут быть успешно заселены в течение 21 дней с совместной культуры печеночные stellate и гепатобластома клеток, сохраняя при этом выражение ключевых внеклеточных компонентов матрицы, таких как коллаген типа I, III, IV и фибронектин. Помимо моделирования заболеваний, эта модель также предлагает преимущество функциональной трансплантации органов и доклинических наркотиков и токсичности скрининга26. С достижениями в 3D био-печати, 3D внеклеточные матричные леса теперь также могут быть био-печати.  Ма и его коллеги, био-печатные внеклеточные матричные леса с переменными механическими свойствами и биомиметическая микроархитектура с использованием гидрогелевого инженера из децеллюлярной внеклеточнойматрицы 27. Несомненно, все это отличные 3D модели HCC. Однако отсутствие человеческой печени и затраты, связанные с приобретением необходимого оборудования и материалов, ставит эти модели в невыгодное положение. Кроме того, все эти методы технически продвинуты, требующие обширной подготовки, которая может быть недоступна для всех исследователей.

Основываясь на сложности HCC и имеющихся в настоящее время 3D-моделей, мы постарались разработать всеохватывающую 3D модель HCC. Мы стремились к модели, способной резюмировать как премалигнант, так и микроокноронность опухоли путем включения регулируемых значений жесткости гидрогеля.  Кроме того, мы также включили гепатоцеллюлярные и строма связанных клеточных линий, которые играют ключевую роль в патогенеза HCC. К ним относятся эндотелиальные клетки, печеночные клетки стеллата и злокачественные гепатоциты, выращенные в микроокноронии, состоящей из физиологически релевантных гидрогелей. С выбранными гидрогелями, коллагеном типа I и фибриногеном, включенными в соотношения, сопоставимые с био-физическими изменениями, замеченными в жесткости печени во время инициации и прогрессирования HCC.  Кроме того, мы стремились к модели, которая могла бы храниться в культуре в течение длительного периода времени. Мы предусмотрели модульную, экономически эффективную модель, которая может быть оснащена базовым оборудованием, минимальной подготовкой и опытом, а также легкодоступными материалами.

Протокол

figure-protocol-1
Рисунок 1: Графические изображения создания 3D биомиметических HCC модели Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс этого протокола устанавливается на иллюстрациях рисунка 1

1. Подготовка раствора фибриногена

  1. Приготовьте раствор 1 М хлорида кальция (CaCl2), взвесив 2,21 г CaCl2 и добавив его в дистиллированную воду 2 мл (dH2O). Стоковое решение может храниться при комнатной температуре (RT).
  2. Приготовьте 20 мл апротинина (1218,75 KIU/mL), взвесив 5 мг апротинина и добавив его в 20 мл dH2O. Aliquot фондовый раствор в 1 мл aliquots и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  3. Приготовьте 10 мл раствора бульона 80 мг/мл фибриногена.
    1. В 50 мл трубки добавить 7,849 мл фосфат буферного солевого раствора (PBS), 2,051 мл апротинина фонда (1218,75 KIU /mL) для окончательной концентрации апротинина 250 KIU/mL и 100 МКЛ CaCl2 (1M) для окончательной концентрации CaCl2 10 мМ.
    2. Взвесь 800 мг фибриногена.
    3. Взвесь 200 мг хлорида натрия (NaCl) для фондового раствора, чтобы содержать 2% ж / в NaCl.
    4. Добавьте фибриноген и NaCl с шагом к 50 мл трубки, содержащей PBS, апротинин и CaCl2. Не перемешивайте и не встряхивайте энергично, так как это приведет к гелеобразованию фибриногена и образуются комки в растворе.
    5. Поместите 50 мл трубки фибриногена фондового раствора горизонтально на шейкер и встряхните при низкой установке 300 об/мин.
  4. После растворения, фильтруйте его с помощью фильтра шприца 0,22 мкм или фильтра верхней бутылки в зависимости от объема. Важно, не автоклав фибриноген решение, как это уничтожит фибриноген.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола может занять от 2 до 5 ч в зависимости от количества запасов решения, на этот раз должны быть приняты во внимание во время экспериментальной установки.

2. Покрытие вставки с коллагеном до посева гидрогели на вставки

  1. В ламинарный капюшон потока или ткань культуры капюшон, используя стерилизованные пинцетом, удалить вставки из пластины и место перевернутый на крышку пластины.
  2. Приготовьте 100 мл 20 мМ ледниковой уксусной кислоты, добавляя 115 мл ледниковой уксусной кислоты в 25 мл dH2O и отрегулируйте до конечного объема 100 мл с dH2O. Фильтруйте раствор с помощью фильтра шприца 0,22 мкм. Решение для акций можно хранить на RT.
  3. Приготовьте 2 мл коллагенового раствора 100 мкг/мл из раствора коллагена 5 мг/мл, добавив 40 л коллагенового раствора 5 мг/мл в 1,960 мл раствора 20 мМ ледниковой уксусной кислоты, приготовленного в 2,2.
  4. Пальто вставки с 100 мкг / мл коллагена раствор подготовлен в 2,3 путем трубопроводов 100 МКЛ раствора на каждой вставке. Пусть вставки воздух сухой в ламинарный капюшон потока или ткани культуры капот для 2 до 3 ч.
  5. После вставки высохли мыть каждую вставку 3x с PBS. Добавьте 1 мл PBS к каждому колодцевому из 12 колодцев, поместите вставки с коллагеновым покрытием лицом вниз в колодцы, удалите PBS из колодца и повторите процедуру. Пусть вставки воздух сухой в ламинарный поток капот от 1 до 2 ч.
    ВНИМАНИЕ: Уксусная кислота токсична для клеток и вставки должны быть тщательно промыты PBS.
  6. Добавить пользовательские 3D печатных спейсер над вставками, это будет необходимо, как только гели висят от вставки, чтобы предотвратить их от прикосновения к нижней хорошо пластины (Рисунок 2).

figure-protocol-2
Рисунок 2: Пользовательские 3D печатных spacer Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Обложка перевернутые вставки с нижней частью пластины и место в инкубатор, пока клетки встроены в гидрогели и готовы быть посеяны.

3. Посевные клетки, встроенные в гидрогели на вставки

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 содержит описание 3 формулировок с различной концентрацией фибриногена, которые будут подготовлены. Формула одна соответствует печени во время начала фиброза, два цирроза печени и три HCC, значения жесткости для каждой из этих формулировок были определены с реологией во время оптимизации протокола.

ФормулировкаОкончательная концентрация фибриногена (мг/мЛ)Окончательная концентрация коллагена (мг/мЛ)Ячейки (LX2 и HepG2 Co-культура 1:1)Стадия печениЛитература печени жесткость значения (kPa)Значение модели Stiffness от Rheology (kPa)ФормулировкаФибриноген добавить (mL)Коллаген добавить (mL)10% DMEM (мл)Тромбин (ОЛ) Справкаs
11022 x 106 ячеек/млФиброз≥23110.80.2428; 29; 30
23022 x 106 ячеек/млЦирроз печени620.750.80.453
34022 x 106 ячеек/млHcc≥101030.250.80.95128; 31; 32

Таблица 1: Описание составов для посевных клеток, встроенных в гидрогели на вставки

  1. Приготовьте раствор гидроксида натрия 1 М натрия, добавив 3,99 г NaOH до 100 мл dH2O.  Решение может быть отфильтровировано с помощью фильтра шприца 0,22 мкм. Храните решение для акций на RT.
  2. Поместите коллаген 5 мг/мл и 10 мл 1 м NaOH на лед.
  3. Разогреть 50 мл PBS, 15 мл трипсина, 70 мл 10% DMEM, и фибриноген фондовый раствор, подготовленный в разделе 1, до 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут в водяной бане.
  4. Подготовь подвески клеток.
    1. Вымойте печеночные клетки стеллата (LX2) и клетки карциномы печени (HepG2) в культурных колбах T175 дважды с 10 мл PBS.
    2. Трипсинизировать клетки с 6 мл трипсина в течение 4 мин при 37 градусов по Цельсию.
    3. Инактивировать трипсин с 6 мл 10% DMEM.
    4. Соберите подвеску клетки в трубке 15 мл и центрифуге в течение 3 мин при 300 x g.
    5. После центрифугации, аспирировать супернатант и повторное течение каждой клеточной линии в 5 мл 10% DMEM.
    6. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячеек: добавьте 10 йл каждой ячейки подвески к слайду счетной камеры и вставьте слайд в счетчик ячейки. Количество ячеек отображается в качестве ячеек/мл.
    7. Разбавить клетки от каждой линии клетки до 1 х10 6 клеток на мл с помощью ячейки рассчитывать в шаге 3,4,6 в четко обозначены 15 мл труб. Центрифуга разбавления в течение 3 мин при 300 х г.
  5. После центрифугации, аспирировать супернатант и добавить 10% DMEM к каждой 15 мл трубки в соответствии с таблицей 1, значения, предусмотренные в таблице для 2 мл каждой формулировки.
  6. Нейтрализовать количество коллагена с 10 йл / мл NaOH (1 М), и добавить нейтрализованный коллаген в клеточной подвески, 10% DMEM настоящее станет желтым, как только подвеска смешивается тщательно трубопроводов с разрезом отзыв он станет ярко-розовый.
  7. Добавьте фибриноген к подвеске коллагеновых клеток в соответствии с таблицей 1, используя наконечник пипетки, тщательно перемешайте суспензию.
  8. Наконец добавить тромбин коллагена-фибриногена клеточной суспензии, 0,1 KIU тромбин на каждые 10 мг фибриногена.
  9. Удалите предварительно покрытые перевернутые вставки, подготовленные в разделе 2, из инкубатора и с помощью наконечника пипетки с разрезом 200 йл, пипетки 200 МКЛ подготовленной подвески на назначенные вставки. Разрешить гели для перекрестного в течение 15 минут в ламинарном капюшоне потока.
  10. Через 15 минут аккуратно поместите нижнюю часть пластины над гелями и переместите их в инкубатор, чтобы гели пересекались при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут.
  11. После того, как гели пересекли, инвертировать вставки снова и добавить 2 мл 10% DMEM к каждому из нижних скважин пластины.

4. Посев эндотелиальных клеток

  1. Разогреть 25 мл hanks сбалансированный раствор соли (HBSS), 10 мл трипсина, 10 мл ингибитор трипсина и 50 мл эндотелиального роста среды, до 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут в водяной бане .
  2. Подготовка эндотелиальной (HUVEC) клеточной подвески.
    1. Вымойте клетки HUVEC в культурных колбы T175 дважды с 10 мл HBSS.
    2. Трипсинизировать клетки с 6 мл трипсина в течение 4 мин при 37 градусов по Цельсию. Инактивировать трипсин с ингибитором трипсина 6 мл. Соберите подвеску клетки в 15 мл трубки и центрифуги в течение 3 мин при 200 x g.
    3. После центрифугации аспирируют супернатант и приостанавливают клетки в 5 мл эндотелиальной среды роста.
    4. Подсчитайте ячейки, как описано ранее в 3.4.6 с помощью автоматизированного счетчика ячейки.
    5. Используя количество клеток с клеточного счетчика, подготовьйте плотность посева 1,0 х10 4 клетки/мл в эндотелиальной среде роста.
  3. Семя 500 МКЛ подвески ячейки HUVEC в каждом колодец верхней части вставки, чтобы иметь окончательный объем 5,0 х 103 клеток на вставку.

5. Техническое обслуживание

  1. Заменить рост среды каждый второй день, аспират провел рост среды как из хорошо и вставки. Добавьте 2 мл 10% DMEM к скважинам, содержащим гель, и 0,5 мл эндотелиальной среды роста к вставок, содержащих клетки HUVEC.
  2. Поддерживайте модель в течение 21 дня до экспериментов.

6. Реология

  1. Измерьте модули хранения гелеобразующего крема, чтобы указать значения жесткости с помощью реометра, выполняя частотные зачистки от 0,1-20 Гц при 0,267% и 37 градусов по Цельсию, с постоянной аксиальной силой 0,1 Н с использованием геометрии 8 мм параллельной пластины из нержавеющей стали.

7. Жизнеспособность и ответные меры на наркотики

  1. Определите реакцию на наркотики и жизнеспособность в 2D-ко-культурах и 3D-модели.
    1. Seed HepG2 (5.0 x 103 клетки/мл) и LX2 (5.0 x 103 клетки/мл) клетки в соотношении 1:1 для 2D-ко-культуры в черные четкие нижние пластины 96-колодец при плотности посева 1,0 х 104 ячейки/мл.  Разрешить ячейки, чтобы прикрепить на ночь.
    2. Настройка 3D-модели в соответствует цирротической среде со значением жесткости 6 кПа.  Поддерживайте модель в течение 21 дня до лечения доксорубицина.
  2. За два часа до лечения доксорубицином, аспирировать культурную среду как из 2D и 3D модели. Вымойте обе модели дважды с PBS. Добавьте средства голодания (DMEM дополненные 1% v/v антимикотическим раствором антибиотика) к 2D co-культуре (200 l в наилучшим образом) и к модели 3D (2 mL к скважинам содержа гидрогель и 500 L к вставке).
  3. Администрирование доксорубицина как 2D, так и 3D-модели.  Дозировки следующие: 0,5, 1 и 1,5 мМ, соответствующие значениям IC25, 50 и 75 соответственно.  Лечить обе модели для 72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доксорубицин, ингибитор топоизомеразы II, является одним из первых химиотерапевтических препаратов, используемых дляHCC,а также является одним из самых активных химиотерапевтических агентов в лечении HCC33,34.
  4. После 72 ч, аспирированные среды культуры как от 2D и 3D модели. Убедитесь, что любая оставшаяся среда культуры удаляется путем мытья обеих моделей дважды с PBS.
  5. Подготовьтесь к AlamarBlue в соответствии с рекомендациями производителя и добавьте к скважинам 2D и 3D модель. Добавьте 150 мкл на колодец для 2D-культуры и 2 мл на колодец и 500 йл на вставку для 3D-культуры.  Инкубируется на ночь при 37 градусов по Цельсию.
  6. После инкубации передачи 150 йл AlamarBlue из каждой колодец 3D установки в черный ясный дно 96-хорошо пластины. AlamarBlue можно прочитать непосредственно с пластины для 2D-модели.
  7. Прочитайте флуоресценцию с помощью микропластинной считывателя на возбудительной длине волны и длине волны выбросов 485 и 550 нм, соответственно.
  8. Рассчитайте жизнеспособность процентных ячеев в обеих моделях, используя следующую формулу:
    figure-protocol-3

Результаты

Диапазоны концентрации и объем посева
Оптимизация протокола для получения окончательного протокола функционирования произошла в соответствии со схемой диаграммы, представленной на рисунке 3. Два физиологически соответствующих гидрогеля, коллаген типа I и Фибриноген, были выявлены с помощью поискалитературы 35,36.  Начиная с крысиного хвоста коллагена типа I, диапазон концентраций (4, 3, 2 и 1 мг/мл) был посеян на перевернутые вставки, чтобы определить их способность успешно придерживаться вставки один раз перевернутый снова. Все концентрации в этом диапазоне были в состоянии сформировать гели, однако коллагеновые гели появились сплющенные и были различные пузырьки воздуха в ловушке внутри них из-за обработки и трубопроводов, см. Рисунок 4 и рисунок 5. Для определения оптимального объема посева для улучшения качества коллагенового геля, диапазон объемов посева (100, 150 и 200 МКЛ), был посеян на перевернутые вставки, см. Рисунок 5.  Объем посева не повлиял ни на внешний вид геля, ни на наличие пузырьков внутри геля. В связи с этим было решено, что 200 МКЛ является оптимальным объемом посева, производящим самые полные гели. Фибриноген был также оценен за его способность производить гель, который может придерживаться вставки в течение длительного периода времени.  Диапазон концентрации (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 мг/мл) был подготовлен и посеян в объеме 200 л на крышке пластины 12-колодец, см. Рисунок 6. В течение 20 минут после посева все концентрации смогли успешно сформировать гель. Тем не менее, концентрации 5 и 1 мг/мл были исключены, так как образованные гели имели жидкость, такую как консистенция, и начали отделяться от крышки после того, как их держали на ночь при 37 градусах Цельсия.

figure-results-1
Рисунок 3: Схематическая диаграмма оптимизации протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 4: Коллагеновые гели 4 мг/мл, содержащие 1,0 х 105 клеток/мл, посеянных на вставки, показывающие пузырьки, присутствующие в геле. Вставка слева была дегазирована на льду в течение 15 минут, в то время как вставка справа не была дегазирована. Дегазации не имеют никакого влияния на пузырьки, присутствующие в гелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 5: Коллагеновые гели 4 мг/мл, содержащие 1,0 х 105 клеток/мл, посеянных на вставки в различных объемах. (A) Вставьте слева 100 МЛ, средний 150 МЛ и правый 200 йл, сразу после посева. Пузыри в гелях все еще присутствовали. (B) Вставьте слева 200 йл, средний 150 МКЛ и правый 100 МКЛ, после 60 мин перекрестного. Все гели независимо от объема по-прежнему кажутся плоскими. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 6: Фибриноген (200 л) в диапазоне концентрации от 70 до 1 мг/мл, посеянный на крышке пластины из 12 л. (A)Гели сразу после посева. (B) Гели 20 мин после посева. (C)Гели держали на ночь. Все гели появляются хорошо округлые, 5 мг / мл и 1 мг / мл гели были исключены, поскольку они, как представляется, более жидкости консистенции 20 минут после посева и начал отделяться от крышки после того, как держали на ночь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Комбинация коллагена и фибриногена
На основе результатов концентрации коллагена и фибриногена был оценен эффект сочетания коллагена и фибриногена. Три вставки были настроены следующим образом: коллаген 4 мг/мл, фибриноген 20 мг/мл и 1:1 рацион коллагена (4 мг/мл) и фибриногена (20 мг/мл), см. Рисунок 7. Непосредственно после посева гидрогели, мы заметили, что вставка с коллагеном только еще плоский вид в сочетании с появлением пузырьков в гель. Вставки с фибриногеном произвели полный и округлый гель, так же как и вставка с сочетанием коллагена и фибриногена. После перекрестного соединения при 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут, все гели были прикреплены к вставке и оставались прикрепленными после ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию.

figure-results-5
Рисунок 7: Влияние сочетания коллагена и фибриногена. (A) Коллаген 4 мг/мл посеян на вставке слева, фибриноген 20 мг/мл посеян на вставку в середине и коллаген 4 мг/мл, фибриноген 20 мг/мл (1:1 рацион) посеян на вставку справа. Все гели, посеянные в объеме 200 л, содержащие 1,0 х10 5 клеток/мл, все гели были скрещены в течение 60 мин при 37градусовпо Цельсию ( B ) Коллаген 4 мг/мл 60 мин после скрещивания, гель появился плоский и пузыри. (C) Вставьте на левом фибриногене 20 мг/мл, гель появляется округлый, пузырьков нет, вставьте на правый коллаген 4 мг/мл, фибриноген 20 мг/мл гель, гель хорошо округляется без пузырьков. (D) Коллаген 4 мг/мл гель после того, как держали на ночь при 37 градусов по Цельсию, гель по-прежнему содержит большое количество пузырьков, некоторые отек геля произошло. (E) Фибриноген 20 мг/мл хранится на ночь при 37 градусов по Цельсию ( F )Коллаген4 мг/мл, фибриноген 20 мг/мл гель хранится на ночь при 37 градусов по Цельсию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Определение плотности посева клеток
На основе предыдущего опыта работы с гидрогелями был проведен эксперимент по определению оптимальной плотности посева клеток (данные не показаны)37. Клетки были встроены в комбинацию коллагена и фибриногена в следующем диапазоне концентрации (7,5 х10 5, 8,5х 10 5, 9,5 х 105, 1,0 х Оптимальнойплотностью посевабыло признано 106 , 1,5 х 10х 2,0 х 10 6 клеток/мл), 2,0х 10 6 клеток/мл.

Реология
Десять составов комбинаций фибриногена и коллагена гидрогеля были оценены с помощью реологии, см. Таблицу 2. Цель состояла в том, чтобы определить, какие из этих формулировок могут имитировать жесткость печени видели во время развития HCC. Литература предоставила известные значения жесткости печени для крыс, мышей и людей во время фиброза, цирроза и HCC и цель состояла втом,чтобы получитькак можно ближе кэтимзначениям 28,29,30,31,32. Десять формулировок, как указано в таблице 2, были подготовлены в три раза, а модуль хранения каждого из них определялся с помощью реометра, результаты показаны на рисунке 8.

ФормулировкаФибриноген (мг/мл)Коллаген (мг/мл)
1602
2502
3402
4302
5202
6102
7205
8204
9203
10201

Таблица 2: Комбинации коллагена и фибриногена в различных концентрациях, оцениваемых с помощью реологии для определения значений жесткости

figure-results-6
Рисунок 8: Значения жесткости гидрогеля для комбинаций коллагена и фибриногена в различных концентрациях, оцениваемых с помощью реологии. Модуль хранения и модуль потери были определены на уровне 37 градусов по Цельсию и 1 Гц с помощью гибридного реометра Discovery HR-2 (n No 3, бары ошибок и SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Из этих десяти формул три были выбраны для продолжения. К ним относятся 2 мг/мл коллагена типа I и 10 мг/мл фибриногена, соответствующие значениям жесткости печени в начале фиброза, 2 мг/мл коллагена типа I и 30 мг/мл фибриногена, соответствующие циррозу и 2 мг/мл коллагена типа I и 40 мг/мл фибриногена, соответствующие HCC, см. Рисунок 9.

figure-results-7
Рисунок 9: Значения жесткости гидрогеля для различных формулировок гидрогеля Фибриногена/Коллагена, выбранных для продолжения.  Модуль хранения и модуль потери были определены на уровне 37 градусов по Цельсию и 1 Гц (n No 3, Бары ошибок и SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Жизнеспособность, реакция на наркотики и метастатический потенциал
Результаты анализа AlamarBlue показали общее снижение жизнеспособности клеток в рамках 2D совместной культуры, ниже, чем ожидалось, на основе известных сообщил IC 25, 50 и 75 значения, по сравнению с необработанным контролем, см. Рисунок 10. Это может быть связано с клетками LX2 в нашей совместной культуры, которые являются более чувствительными к лечению Doxorubicin. Однако в нашей 3D-модели мы заметили и увеличение резистентности к доксорубицину, подтвердив снижение химиотерапевтического потенциала, часто наблюдается в системах 3D-моделей. Статистическая значимость по сравнению с контролем оценивалась с помощью теста Student T (двуххвостый), при этом Пцлт;0,05 считался значительным.

figure-results-8
Рисунок 10: Процентная жизнеспособность клеток 2D модели совместной культуры по сравнению с 3D-моделью после лечения доксорубицином в различных концентрациях в течение 72ч. Результаты нормализовались по отношению к необработанному контролю (n'3, бары ошибок и SD) (яп.л.;0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Конструкции геля визуально были проверены ежедневно с помощью светового микроскопа, чтобы следить за ростом клеток в различных концентрациях гидрогелей. Клетки заполнили гидрогели однородным и компактным способом, с 7-го дня сфероиды начали собираться внутри матрицы.

Обсуждение

Этот протокол описывает разработку метода создания биомиметического модели для HCC. Установлен четкий рабочий процесс и определены критические шаги. Эти критические шаги включают в себя, подготовка фибриногена фондовый раствор, покрытие вставки коллагеном и посева клеток, вложенных в гидрогель. При приготовлении раствора фибриногена важно добавлять фибриноген небольшими шагами при более высоких концентрациях. Это не только сократит время, необходимое для фибриногена, чтобы раствориться, но также предотвратит фибриноген от гелеобразования непоследовательно и преждевременно, как по видно на рисунке 11. Подготовка фибриногенного геля занимает значительное количество времени, и это может повлиять на общий экспериментальный успех. Результаты показывают, что как только фибриноген гель начинает гель непоследовательно лучше отказаться от него. Вставки должны быть покрыты коллагеном, промыть PBS и высушить в ламинарном капюшоне потока до посева клеток, встроенных в гидрогели. Неспособность обеспечить сухую вставку приведет к тому, что гидрогель прольется по краям вставки, что приведет к неравномерности геля. Неравномерность геля в конечном итоге повлияет на результаты, где диффузия является фактором.

figure-discussion-1
Рисунок 11: Подготовка фибриногенного геля для фибриногенных/коллагеновых гидрогелевых составов. (A) Фибриноген гель раствор, который сформировал сгустки и начал гель преждевременно с неразрешено fibrinogen прилипания к трубке. (B)Фибриноген гель растворился полностью, раствор ясен и немного вязким. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рекомендуется работать как можно быстрее при посеве подвески гидрогелевых клеток на вставки, так как компонент фибриногена начнет пересекаться с добавлением тромбина.  Подготовка меньших рабочих объемов в то время, когда работа с гелем подвески в более высоких концентрациях, чтобы предотвратить гель от перекрестного во время посева. Последний будет иметь влияние на распределение и количество геля посеяны на каждой хорошо. Порядок добавления компонентов имеет решающее значение, в этом протоколе мы предоставили обтекаемый рабочий процесс, чтобы предотвратить преждевременное скрещивание гелей.  В связи с вязкостью гидрогеля гель подвески, работающих с разрезом пипетки наконечник рекомендуется во время смешивания и измерения.  При смешивании подвески убедитесь, что это делается быстро и равномерно для создания однородной подвески. Неравномерное смешивание приведет к неоднородный гель, который негативно повлияет на результаты, см. Рисунок 12.

figure-discussion-2
Рисунок 12: Коллаген / фибриноген гели посеяны на 12 пластин хорошо. Все гели посеяны в объеме 200 л, содержащий коллаген 2 мг/мл и 20 мг/мл фибриногена с 2,0 х 106 клеток/мл. (A)Гидрогель гель с неоднородной консистенцией, видимым неравномерным распределением гидрогелей. (B)Гидрогели однородно смешиваются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

После оптимизации протокола была проведена оценка модели для определения био-физических свойств моделей. Данные реологии показали, что наша модель, состоящая из физиологически релевантных внеклеточных компонентов матрицы, а именно коллагена типа I и фибриногена, смогла имитировать био-физические свойства фиброзной, цирротической и HCC печени28,29,30,31,32. Повторение жесткости печени в 3D-моделях для HCC имеет большое значение и часто упускается из виду во время разработки модели. Повышенная жесткость печени связана с химиотерапевтической устойчивостью, пролиферацию, миграцию и спячку внутри HCC38. В то время как активация печеночные клетки stellate в HCC связано с увеличением внеклеточной жесткости матрицы, с несколькими сигнальными путями, связанными с этими печеночными клетками stellate, показывающими механочувствительность39.

Включение стромы связанных клеток, таких как печеночные клетки стеллата и эндотелиальных клеток в развитие 3D-моделей для HCC становится все более актуальным. Исследования показывают, что многоклеточные сфероиды, состоящие из печеночных stellate и HCC клеток привело к увеличению химиотерапевтического сопротивления и инвазивной миграции, имитируя появление опухоли HCC in vivo, по сравнению с моделью мышей PXT и образцами тканей человека HCC17. Аналогичное исследование, проведенное Jung et al., 2017, показало, что многоклеточный сфероид, состоящий из гепатоцеллюлярной карциномы (Huh-7) и эндотелиальных (HUVEC) клеток, способствует васкуляризации иагрессивности 22. Эти сфероиды показали жизнеспособность при значительно более высоких концентрациях доксорубицина и сорафениба по сравнению с монокультурными сфероидамиHuh-7 22. Оценка жизнеспособности нашей модели и реакции на доксорубицин, с значениями жесткости, соответствующими значениям HCC и включением стромы связанных клеток (LX2 и HUVEC), показала аналогичное снижение в ответ на химиотерапию по сравнению с 2D моделью совместной культуры.  Таким образом, эффективно имитируя лекарственная устойчивость обычно наблюдается у пациентов и других 3D моделей HCC.

Поскольку это модульная система, модель может быть укреплена добавлением других внеклеточных матричных компонентов, а именно ламинина и гиалуроновой кислоты. Кроме того, нынешние гидрогели, используемые в этой модели, могут быть заменены синтетическими гидрогелями, такими как альгинат натрия или хитозан. Дальнейшим изменением нынешней модели может быть замена клеточных линий первичными клеточными культурами для создания еще более физиологически релевантной модели или с использованием комбинаций других опухолевых и стромальных клеточных линий.

Таким образом, мы успешно разработали 3D-модель с настраиваемыми био-физическими свойствами для изучения опухолевых взаимодействий в HCC.  Мы обнаружили, что наша модель более репрезентативна для ситуации in vivo по сравнению с традиционными 2D культурами в ответ на доксорубицин. Тем не менее, многое еще предстоит сделать, мы надеемся широко охарактеризовать эту модель и изучить модель в качестве возможной метастатической платформы, чтобы ответить на более сложные и насущные вопросы, которые остаются в исследовании HCC.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось за счет грантов, полученных от Шведского онкологического фонда (Cancerfonden, CAN2017/518), Шведского общества медицинских исследований (SSMF, S17-0092), фонда O.E. och Edla Johanssons и фонда Ольги Янссонс.  Эти источники финансирования не были задействованы в разработке исследования; сбор, анализ и интерпретация данных; написание доклада; и в решении представить статью для публикации. 3D-печать специально разработанных спейсеров, используемых в этом протоколе, была выполнена в U-PRINT: 3D-печать Университета Уппсалы в Дисциплинарном домене медицины и фармации, U-PRINT@mcb.uu.se. Мы хотели бы поблагодарить Пола О'Каллагана за его ценный вклад в наш проект.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AlamarBlue (Резазурин натриевая соль)Sigma211-500Приготовьте согласно рекомендациям производителя
Антимикотический раствор антибиотика (100&раз;), стабилизированныйSigmaA5955-100ML
Ингибитор протинина протеазыThermo Fisher Scientific78432
Кальция хлорид (CaCl2)SigmaC1016-2.5KGБезводные, гранулированные, ≤ 7,0 мм, ≥ Инкубатор 93,0%
CO2Kebo Biomed Швеция
Corning Черный, прозрачное плоское дно 96-луночная пластинаSigmaCLS3904-100EA
Corning HTS Transwell-24 хорошо проницаемые опорыSigmaCLS3396-2EAHTS Transwell-24 единицы с 0,4 μ мембрана из поликарбоната с порами и вставками 6,5 мм, обработанные TC, стерильные, 2/cs
Discovery Hybrid Rheometer 2TA instruments, Sollentuna, Sweden
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GlutaMAX (клетки LX2 и HepG2)Thermo Fisher Scientific61965059с добавлением 10% v/v FBS и 1% v/v антимикотического раствора
Endothelial Cell Growth Medium (500 мл) (HUVEC)Cell Applications, Inc211-500
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, формат One Shot, Новая ЗеландияThermo Fisher ScientificA3160902
фибриноген типа I-S из плазмы крупного рогатого скотаSigmaF8630-10G
FLUOstar Omega планшетный ридерBMG Labtech
Hanks' сбалансированный солевой растворSigmaH9394-500MLМодифицированный, с бикарбонатом натрия, без хлорида кальция и сульфата магния
Labogene scanspeed 416 центрифугаLabogene, Швеция
Ламинарный проточный колпакKebo Biomed Швеция
Mettler Toledo AG245 Аналитические весыMettler Toledo
Nikon TMS Light микроскопNikon, Япония
Фосфатный буферный солевой раствор таблеткаSigmaP4417-100TABПриготовьте в соответствии с рекомендациями производителя
Коллаген крысиного хвоста Тип I 5 мг/млIbidi50201
Sodium chloride (NaCl)SigmaS7653-1KG
Гидроксид натрия (NaOH)MerckB619298
TC20 Автоматизированный счетчик клетокBioRad
TC20 подсчет слайдовBioRad
Thrombin из плазмы крупного рогатого скотаSigmaT9549Порошок, подходящий для клеточных культур, ≥ 1,500 NIH единиц/мг белка (E1%/280 = 19,5)
Трипсин (2,5%) 10xThermo Fisher Scientificразбавить до 1x в PBS
ингибитор трипсина из глицина max (соя)SigmaT6414-100MLРаствор, стерильно-отфильтрованный

Ссылки

  1. Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
  2. Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
  3. Balogh, J., et al. Hepatocellular Carcinoma: A review. Journal of Hepatocellular Carcinoma. 3, 41-53 (2016).
  4. Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
  5. Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723(2019).
  6. Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
  7. Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
  8. Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
  9. Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
  10. Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24(2018).
  11. Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
  12. Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465(2017).
  13. Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332(2018).
  14. Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
  15. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
  16. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
  17. Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
  18. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
  19. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
  20. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  21. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  22. Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499(2017).
  23. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863(2019).
  24. Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
  25. Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  26. Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079(2015).
  27. Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
  28. Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  29. Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
  30. Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
  31. Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293(2013).
  32. Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
  33. Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
  34. Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
  35. Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
  36. Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
  37. Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
  38. Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
  39. Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299(2018).

Перепечатки и разрешения

Теги

3D-модель опухолигепатоцеллюлярная карциномаколлаген-фибриногеновые гидрогелиреологический анализтест на жизнеспособность клетокрезистентность к доксорубицинуэндотелиальные клетки HUVECклетки LX2 и HepG2частотное сканирование
Биомиметическая модель рака печени для изучения взаимодействия опухоли и стромы в 3D-среде с настраиваемыми био-физическими свойствами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.