Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка ангиогенетических свойств стволовых клеток рака яичников с использованием трехмерной системы кокультур, NICO-1

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61751

⸱

5 декабря 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Teikyo University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 3Devision of Cancer Differentiation, National Cancer Center Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Стволовые клетки рака яичников (OCSC) ответственны за начало рака, рецидив, терапевтическую резистентность и метастазирование. Считается, что сосудистая ниша OCSC способствует самообновлению OCSC, что приводит к хеморезистентности. Этот протокол обеспечивает основу для создания воспроизводимой модели сосудистой ниши OCSC in vitro.

Аннотация

Раковые стволовые клетки (CSC) находятся в поддерживающей нише, представляя собой микросреду, состоящую из соседних стромальных клеток, сосудов и внеклеточного матрикса. Способность ЦОК участвовать в развитии эндотелия представляет собой важную характеристику, которая непосредственно способствует общему пониманию механизмов опухолевого генеза и метастазирования опухоли. Целью данной работы является создание воспроизводимой методологии исследования опухолевой способности стволовых клеток рака яичников (OCSC). Здесь мы изучили механизм неоваскуляризации между эндотелиальными клетками и OCSC наряду с морфологическими изменениями эндотелиальных клеток с использованием модели совместной культуры in vitro NICO-1. Этот протокол позволяет визуализировать стадию неоваскуляризации, окружающую OCSC, с течением времени. Метод может дать представление об ангиогенетических свойствах OCSC в метастазировании опухоли.

Введение

Рак яичников является восьмым наиболее распространенным злокачественным новообразованием у женщин во всем мире, с примерно 300 000 новых диагнозов и, по оценкам, 180 000 смертей в год1. При первоначальной диагностике рак яичников часто проявляется тяжелыми симптомами, причем около 75% пациенток уже находятся на стадии III-IV. Соответственно, 5-летняя выживаемость составляет <30%, а смертность является самой высокой среди гинекологических раковых заболеваний2, причем эффективность лечения рака яичников сильно зависит от клинических факторов, таких как успешное выполнение операции по удалению, устойчивость к химиотерапии и рецидив после начальной терапии.

Ткани рака яичников иерархически организованы, причем не все опухолевые компоненты одинаково способны генерировать потомков. Считается, что единственные клетки, способные самообновляться и продуцировать гетерогенную популяцию опухолевых клеток, представляют собой раковые стволовые клетки (CSC)3. Самообновление CSC и инициация опухоли сопровождаются продвижением ангиогенеза для ремоделирования их опухолевого микроокружения с целью поддержания поддерживающей ниши. Однако предыдущие модели не могли быть использованы для анализа in vitro из-за ограниченной воспроизводимости культивирования CSC, полученных из клинических образцов, из-за нарушения сфероидов после многократного прохождения. Совсем недавно экспериментальные методы культивирования CSC у пациентов были разработаны для нескольких применений 4,5,6,7. В частности, используя характеристику CSC для роста путем формирования сфероидов в сверхнизких пластинах прикрепления со свободной от сыворотки средой, культивируемые CSC индуцируются к экспрессии маркера поверхности стволовых клеток, который не экспрессируется в нормальных опухолевых клетках с многолинейным потенциалом дифференцировки 8,9.

Последние данные показали, что персистенция спящих яичников (O)CSC, визуализируемых как диссеминация в брюшине, связана с их регенерацией в виде рецидивирующих опухолей10. Таким образом, понимание молекулярных и биологических особенностей OCSC может позволить эффективно нацеливаться и эрадикации этих клеток, что приводит к потенциальной ремиссии опухоли. В частности, мало что известно о клеточных и молекулярно-механистических особенностях ролей ЦОНа в ангиогенезе11. Поэтому в настоящем протоколе мы использовали OCSC, полученные от пациента, в условиях in vitro для исследования ангиогенного свойства эндотелиальных клеток с использованием модели ко-культуры, которая может имитировать микроокружение опухоли CSC и эндотелиальных клеток в метастатическом месте в клинических условиях. В конечном счете, поскольку неоваскуляризация представляет собой критический процесс, необходимый для поддержки роста опухоли и метастазирования, лучшее понимание ее механизма позволит разработать новую таргетную терапию для OCSC в метастатическом месте.

Здесь мы представляем протокол для визуализации шага неоваскуляризации, окружающего CSC, с течением времени. Преимущество протокола включает в себя возможность полностью воспроизводимых исследований с использованием 3D-системы кокультуры NICO-1, что позволяет наблюдать за воздействием на пациентов способности инициации опухоли, полученной из OCSC, во время эндотелиального клеточного ангиогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры выполнялись в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по этике благосостояния человека. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на исследовательское использование их образцов, а сбор и использование тканей для этого исследования были одобрены Комитетом по этике исследований генома человека, генного анализа в Университете Тейкё.

1. Выделение и культивирование стволовых клеток рака яичников (OCSC) у пациентов с раком яичников и асцитом в кабинете биобезопасности уровня 2

  1. Изолируйте раковые стволовые клетки из асцита рака яичников человека, полученного с помощью парацентеза. Соберите не менее 100-250 мл асцита у пациентов, чтобы взять достаточное количество раковых стволовых клеток. Кроме того, оцените профили экспрессии маркеров раковых стволовых клеток (т.е. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 и Oct4) и маркеров рака яичников (pAX-8, WT-1) с помощью проточной цитометрии.
    1. Центрифугируют асцит рака яичников человека при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре в течение 24 ч после аспирации асцита.
    2. Удалите надосадочный материал и добавьте 2 мл среды OCSC и 8 мл 30% раствора гистоденза/фосфатного буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,4).
    3. Подготовка среды OCSC: добавка StemPro hESC, DMEM⁄F-12 с L-глютамином (среда GlutaMAX), 25% BSA, 100 мкМ 2-меркаптоэтанола, 8 нг/мл FGF BASIC, 10 мкМ инсулина и 20 мкМ Y-27632.
    4. Осторожно накладывайте 2 мл среды OCSC на раствор ячейки на стадии 1.1.2 в трубку 15 мл и центрифугу при 450 х г в течение 20 мин при комнатной температуре в роторе с качающимся ковшом без торможения.
    5. Аккуратно перенесите слой OCSC (не нарушенный на межфазе) на новую трубу объемом 15 мл путем перекачки пипетки.
    6. Наполните PBS до 15 мл. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и удаляют супернатант.
    7. Повторное суспендирование клеточной гранулы в среде OCSC и семена на чашке для культивирования со сверхнизким прикреплением; культуры следует поддерживать при температуре 37 °C в 5% CO2.
    8. Меняйте среду каждые три дня. Осторожно выдержите блюдо для культуры около 1 минуты, выбросьте часть супернатанта и добавьте новую среду.
  2. Прохождение ЦОНов
    1. Собирают OCSC в пробирке 15 мл и центрифуге при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Удалите супернатант, заполните PBS и центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Удалить надосадочный агент, добавить 1 мл раствора для отсоединения клеток, состоящего из протеолитических и коллагенолитических ферментов (например, AccuMax), и инкубировать при 37 °C в течение 10 мин.
    4. Хорошо перемешать путем пипетки и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Убедитесь, что клетки находятся в одной суспензии.
    5. Хорошо перемешать путем пипетки, залить ПБС и центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Удалите супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в среде OCSC для последующего посева на чашках для культивирования со сверхнизким прикреплением и поддержания при 37 °C в 5% CO2.

2. Культура эндотелиальных клеток HUEhT-1

  1. Прохождение ячеек HUEhT-1
    1. Удалите среду из чашки для культивирования HUEhT-1 и вымойте клетки PBS.
    2. Добавить 1 мл 0,025% трипсина и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
    3. Добавьте 5 мл среды роста эндотелиальных клеток 2, соберите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Удалите супернатант, повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде HUEhT-1 и посейте клетки на покрытые коллагеном культуральные чашки с последующим поддержанием при 37 °C в 5% CO2.
    5. Меняйте среду каждые три дня.

3. Подготовка кокультурной пластины NICO-1 для трубообразующего анализа с использованием клеток HUEhT-1

  1. Собирают NICO-1 и покрывают внеклеточным матриксом на основе гидрогеля (Matrigel Matrix).
    1. Соберите одну сторону NICO-1 в соответствии с инструкциями производителя и держите на льду.
    2. Накройте поверхность NICO-1 300 мкл холодного PBS, а затем удалите буфер.
    3. Добавьте 300 мкл охлажденного гидрогеля на основе внеклеточного матрикса и инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин.
    4. Чтобы уравновесить, погрузите фильтр со 100% этанолом, затем промывайте 13-мм ICCP-фильтр (0,6 мкм) PBS в течение 1 мин.
    5. Соберите NICO-1, включающий обе основные части корпуса A (правая камера) и B (левая камера), а также кольцо O и уравновешенный фильтр.

4. Посев клеток HUEhT-1 и CSC в систему NICO-1

  1. Приготовьте клеточные суспензии HUEhT-1 путем трипсинизации клеточных монослоев и повторного использования клеток в среде роста эндотелиальных клеток с 2% сывороткой для телят плода.
  2. Добавьте 1,2 мл клеточной суспензии (1,5 х 105 клеток) к каждому хорошо покрытому гидрогелевым покрытием на основе внеклеточного матрикса.
  3. Добавьте 1,5 мл OCSC, культивируемых в течение пяти дней, в другую скважину.
  4. Инкубировать НИКО-1 при 37 °С в 5%СО2; Образование трубки можно наблюдать под микроскопом, а формирование сети на гидрогеле на основе внеклеточного матрикса измеряется с помощью количества ветвей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы собрали асцитовые жидкости, полученные от пациенток с прогрессирующим раком яичников во время операции или парацентеза с целью выполнения долгосрочной стабильной культуры для сфероидов. Здесь мы представляем случаи долгосрочной сфероидной культуры Яичников, называемой CSC1 и CSC2. Обе клеточные линии несут один и тот же диагноз и гистологические профили. Механистические роли OCSC, лежащие в основе взаимодействия с эндотелиальными клетками, необходимыми для индуцирования неоваскуляризац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный протокол описывает, как имитировать микроокружение опухоли OCSC в условиях in vitro. Первичный компонент метода представляет собой высоковоспроизводимую модель кокультуры, полученную с использованием системы NICO-1, косвенной системы кокультур Transwell. Многие из доступных в настоящее время моделей кокультуры изучают влияние прямого клеточного контакта на кокутивируемые клеточные популяции 12,13,14,15,16,17,18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом на научные исследования C (грант No 19K09834 для K.N.) от Министерства образования, науки и культуры Японии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,025% Трипсин ThermoR001100
10 мл ПипеткаThermo170356N
1250 &микро; L Наконечник для дозатораQSPT112XLRS-Q
15 мл Nunc339650
200 &; L Наконечник для дозатораQSPT110RS-NEW
2-меркаптоэтанолThermo (Gibco)21985023
5 мл ПипеткаThermo170366N
50 мл ТрубкаCorning430290
AccuMAXInnovative Cell TechnologiesAM105
BioCoatTM Collagen I 60 мм ТарелкаCorning 356401
ЦентрифугаKUBOTA2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCellC-22011 
ЭтанолWAKO057-00456
FGF-BasicThermo (Gibco)PHG0021
HistodenzSIGMAD2158
HUEhT-1 элементJCRB Cell BankJCRB1458
ICCP Filter 0.6 µ mGinrei Lab.2525-06
Инсулин, человеческийSIGMA (Roche)11376497001
ЛюминометрPerkinElmerARVO MX-flad
Matrigel MatrixCorning 356234
микроскопYokogawaCQ-1
NICO-1Ginrei Lab.2501-02
OptiPlate-96PerkinElmer6005290
P1000 ПипетGilsonF123602
P200 ПипеткаGilsonF123601
PBSThermo (Gibco)14190-144
StemPro hESC SFMThermo (Gibco)A1000701
Передаточная пипеткаFALCON357575
Y-27632WAKO253-00513

Ссылки

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  3. Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
  4. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  5. Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
  6. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  7. Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
  8. Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
  9. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  10. Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).
  11. Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413(2020).
  12. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
  13. Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
  14. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
  15. Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
  16. Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
  17. Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  18. Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
  19. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  20. De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
  21. Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
  22. Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
  23. Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стволовые раковые клетки рака яичниковстволовые раковые клеткисистема 3D-сокультивированиясистема NICO-1анализ формирования трубоксокультивирование эндотелиальных клетокцентрифугирование в градиенте плотностисверхнизкая адгезиягидрогель внеклеточного матриксаформирование сосудистых трубок
Оценка ангиогенетических свойств стволовых клеток рака яичников с использованием трехмерной системы кокультур, NICO-1
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.