Методическая статья

Культивирование трехмерного реконструированного эпидермиса человека в больших масштабах

14.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61802

⸱

28 мая 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает простой метод культивирования трехмерного восстановленного эпидермиса человека воспроизводимым и надежным способом. Кроме того, он характеризует структурно-функциональную взаимосвязь модели эпидермального барьера. Также представлены биологические реакции восстановленного эпидермиса человека на провоспалительные раздражители.

Аннотация

Представлена трехмерная модель эпидермиса человека, реконструированная из неонатальных первичных кератиноцитов. Здесь описан протокол процесса культивирования и характеристики модели. Неонатальные первичные кератиноциты выращивают погружаются на проницаемые поликарбонатные вставки и поднимаются на воздушно-жидкостную границе через три дня после посева. После четырнадцати дней стимуляции с определенными факторами роста и аскорбиновой кислотой в культуральной среде с высоким содержанием кальция модель полностью дифференцирована. Гистологический анализ выявил полностью стратифицированный эпидермис, имитирующий морфологию нативной кожи человека. Для характеристики модели и ее барьерных функций уровни белка и локализация, специфичные для дифференцировки кератиноцитов на ранней стадии (т.е. кератина 10), дифференцировки поздней стадии (т.е. инволукрина, лорикрина и филаггрина) и тканевой адгезии (т.е. десмоглеина 1), оценивали иммунофлуоресценцией. Целостность тканевого барьера дополнительно оценивали путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления. R-эконструированный эпидермис человека реагировал на провоспалительные стимулы (т.е. липополисахарид и фактор некроза опухоли альфа), что приводило к увеличению высвобождения цитокинов (т.е. интерлейкина 1 альфа и интерлейкина 8). Этот протокол представляет собой простой и воспроизводимый метод in vitro для культивирования реконструированного эпидермиса человека в качестве инструмента для оценки воздействия на окружающую среду и широкого спектра исследований, связанных с кожей.

Введение

Эпидермис – это самый внешний слой кожи, на прямом стыке между организмом человека и внешней средой. Его основные функции заключаются в обеспечении защиты и гидратации1. Эпидермис действует как эффективный физический барьер против внешних агентов и предотвращает чрезмерную потерю воды из организма. Эти функции кожи в основном зависят от клеточного расположения в самых внешних слоях кожи, состава и организации межклеточных липидов2. Эпидермис в основном состоит из кератиноцитов, которые мигрируют вверх на внешнюю сторону ткани и подвергаются дифференцировке. Различают 4-5 эпидермальных слоев, которые характеризуются стадией дифференцировки. Изнутри наружу эпидермальные слои начинаются от жизнеспособного эпидермиса, т. е. базального слоя (SB), слоя спинозума (SS) и гранулезного слоя (SG), до неживостного верхнего слоя, т. е. рогового слоя (SC)3. Базальный слой в основном состоит из пролиферирующих кератиноцитов, обогащенных кератином, которые мигрируют через SS при дифференцировке4. Во время созревания кератиноцитов происходят различные изменения в экспрессии и структуре белка. Кератиноциты прилипают через образование десмосомных соединений5. В СГ инициируется генерация ламеллярных тел. Они состоят из липидных предшественников и ферментов, которые имеют решающее значение для формирования кожной барьерной функции6. SG также характеризуется наличием гранул кератохьялина в цитоплазме кератиноцитов. На границе с SC содержимое ламеллярных тел выдавливается в межклеточные пространства, а неполярные липиды, такие как керамиды, холестерин и свободные жирные кислоты, организуются в сложенные ламеллярные липидные бислои с образованием внеклеточного липидного матрикса7. В SC клетки теряют все клеточные органеллы, включая ядро, из-за процессов ферментативной деградации и принимают уплощенную морфологию. Они окружены ороговелой оболочкой, состоящей из сшитых белковых слоев, и называются корнеоцитами8,9. Десмосомные компоненты сшиты с ороговеванием, образуя корнеодезмосомы и связывая корнеоциты вместе. Полученный эпителий постоянно обновляется из стволовых клеток, со временем оборота примерно 5-6 недель10. Процесс дифференцировки кератиноцитов, в результате которого возникает полностью стратифицированный эпидермис, имеет решающее значение для формирования барьерной функции кожи11.

Во время ранирования и воспаления кератиноциты индуцируют изменения в молекулах адгезии и поверхностных рецепторах и вызывают провоспалительные реакции путем секреции цитокинов, хемокинов и антимикробныхпептидов 12. Кожа является не только физическим барьером против экзогенных веществ; он также действует как иммунный датчик при воздействии патогенов. Кроме того, он регулирует диффузию нескольких веществ через свои слои, таких как содержание воды, чтобы защитить организм человека от обезвоживания. Кожа также участвует в синтезе витамина D и имеет различные другие метаболические функции3,13,14.

Для оценки неблагоприятного воздействия экзогенных веществ токсикологи десятилетиями полагались на испытания на животных, но в настоящее время это не является предпочтительным подходом. Помимо ограниченной прогностической способности к токсичности для человека, животные модели связаны с многочисленными этическими проблемами. Запрет на испытания на животных в косметической промышленности и рекомендация следовать принципу 3R (т.е. замена, сокращение и уточнение) в исследованиях привели к разработке альтернативных методов испытаний, основанных на подходах in vitro15. Первые модели клеток кожи in vitro уже были описаны в 90-х годах, и впечатляющее развитие от простых монокультур кератиноцитов человека до полностью дифференцированных моделей эпидермиса и полной толщины было достигнуто16. В настоящее время инженерия тканей кожи приобрела важное значение как в фармацевтической, так и в дермато-косметической областях. За последние два десятилетия несколько компаний коммерциализировали трехмерные (3D) реконструированные эпидермисы человека (RhE), которые представляют собой стандартизированные и воспроизводимые инструменты для исследований, связанных с кожей. Несколько коммерческих моделей RhE принимаются для тестирования in vitro на химические вещества в соответствии с руководящими принципами ОЭСР для тестирования раздражения кожи17,18 (т.е. руководство по испытаниям 43919)и коррозии кожи20 (т.е. руководство по испытаниям 43121). Тест in vitro для сенсибилизации кожи22 (т.е. анализ SENS-IS) в настоящее время находится на пути утверждения и находится на экспертной оценке23. Существует также множество других разработанных анализов, которые используют коммерческие модели RhE, для оценки фототоксичности24,для тестирования лекарственных составов25,косметических составов и активных ингредиентов26,для изучения барьерной функции кожи27 и для проверки биологической реакции на стрессоры окружающей среды28,29,30,31.

В дополнение к коммерчески доступным 3D-моделям кожи, несколько исследовательских групп разработали свои собственные RHEs32,33,34,35,36,37. Штатные RH предлагают преимущество для контроля условий культуры в соответствии с целью исследования. В частности, исследователи могут выбрать тип и источник кератиноцитов, которые будут использоваться для восстановления их 3D-эпидермальной модели (то есть первичной и увековеченной, неонатальной и возрастной, одиночных и объединенных случайных доноров, пола, этнической принадлежности, индивидуальных привычек жизни, таких как курение и т. Д.). Они имеют возможность варьировать состав питательной среды и включать факторы роста, витамины или другие соединения, которые могут модулировать экспрессию целевых белков или липидов. С помощью штатных RH исследователи также могут исследовать биологические реакции и биомеханические свойства в функции состояния дифференциации 3D-модели. В дополнение к этим интуитивным параметрам предпринимаются постоянные усилия по увеличению сложности 3D-моделей кожи и повышению их физиологичности, например, путем добавления других типов клеток эпидермиса (например, меланоцитов и иммунных клеток)38,39,путем культивирования кератиноцитов поверх заполненной фибробластами коллагеновой матрицы40,41,42и путем включения компонентов сосудистой сети43,44,45.

Хотя можно настроить условия культуры в соответствии с конкретными потребностями, существуют параметры, которые необходимо соблюдать, чтобы гарантировать как качество, так и актуальность RHE. Для культивирования тканей RhE нормальные эпидермальные кератиноциты человека (NHEKs) засеивают в специфические проницаемые культуральные вставки, пористая синтетическая мембрана которых разделяет колодцы на два отсека, т. е. апикальный и базолатеральный компартмент. Пористость мембраны (т.е. размер пор 0,4 мкм) такова, что она позволяет формировать клеточный монослой в апикальном отсеке без миграции клеток на сторону базальной вставки и питать кератиноциты необходимыми питательными веществами из питательной среды, содержащейся в базолатеральном компартменте. В начале процесса восстановления NHEK культивируют в погруженных условиях в течение нескольких дней, чтобы обеспечить их адгезию к мембране. Уровень кальция в обоих компартментах повышен по сравнению с концентрацией кальция, используемой для 2D-культуры NHEKs, чтобы замедлить пролиферацию клеток и способствовать вместо этого их дифференцировки46. Эпидермальный градиент кальция необходим для регулирования образования барьера и гомеостаза47,48. Высокие уровни кальция (т.е. до 1,5 мМ) способствуют образованию межклеточных соединений и модулируют формирование ороговелой оболочки при терминальной дифференцировки49. Как только кератиноциты образуют непрерывный и плотно прилипающий монослой на опорной мембране, среда из апикального отсека удаляется и процесс культивирования продолжается на воздушно-жидкостной границе (АЛИ) для стимуляции расслоения и установления эпидермальногобарьера50,51. Специфические условия культивируют решающее значение для получения полностью стратифицированного эпителия36. Во время процесса восстановления в ALI среда в базолатеральном компартменте дополняется фактором роста кератиноцитов (KGF), инсулином, кальцием и аскорбиновой кислотой. Аскорбиновая кислота играет важную роль в формировании соответствующего липидного барьера SC, очень напоминающего таковой нативной кожи человека52. Кератиноциты, выращенные в среде, дополненной аскорбиновой кислотой, демонстрируют дифференцированный фенотип, с повышенным количеством гранул кератохиалина, а также организованные межклеточные липидные ламели в интерстициях корнеоцитов52. Такие добавки необходимы для улучшения эпидермальной барьерной функции путем увеличения содержания ороговелования оболочки и предотвращения истощения запасов гидрофильных антиоксидантов53,54. KGF, важный паракринный медиатор эпидермальной пролиферации и дифференцировки, используется для стимуляции NHEKs55.

К основным недостаткам штатных RH можно отнести потерю стандартизации между научно-исследовательскими институтами и увеличение трудоемкости и трудоемкости (до 3 недель по сравнению с готовыми к использованию коммерческими моделями). Цель настоящего документа состоит в том, чтобы устранить эти недостатки, заложив основу для производства в более широких масштабах. В дополнение к вышеупомянутым преимуществам внутренних RH, текущий протокол направлен на снижение внутри- и взаимовариантности между тканями, снижение рисков загрязнения и оптимизацию процесса культивирования.

Текущий протокол описывает воспроизводимый и надежный метод культивирования RHes с использованием неонатальных NHEK. Кроме того, показаны репрезентативные результаты характеристики морфологии RHEs, барьерной целостности и экспрессии белков, специфичных для эпидермальной дифференцировки. Морфологическая структура RHes исследовалась с помощью окрашивания гематоксилина и эозина (H&E) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM). Для оценки целостности барьера измеряли трансэпидермальное электрическое сопротивление (TEER) и время воздействия Triton X-100 для снижения 50% жизнеспособности ткани (ET50). Образование десмосомных соединений (т.е. десмоглеина 1) анализировали иммунофлуоресценцией (ИФ) для оценки адгезии кератиноцитов. Образование эпидермальных структурных белков (т.е. инволукрина, лорикрина и филаггрина) оценивали и обнаруживали с помощью ИФ. Эти белки участвуют в формировании высокосшитой белковой оболочки, которая окружает корнеоциты SC и, как следствие, являются важными маркерами для поздней стадии эпидермальной дифференцировки56,57. Кроме того, IF использовали для анализа кератина 10, белка, индуцированного в дифференцированных клетках на ранней стадии в SS58 и обнаруженного во всех дифференцированных слоях. Наконец, была исследована реакция RhE на провоспалительные стимулы (т.е. липополисахарид и фактор некроза опухоли альфа). Уровни интерлейкина 1 альфа (IL-1α) и интерлейкина 8 (IL-8) измеряли в среде клеточной культуры с использованием иммуноферментных анализов (ИФА).

Протокол

Пересматривать и придерживаться национальных и международных этических соображений и условий, связанных с использованием тканей или клеток человека, прежде чем планировать и выполнять любую исследовательскую деятельность, связанную с этим протоколом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы этого протокола должны выполняться в асептических условиях. Практика биобезопасности уровня 2 является минимальным требованием для выращивания RHEs. При обращении с химическими веществами/реагентами, описанными в настоящем протоколе, должны быть приняты все необходимые меры предосторожности.

1. Приготовление среды для клеточных культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования RHEs используются три различных типа безывороточных культуральных сред (таблица 1): (i) базальная среда с низким уровнем кальция (60 мкМ Ca2+),используемая для 2D-культуры NHEKs; ii) погруженная среда с высоким уровнем кальция (1,5 мМ Ca2+),используемая для посева NHEKs в систему вставки клеточной культуры; и iii) среда с интерфейсом воздух-жидкость (ALI) с высоким уровнем кальция (1,5 мМ Ca2+),аскорбиновой кислотой и фактором роста кератиноцитов (KGF).

ТерпимаяИнформация о носителеНеобходимое количество
Базальная средаКератиноцитарная среда роста36 мл/24 скважины
+ 1 % [об/об] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x антибиотик-антимикотический
Погруженная средаКератиноцитарная среда роста36 мл/24 скважины
+ 1 % [об/об] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x антибиотик-антимикотический
+ 1,5 мМ Ca2+
Воздушно-жидкостная интерфейсная средаКератиноцитарная среда роста216 мл/24 скважины
+ 1 % [об/об] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x антибиотик-антимикотический
+ 1,5 мМ Ca2+
+ 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты
+ 10 нг/мл фактора роста кератиноцитов

Таблица 1. Сводная таблица различных культур, используемых для культивирования RHEs. Список различных культур с добавками.

  1. Подготовьте базальную среду.
    1. Дополнить флакон 500 мл питательной среды кератиноцитов(Таблица материалов)5 мл добавок роста кератиноцитов человека (HKGS) для достижения конечных концентраций 0,2% [v/v] экстракта гипофиза крупного рогатого лова (BPE), 0,2 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (EGF), 0,18 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл бычьего трансферрина и 0,01 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-I).
    2. Добавьте 5 мл 100-кратного антибиотико-антимикотического раствора, содержащего 10 000 единиц/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл амфотерицина B.
  2. Подготовьте погруженную среду.
    1. Дополнить флакон 500 мл кератиноцитарной питательнойсреды (Таблица материалов)5 мл HKGS для достижения конечных концентраций 0,2% [v/v] BPE, 0,2 нг/мл человеческого рекомбинантного EGF, 0,18 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл бычьего трансферрина и 0,01 мкг/мл рекомбинантного ИФР-I человека.
    2. Добавьте 5 мл 100-кратного антибиотического антимикотического раствора.
    3. Добавьте 5 мл раствора 0,144 МCaCl2 (хлорид кальция) для достижения конечной концентрации 1,5 мМ Ca2+.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация кальция уже увеличивается во время погружной фазы, чтобы стимулировать дифференцировку кератиноцитов и инициировать процесс стратификации49.
  3. Подготовьте воздушно-жидкостную интерфейсную среду (ALI).
    1. Дополнить одну бутылку 500 мл кератиноцитарной питательнойсреды (Таблица материалов)5 мл HKGS для достижения конечных концентраций 0,2% [v/v] BPE, 0,2 нг/мл человеческого рекомбинантного EGF, 0,18 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл бычьего трансферрина и 0,01 мкг/мл рекомбинантного IGF-I человека.
    2. Добавьте 5 мл 100-кратного антибиотического антимикотического раствора.
    3. Добавьте 5 мл 0,144 МCaCl2 для достижения конечной концентрации 1,5 мМ Ca2+.
    4. Добавьте 1 мл раствора аскорбиновой кислоты 25 мг/мл для достижения конечной концентрации 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты.
    5. Добавьте 50 мкл 100 мкг/мл KGF в 1% [мас./об.] бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) для достижения конечной концентрации 10 нг/мл KGF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку аскорбиновая кислота чувствительна к окислению, рекомендуется использовать стабильное производное аскорбиновой кислоты, такое как магний l-аскорбил-2-фосфат59 или L-аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагний60. Если используется аскорбиновая кислота, рекомендуется перед каждым освежающим средством свежее дополнение среды ALI аскорбиновой кислотой.

2. Культура НХЭКов

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку первичные кератиноциты человека остаются пролиферативными при их четвертом или пятом проходе61,NHEK в их третьем проходе используются для культивирования RHEs. С первичными кератиноцитами следует обращаться очень осторожно из-за их высокой чувствительности. Тщательное и медленное пипетирование клеточных суспензий в любое время очень важно, чтобы не нарушить состояние клеток.

  1. Разморозьте флакон с 1 х10 6 криоконсервационными НХЭКс на водяной бане при 37 °C, погрузив часть флакона в воду. Высиживайте флакон в течение 1-2 минут на водяной бане, пока не будет виден только небольшой кусочек льда.
    ВНИМАНИЕ: Не погружайте весь флакон в водяную баню, чтобы избежать загрязнений. Не размораживать клетки дольше 2 минут; это может снизить жизнеспособность клеток. Протрите флакон 70% раствором этанола перед переносом тюбика в ламинарную вытяжку.
  2. Повторно суспендируете клетки очень осторожно, путем пипетки вверх и вниз 2-3 раза. Переложите клеточную суспензию в две колбы T75, содержащие в общей сложности 15 мл предварительно нагретой оттаивающей среды, в результате чего плотность посева составит 6,7 х 104 ячейки/см2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для первых двух проходов и размораживания криоконсервных НХЭК используется клеточная культуральная среда в соответствии с рекомендациями поставщика.
  3. Поместите колбы в инкубатор клеточной культуры (37 °C, 5% CO2и относительная влажность 95%).
  4. Примерно через 24 часа замените оттаивающую среду базальной средой для удаления диметилсульфоксида (ДМСО) из раствора для замораживания кератиноцитов.
  5. Обновляйте базальную среду каждые два дня.
  6. После 4-6 дней культивирования клетки должны быть около 80% вливания и готовы к посеву во вставки для выращивания RHEs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кератиноциты должны быть выращены до максимального 80% слияния, чтобы сохранить их пролиферативную способность62. Количество клеток, которые будут разморожены, должно учитывать несколько параметров, таких как число прохождения клеток, жизнеспособность клеток при оттаивании, эффективность посева, а также время удвоения.

3. Посев НХЭКов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для использования в формате несущей пластины с 24 скважинами. Если требуются другие форматы пластин (например, формат 12 скважин или 6 скважин), следует рассмотреть возможность оптимизации плотности посева и объема среды. На рисунке 1 обобщены предлагаемые сроки культивирования RHE и показаны условия выращивания.

Схема процесса дифференцировки кератиноцитов, метод воздушно-жидкостного интерфейса, рост эпидермиса человека.
Рисунок 1:Схематическая временная шкала протокола восстановления. Презентация подготовки модели RHE, процесса культивирования и применения (воздействие химического вещества). Схема включает соответствующие типы сред клеточных культур для каждого этапа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Предварительно заполните 24-скважинные пластины 1,5 мл погруженной среды, в идеале используя дозаторную пипетку.
  2. Удалите базальную среду из колб T75, используемых для культивирования NHEKs.
  3. Промыть клетки, добавив 5 мл предварительно подогретого PBS в каждую колбу T75.
  4. Извлеките PBS из колб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, так как среда содержит белки и кальций, которые будут ингибировать активность трипсина.
  5. Добавьте 2-3 мл предварительно нагретой 0,05% [v/v] трипсина/этилендиамина тетра уксусной кислоты (ЭДТА) в каждую колбу T75. Убедитесь, что раствор трипсина равномерно распределен по площади клеточной культуры колбы.
    ВНИМАНИЕ: Объем 2 мл основан на 80% слиянии, упомянутом выше. Используйте 3 мл для колбы с более высокой стючностью.
  6. Поместите колбы на 4 минуты в инкубатор клеточной культуры (37 °C, 5% CO2и 95% RH). Проверьте, отсоехнут ли клетки с помощью микроскопа при 10-кратном увеличении. Прижимайте колбу к ладони, чтобы помочь клеткам освободиться от поверхности колбы. Отслоивающиеся клетки можно наблюдать как округлые клетки, плавающие в растворе трипсина.
    ВНИМАНИЕ: Не инкубировать клетки в трипсине дольше 6 минут. Чрезмерная трипсинизация может повредить клетки и уменьшить их адгезию63.
  7. Как только все клетки отсоединятся, добавьте равный объем (т.е. 2-3 мл) предварительно нагретого ингибитора трипсина в каждую колбу T75.
  8. Перенесите клеточную суспензию из колб в центрифужную трубку.
  9. Промыть колбы 5 мл предварительно нагретого ПБС и перенести в центрифужную трубку, содержащую клеточную суспензию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что большинство клеток собрано, проверив количество остаточных клеток в колбах под микроскопом. Поверхность колбы должна быть на 95% пустой. Если это не так, можно повторить этап трипсинизации (3,3-3,9). Обратите внимание, однако, что повторной трипсинизации следует избегать.
  10. Центрифугировать собранные ячейки при 400 х г в течение 5 мин.
  11. Осторожно выбрасывайте большую часть супернатанта, оставляя примерно 100-200 мкл в пробирке.
    ВНИМАНИЕ: Не аспирировать гранулы во время этойпроцедуры. 
  12. Аккуратно повторно суспендируют гранулы клеток в небольшом объеме погруженной среды, пипетки вверх и вниз 5-10 раз, чтобы обеспечить равномерную клеточную суспензию. Начните с небольшого объема (т.е. 500 мкл), чтобы избежать образования клеточных агрегатов, и добавьте до 1 мл погруженной среды в общей сложности на начальную колбу T75.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно проведите пальцами по трубке, чтобы аккуратно растворить часть клеточной гранулы в надмноживом.
  13. Подсчитайте ячейки в суспензии с помощью метода исключения синего цвета trypan.
    1. Разбавляют 0,4% [v/v] трипан синего пятна и клеточную суспензию в соотношении 1:1, добавляя 10 мкл 0,4% [v/v] трипан синего пятна к 10 мкл клеточной суспензии. Добавьте 10 мкл раствора к счетной горке. Измерьте количество клеток сразу после смешивания клеточной суспензии с трипан-синим, так как трипан синий начинает снижать жизнеспособность клеток после воздействия более 1 мин65.
      ВНИМАНИЕ: Было показано, что трипан синий является потенциальным мутагеном, канцерогеном и тератогеном64. Осторожно обрабатывайте краситель и безопасно утилизируйте отходы в соответствии с местными лабораторными правилами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным подходом к использованию трипан синего является неопасный краситель эритрозин В66.
  14. Разбавляют клеточную суспензию дополнительной погруженной средой для достижения концентрации 3,525х 10 5 ячеек/мл в погруженной среде, добавляя объемV2, как показано в уравнении 1:
    Уравнение, иллюстрирующее статическое равновесие, V2=C1*(V1/C2)-V1, ключевое в схемном анализе.
    C1 = подсчитанная концентрация клеток в клеточной суспензии, полученная в 3,12 (клетки/мл)
    V1 = объем, используемый для повторного суспендирования гранул клеток в 3,12 (мл)
    C2 = концентрация целевых клеток в суспензии (т.е. 3,525 х 105 клеток/мл)
    V2 = объем, который необходимо добавить для достижения целевой концентрации в клетке (мл)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь поверхности рекомендуемой вкладыша для культивирование составляет 0,47см2; следовательно, соответствующая плотность посева составляет 3,75 х 105 клеток/см2.
  15. Выполняют второй подсчет клеток(С3)разбавленного раствора, полученного на этапе 3.14. Используйте уравнение 2 для расчета объема клеточной суспензии (V4),который будет засеян в культурную вставку:
    Уравнение преобразования напряжения, V4=C3*(V3/C4), формула электрической цепи.
    C3 = целевая концентрация клеток в суспензии (т.е. 3,525 х 105 клеток/мл)
    V3 = целевой объем клеточной суспензии, которая должна быть засеяна во вкладыш культуры (т.е. 0,5 мл)
    C4 = подсчитанная концентрация клеток в разбавленной суспензии, полученной в 3,14 (клетки/мл)
    V4 = фактический объем клеточной суспензии, засеяемой в культуральная вставка (мл)
  16. Повесьте 24 вставки для посева клеток в самое высокое положение рекомендуемой несущей пластины и перенесите несущую пластину на 24-скважинную пластину, предварительно заполненную погруженной средой (см. 3.1).
    ВНИМАНИЕ: При переносе несущей пластины на многоязычную пластину убедитесь, что между мембраной вставки и погруженной средой из базального отсека не задерживаются пузырьки воздуха, так как это повлияет на питание клеток и в конечном итоге поставит под угрозу жизнеспособность и морфологию RhE.
  17. Добавьте к каждой вставке определенный объем V4 (из уравнения 2) суспензии ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать метод обратного пипетирования для точного дозирования клеточной суспензии на вкладыши культуры.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что мембрана не повреждена при дозе клеточной суспензии в культурную вставку. Мерой предосторожности является дозирование клеточной суспензии вдоль стенки системы вставки, не касаясь поверхности мембраны.
  18. После посева инкубируют 24-скважинные плиты в течение 10-15 мин при комнатной температуре, чтобы преодолеть эффект кромки (т.е. неравномерное распределение температуры между всеми скважинами67). Не перемещайте пластины в течение этого времени.
  19. Перенесите пластины в инкубатор клеточной культуры (37 °C, 5% CO2и 95% RH). Клетки поддерживаются в погруженных состояниях в течение трех дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать изменчивости тканей, не укладывайте пластины в инкубатор после посева, чтобы убедиться, что каждая вставка получает одинаковое количество тепла. Через три дня (т.е. во время выращивания ALI) возможна укладка тарелок.

4. Культивирование на воздушно-жидкостном интерфейсе

  1. После трехдневной инкубации в инкубаторе клеточной культуры (37 °C, 5% CO2и 95% RH) подвергают клетки, которые прилипли к поверхности мембраны, к ALI путем удаления погруженной среды из апикальной камеры предпочтительно с использованием аспирационной системы и стеклянной пипетки Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, погруженная среда из апикальной отсека может быть удалена с помощью ручной микропипетки.
  2. Заполните новые 24-скважинные плиты 1,5 мл свежей предварительно нагретой среды ALI и переложите несущую пластину с культурными вставками на новые многолуноженные плиты.
  3. Перенесите многоязычные пластины обратно в инкубатор клеточной культуры (37 °C, 5% CO2и 95% RH).
  4. Обновляйте носитель ALI каждые 2-3 дня в течение 14 дней.
  5. Выполните обновление в два этапа: 1) подготовьте новую тарелку, содержащую 1,5 мл / колодец свежей предварительно нагретой среды ALI и 2) перенесите несущую пластину на новую пластину.
    ВНИМАНИЕ: В течение всей процедуры восстановления лучше не снимать крышку, покрывающую пластину носителя, чтобы защитить RHes от потенциального загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап ALI имеет решающее значение для разработки стратифицированной эпидермальной модели, поскольку он позволяет терминальную дифференцировку кератиноцитов68. После похода в АЛИ требуется визуальный контроль вставок, чтобы проверить, нет ли «протекающих тканей»: средних капель на поверхности ткани, идущих из базолатерального компартмента. Если утечка происходит на АЛИ 3 день, аккуратно извлеките среду из культурального вкладыша, не касаясь поверхности ткани. Если утечка сохраняется, рекомендуется отбросить протекающие ткани, так как это свидетельствует об отсутствии правильного барьерного образования в модели RHE.
  6. В конце процесса восстановления ткани могут подвергаться воздействию различных стрессоров, чтобы вызвать, например, окислительный стресс или воспаление. Параллельно их можно обрабатывать химическими соединениями или косметическими ингредиентами. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время воздействия/лечения ткани обычно поддерживаются в погруженной среде, начиная с ALI D14. Когда ожидается, что ткани будут подвергаться воздействию / обработке в течение длительного периода времени (т.е. 48-72 часов), рекомендуется (i) начать воздействие / лечение раньше в процессе культивирования ALI, такого как D7-D9, чтобы избежать истончения жизнеспособных слоев и утолщения SC, и (ii) инкубировать ткани в среде ALI, чтобы поддерживать стимуляцию пролиферации клеток.
  7. Для сбора RhE соберите ткани и среду клеточной культуры в интересующую точку времени для гистологического анализа, анализов жизнеспособности, экстракции белка / РНК и иммуноферментных анализов (ИФА).

Результаты

NHEKs, культивируемые в 2D, отображают традиционную морфологию с последовательной полигональной формой(рисунок 2A). Как описано выше, NHEK засевают в культурально-вставные после достижения слияния приблизительно 80%. Морфология RHes была проанализирована с использованием окрашивания H&E и TEM. Через 15 дней в ALI получается полностью стратифицированная ткань, о чем свидетельствуют ее четыре основных эпидермальных слоя: SB, SS, SG и SC(рисунок 2B). В слое SB ячейки имеют столбчатую форму. От второго слоя к верхним слоям RHE NHEK дифференцируются, как это наблюдается по изменениям в морфологии клеток (от столбчатой формы в слое SB к остистой форме в слое SS). В слое SG клетки имеют более уплощенные формы и отображают гранулы кератохиалина (KG), которые представлены в виде фиолетовых точек в цитоплазме. Их характерная круглая и звездная форма выделена белыми стрелками на изображении H&E(рисунок 2C). Клетки в SC, терминально дифференцированы и полностью сплющены и не имеют клеточного ядра. Стратифицированные RHEs имеют общую толщину 84,3 ± 2,4 мкм, а их SC имеет толщину 19,6 ± 3,2 мкм(рисунок 2D). Эти значения сопоставимы с теми, которые были зарегистрированы для нативной кожи человека, т.е. 60-120 мкм и 10-20 мкм соответственно69. Количество жизнеспособных слоев составляет 6-7, что ниже по сравнению с нативной кожей человека, составить примерно 7-1470. Ультраструктурный анализ RHEs в разные моменты времени в протоколе восстановления (т.е. через 7, 10, 13 и 15 дней) выявляет процесс ороговения RH с увеличением количества слоев корнеоцитов с течениемвремени (рисунок 2E). Через 15 дней в ALI SC ткани RhE состоит примерно из 15-25 слоев, что сопоставимо со значением, сообщенным для нативной кожи человека (т.е. 15-20 слоев)69.

Гистология слоев кожи и рост клеток; Включает микроскопические изображения и гистограмму для анализа толщины.
Рисунок 2:Первичные кератиноциты и реконструированный эпидермис человека. (А) Фазово-контрастная микроскопия изображения первичных кератиноцитов перед посевом на вставки. Шкала бара составляет 50 мкм.(B-C)H&E яркое поле микроскопическое изображение RhE. Шкала бара составляет 50 мкм(B)и 25 мкм(C). (D)Количественная оценка толщины RhE и SC (средняя ± SEM, n=3). (E)Изображения просвечивающих электронных микроскопических сечений RhE через 7, 10, 13 и 15 дней в ALI. Шкала составляет 4 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В соответствии со стадией дифференцировки, NHEKs, растущие в 3D, показывают различные профили экспрессии белка в соответствии с их стадией дифференцировки. Экспрессию белков, специфичных для дифференцировки кератиноцитов на ранней стадии (т.е. кератина 10), дифференцировки кератиноцитов поздней стадии (т.е. инволукрина, лорикрина и филаггрина) и адгезии кератиноцитов (т.е. десмоглеина 1) в RHEs определяли с помощью окрашивания ИФ. Экспрессия инволюкрина проявляется более преимущественно в слое SG, поскольку ее экспрессия инициируется раньше в процессе дифференцировки(рисунок 3D),тогда как филаггрин и лорикрин экспрессируются в верхних слоях(рисунок 3B-C). Экспрессия кератина 10 была обнаружена во всех жизнеспособных слоях, за исключением слоя SB(рисунок 3E). RHes отображают функциональные десмосомальные соединения, о чем свидетельствует экспрессия десмоглина 1 в межклеточном пространстве жизнеспособных эпидермальных слоев(фиг.3F). В заключение, все пять маркеров выражены и расположены в соответствующих эпидермальных слоях и переводятся в здоровый процесс эпидермальной дифференцировки.

Гистология и иммунофлюоресцентная микроскопия эпидермальных слоев кожи; H&E и белковые маркеры.
Рисунок 3:Эпидермальная дифференцировка, тканевая адгезия и целостность тканей реконструированного эпидермиса человека. (A) H & E яркое поле микроскопическое изображение RhE. Конфокальные флуоресцентные микроскопические изображения(B)филаггрина (FLG),(C)лорикрина (LOR),(D)инволукрина (INV),(E)кератина 10 (K10) и (F) десмоглина 1 (DSG-1), представленного в пурпурном виде. Окрашивание ядер (DAPI) представлено синим цветом. Шкала составляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Барьерные свойства модели RhE исследовали путем оценки жизнеспособности и целостности тканей. Целостность ткани определяли через 15 дней путем измерения TEER с помощью вольтомметра. Значения 2567 ± 415Ω,см2, зарегистрированные для RH, переводят формирование непрерывногобарьера (рисунок 4A). Эти значения находятся в диапазоне с значениями, сообщенными для моделей RhE71,72,73,74. Кроме того, требуемое время воздействия цитотоксического эталонного химического вещества (т.е. тритона X-100) для снижения жизнеспособности ткани на 50% (ET50)определяли с помощью анализа на тиазолиловый синий тетразолий бромид (MTT). Значение ET50, измеренное для RhE, составило 2,1 часа. Это значение попадает в диапазон принятия других 3D-моделей эпидермия, которые подходят для надежного прогнозирования классификации раздражения (Руководящий принцип 439 ОЭСР)19.

Ящичковая диаграмма и линейный график, показывающие сопротивление и жизнеспособность тканей в зависимости от времени воздействия; ET50=2.1ч.
Рисунок 4:Барьерные свойства реконструированного эпидермиса человека. (А) Целостность тканей, измеренная с помощью трансэпителиального электрического сопротивления (среднее ± SEM, n=6). (B)ET50, определяемый путем измерения жизнеспособности тканей (т.е. анализа MTT) при местном воздействии 78,3 мкл 1% Тритона X-100 (средняя ± SEM, n=3).

Реакция RHes исследовалась на известные провоспалительные раздражители. RhEs обрабатывали системно, т.е. добавление стимулов в среду базолатерального компартмента, используя 100 мкг/мл липополисахарида Escherichia coli (LPS) и 40 нг/мл фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). После 24 часов стимуляции собирали клеточную культурную среду. Цитотоксичность измеряли с помощью анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сравнивали со значениями известного мембранного разрушителя, моющего средства Triton X-100(рисунок 5). Значительное увеличение (p < 0,05, односторонняя ANOVA, множественный сравнительный тест Даннетта) было показано в активности ЛДГ у RHEs, обработанных Triton X-100. Лечение ЛПС и α TNF показало, что они не цитотоксичны.

гистограмма активности ЛДГ; Сравнение TX-100, LPS, TNF-α; результаты ферментного анализа; статистический анализ.
Рисунок 5:Цитотоксичность, измеренная с помощью анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Данные представлены в виде относительных значений для контроля, необработанных тканей (CTRL); среднее ± SEM, n=9 (тритон X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Значимость была проверена с помощью одностороннего ANOVA, множественного сравнительного теста Даннетта. Звездочкой обозначена статистически значимая разница по сравнению с CTRL, ****p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Высвобождение интерлейкина 1 альфа (IL-1α) и интерлейкина 8 (IL-8) в среде RhE количественно оценивали с использованием ИФА. На рисунке 6 показано как количественное, так и относительное высвобождение IL-1α и IL-8 RH при оспаривании с LPS и TNF-α. Лечение ЛПС привело к статистически значимому (p < 0,05, непарный Т-тест Стьюдента) индуцированного высвобождения IL-8 (увеличение в 9,6 ± 1,0 раза) и IL-1α (увеличение в 2,7 ± в 1,3 раза). TNF-α не индуцировало достоверно высвобождение IL-8, хотя наблюдалась тенденция повышения уровней IL-8 (2,3 ± увеличение в 0,8 раза). Тем не менее, TNF-α значительно (p < 0,05, непарный Т-тест Студента) вызвал высвобождение IL-1α (увеличение в 1,8 ± 0,5 раза).

Сравнение уровней экспрессии IL-8, IL-1α на гистограммах; эффекты ЛПС, ФНО-α; статистический анализ.
Рисунок 6:Провоспалительные реакции в реконструированном эпидермисе человека. Концентрации высвобождения IL-8 RhE при 24-часовом испытании с LPS(A)и TNF-α (B). Данные представлены в виде среднего ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Данные представлены в виде среднего относительного значения по сравнению с контрольными, необработанными тканями (CTRL) ± SEM, n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). Концентрация высвобождения ИЛ-1α RhE при 24-часовом испытании с ЛПС(D)и ФНО-α(Е). Данные представлены в виде среднего ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Данные представлены как среднее относительное значение по сравнению с CTRL ± SEM, n= 4 (LPS), n = 3 (TNF-α). Значимость была проверена непарным Т-тестом Студента. Звездочкой обозначены статистически значимые различия по сравнению с CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

RHes широко используются в качестве скрининговых инструментов в фармацевтической и дермато-косметической областях36,75,76,77,78. Хотя несколько компаний сделали такие RH коммерчески доступными, они остаются дорогостоящими и ограничивают возможность изменения параметров культивирования по мере необходимости для решения новых исследовательских вопросов. В данной работе описана процедура производства рудоизнервных руд на месте надежным и надежным способом и дана подробная характеристика полученных тканей для подтверждения актуальности модели в качестве альтернативного подхода к испытаниям на животных.

Некоторые из шагов в протоколе имеют решающее значение для обеспечения правильной дифференцировки кератиноцитов и воспроизводимости RhE. Это может быть выполнено путем использования оптимальных клеток, среднего типа (типов) и условий культивирования. В предложенной модели RhE неонатальные НЭК были выбраны из-за отсутствия антигенного воздействия по сравнению со взрослыми НЭК. Кроме того, кератиноциты были ограничены кавказской этнической принадлежностью, чтобы избежать межвидовой изменчивости. Первичные кератиноциты обычно используются из-за их способности дифференцировать и стратифицировать.79. Их можно получить коммерчески или путем самостоятельной изоляции от кожи взрослых особей.80. Культивирование клеточной линии (т.е. HaCaT) на поликарбонатной мембране показало, что она не дифференцировка и продемонстрировала нарушенную способность синтезировать липиды, необходимые для образования барьеров.81. Однако включение различных матриц культур, таких как гидрогели, коллаген, фибрин и сфероиды, привело к успешной разработке 3D-моделей кожи.78,82,83,84,85,86. Было показано, что увековеченные клеточные линии, N/TERT, подходят для развития RHEs.35. Первичные кератиноциты остаются пролиферативными при четвертом или пятом прохождении61, поэтому действующий протокол включает использование кератиноцитов в их третьем проходе. De Vuyst et al. продемонстрировали, что плотность посева клеток имеет важное значение и должна быть достаточной (т.е. ≥ 2,5x105 ячеек/см2) для обеспечения того, чтобы среда из базолатерального отсека не диффундирует в апикальный отсек. Недостаточная плотность посева (т.е. < 2.5x105 ячеек/см2) может привести к неспособности сформировать надлежащий барьер, о чем свидетельствует диффузия среды от базолатерального к апикальному отсеку, что приводит к затоплению вместо АЛИ условий культуры62. Безсывороточная среда роста кератиноцитов (см. Таблица материалов) был предпочтительным для целей воспроизводимости, поскольку он обеспечивает преимущество работы с химически определенной средой и снижает риск загрязнения. Эта среда имеет более низкую концентрацию кальция (т.е. 60 мкМ) и поэтому стимулирует пролиферацию кератиноцитов.87. Повышение концентрации кальция (т.е. 1,5 мМ) с первого этапа культивирования RHE способствует дифференцировке кератиноцитов и формированию кожного барьера и гомеостаза49. Кроме того, среда ALI дополняется аскорбиновой кислотой, которая, как было показано, имеет решающее значение для образования липидов SC и способствует дифференцировке.52,53,54. Среда ALI также содержит KGF, который является фактором роста, секретируемым фибробластами, которые могут связываться с трансмембранными рецепторами кератиноцитов и при активации играют двойную роль в дифференцировке и заживлению ран.55,88. Важно обновлять среду ALI через определенные промежутки времени, чтобы обеспечить постоянное поступление свежих питательных веществ к RHEs. Использование системы несущих пластин имеет решающее значение для выращивания RHE в более широком масштабе (т.е. 24 вставки/пластина). Это дает преимущество экономии времени, снижения риска загрязнения и оставляет меньше места для внедрения человеческих ошибок. Это также обеспечивает возможность культивировать RH в большом объеме среды (т.е. 1,5 мл), что уменьшает необходимое количество обновлений среды ALI. Кроме того, он предлагает возможность перенести полную пластину вставок на тарелку со свежим носителем, избегая контакта со вставками по отдельности или открывая крышку пластины.

Следует отметить несколько ограничений модели RhE. В нативной коже человека существует равновесие между пролиферовацией кератиноцитов в базальном слое и отслойкой корнеоцитов в СК (т.е. десквамация).89. Однако in vitro десквамация не происходит. Поэтому корнеоциты остаются прикрепленными к RHE и образуют толстый SC, который менее физиологически актуален. Следовательно, существует ограниченный промежуток времени культивирования RHEs. Более того, эта модель RhE проста и понятна, поскольку она состоит из единственного типа клеток, то есть кератиноцита, который является наиболее распространенным типом клеток эпидермиса. Однако существуют и другие типы клеток, обжитые в эпидермисе, такие как меланоциты, дендритные клетки (т.е. клетки Лангерганса), Т-клетки (например, CD8).+ клетки) и клетки Меркеля13. Чтобы повысить физиологическую значимость модели кожи, исследователи усложнили модели кожи, добавив меланоциты.38 , иммунные клетки39, или клетки, полученные от пациента90. Следует иметь в виду, что барьерные свойства моделей кожи человека отличаются по сравнению с нативной кожей человека, в частности, из-за другого липидного состава SC и более высокой барьерной проницаемости. 91,92,93,94,95. Тем не менее, в нескольких исследованиях сообщалось об изменениях барьерных свойств моделей кожи человека при культивировании в условиях гипоксии.96 или пониженная относительная влажность97, модуляция дермального матрикса хитозаном98, и изменение свободных жирных кислот в питательной среде99. Более того, как в простых, так и в более сложных RH условия культивирования и состав среды могут модулироваться для имитации патологических признаков. Оспаривая модель с помощью цитокинов, аномальная морфология100 и могут быть установлены изменения в уровнях экспрессии генов и белков, которые обычно наблюдаются при общих кожных заболеваниях, таких как атопический дерматит и псориаз35,101,102,103,104,105. Глушение специфических генов в кератиноцитах перед началом процесса восстановления 3D-модели является еще одним подходом, используемым для имитации особенностей кожных заболеваний и исследования новых терапевтических решений.106,107. Помимо моделирования только эпидермального слоя, дермальный компартмент может быть включен в модель (т.е. названный эквивалентами кожи человека или моделями полной толщины) путем встраивания фибробластов в коллагеновую матрицу до восстановления RhE, что делает его более физиологически значимым и подходящим для исследований, связанных со старением и заживлением ран.108,109,110. Кроме того, сфероиды опухолей были добавлены к эквивалентам кожи человека для изучения прогрессирования меланомы.111,112. Последними достижениями в области моделей кожи являются биопечать и кожа на чипе. В последнее время несколько исследовательских групп преуспели в разработке (перфузируемых) биопечатных эквивалентов кожи.45,113,114. Предлагаемый протокол использует преимущества 24-скважинного формата и несущей пластины, избегая вставок, которые должны обрабатываться индивидуально. Тем не менее, масштаб исследования по-прежнему довольно ограничен и не имеет автоматизации. Реализуя использование биопечати или «кожа на чипе», меньшие модели кожи могут использоваться с более автоматизированными процессами и в большем масштабе.

RhE, описанный в этом протоколе, имеет множество сходств с уже разработанными и хорошо охарактеризованными коммерческими эпидермальными моделями. Морфологический анализ показал, что, хотя количество жизнеспособных слоев в предлагаемой модели RhE ниже по сравнению с нативной кожей человека (т.е. 6-7 по сравнению с 7-14), оно сопоставимо с количеством жизнеспособных слоев модели RhE EpiDerm (т.е. 8-12)70. Подобно моделям EpiDerm, EpiSkin и SkinEthic, верхний слой RhE показывает паттерн плетения корзины из плотно упакованных слоев корнеоцитов28. Кроме того, анализ ТЕА показал, что количество слоев SC в предлагаемой модели RHE (т.е. 15-25) сопоставимо с количеством слоев EpiDerm (т.е. 16-25)70. В целом, предложенная модель RhE демонстрирует структуру, аналогичную структуре других коммерциализированных эпидермальных моделей, имитируя нативный эпидермис человека. Целостность ткани, измеренная TEER, находится в диапазоне с коммерческими моделями RHE (т.е. между 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 и другими штатными RHE (т.е. приблизительно 5000 Ω.cm2)74,115. Предложенная модель RHE хорошо дифференцирована, о чем свидетельствует наличие и правильная локализация маркеров дифференцировки и адгезии тканей. Кроме того, предлагаемая модель RhE реагирует на провоспалительные стимулы (т.е. LPS и TNF-α).

В заключение, текущий протокол показывает, как производить RH надежным образом и в относительно больших масштабах для удовлетворения потребностей исследователей как в академических, так и в частных учреждениях. Предложенная модель RhE имеет аналогичную морфологию, эпидермальную дифференцировку и биологическую реакцию на другие существующие коммерческие модели. Он предоставляет альтернативный инструмент как для фармацевтической, так и для дермато-косметической области, когда требуется доступ к соответствующей модели кожи.

Раскрытие информации

Марк Иман и Бенедетта Петракка являются сотрудниками Dow Silicones Belgium. Всем остальным авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Программа исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках гранта Марии Склодовской-Кюри с грантовым соглашением No 765602 финансировала эту работу. Все авторы признают поддержку Фонда Адольфа Меркла и Университета Феррары и с благодарностью отмечают Dow Silicones Belgium. Доктор Мигель Спух-Голвар признан за подготовку графических изображений процесса выращивания RhE. Авторы благодарят д-ра Барбару Драслер, д-ра Франко Червеллати и д-ра Аньес Тессье за их техническую поддержку и обсуждения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаSigma AldrichA6283Подкислите раствор Эозина 1 мл уксусной кислоты на 100 мл.
Антибиотик-антимикотик (100x)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15240062
Водный раствор эозина YSigma AldrichHT110280Подкислите раствор эозина 1 мл уксусной кислоты на 100 мл.
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma Aldrich или MerckC8106 или 1.02378.0500Приготовьте исходный раствор 0,144 М, процедите стерилизуйте и храните аликвоты при -20°C. Рекомендуется заготавливать новые аликвоты каждые 6 месяцев.
DAPIRoche10236276001Приготовьте бульон при 100 μ г/мл и хранить аликвоты при -20 °C. Рабочее условие составляет 1 μ г/мл.
Монтажный носитель EntellanMerck1.07960.0500Монтажный носитель для H& Е окрашивание.
Среда EpiLife (называемая средой для роста кератиноцитов)Thermo Fisher Scientific (Gibco)MEPI500CAСодержит 0,06 мМ Ca2+.
Абсолютный этанолЛюбой поставщикН/Д
Формалин 10%Leica Biosystems3800770
Добавка для роста кератиноцитов человека (HKGS) (100x)Thermo Fisher Scientific (Gibco)S0015Для достижения конечных концентраций 0,2% [v/v] BPE, 0,2 нг/мл человеческого рекомбинантного EGF, 0,18 μ г/мл гидрокортизона,5 μ г/мл бычьего трансферрина и 0,01 & микро; г/мл человеческого рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-I.
ИзопропанолБиосольв Б.В.0016264102BS
Кайзеровский глицериновый желатин, не содержащий фенолаMerck1.08635.0100Монтажная среда для окрашивания ПЧ.
Фактор роста кератиноцитов (KGF)R& D Systems251-KG-050Восстанавливать белок KGF при 100 мкм; г/мл в стерильном 0,1% [w/v] BSA в PBS. Подготовьте аликвоты и храните при -20°С.
Набор для анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ)Roche4744926001
L-аскорбиновая кислота, 2-фосфат, сесквимагния соль гидрат;Sigma-AldrichA8960Приготовьте стоковый раствор 25 мг/мл, отфильтруйте стерилизуйте и храните аликвоты при -20°С. Рекомендуется заготавливать новые аликвоты каждые 6 месяцев. Хранить в темное время суток.
Липополисахарид (ЛПС), штамм E.coli O55:B5Sigma-AldrichL4524Приготовьте запас 1 мг/мл в стерильном PBS и храните аликвоты при -20 °C. Рабочая концентрация 100 ° С; г/мл. 
Майер» s ГематоксилинSigma-AldrichMHS80
Нормальные эпидермальные кератиноциты человека (NHEKs)Lonza00192906Первичные кератиноциты человека, выделенные из крайней плоти новорожденных, объединенные по меньшей мере от трех доноров.
Фосфатно-солевой буферThermo Fisher Scientific (Gibco)10010056 или 10010-015Справочные номера могут варьироваться в зависимости от страны.
Рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа (ФНО-&альфа;)ImmunoTools11344483Подготовьте запас из 100 мкм; г/мл в стерильной сверхчистой воде. Рабочая концентрация 40 нг/мл
Стерильная сверхчистая водаЛюбой поставщикН/Д
Тиазолил синий Тетразолия бромид (МТТ)Sigma-AldrichM5655Приготовьте запас 5 мг/мл МТТ в стерильном PBS. Рабочая концентрация составляет 1 мг/мл.
Triton X-100Sigma-Aldrich93426
Трипан синий (0,4% [v/v])Любой поставщикN/A
Ингибитор трипсинаThermo Fisher Scientific (Gibco)R007100
Трипсин/ЭДТА (0,05% [v/v])Thermo Fisher Scientific (Gibco)25300054
Tween 20Sigma-AldrichP1379
КсилолSigma-Aldrich214736
Goat Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488)AbcamAb150113
Дигидрат три-цитрата натрия Merck1.06448.0500Для буфера для извлечения антигена для окрашивания IF.
Козий антикролик IgG H& L (Dylight 488)AgriseraAS09 633
Филаггрин Мышиное антителоBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-53243
Инволюкриновое антитело к кроликуBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-33742
Кератин 10 Мышиное антителоBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-32962
Десмоглеин-1 Мышиное антитело BioTechne (Novus Biologicals)MAB944
Антитело кролика к лорикринуBioTechne (Novus Biologicals)NBP1-33610

Ссылки

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Antioxidants & Redox Signaling. , (2002).
  2. Pouillot, A., Dayan, N., Polla, A. S., Polla, L. L., Polla, B. S. The stratum corneum: a double paradox. Journal of Cosmetic Dermatology. 7 (2), 143-148 (2008).
  3. Moore, K. L., Dalley, A. F. Clinically Orientated Anatomy. , (2010).
  4. Barthel, R., Aberdam, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 19 (4), 405-413 (2005).
  5. Green, K. J., Simpson, C. L. Desmosomes: new perspectives on a classic. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2499-2515 (2007).
  6. Feingold, K. R. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. Journal of Investigative Dermatology. 132 (8), 1951-1953 (2012).
  7. Elias, M. P., Feingold, K. R., Fartasch, M. The epidermal lamellar body as a multifunctional secretory organelle. Skin Barrier. , 261-272 (2006).
  8. Tobin, D. J. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical society reviews. 35 (1), 52-67 (2006).
  9. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  10. Weinstein, G. D., McCullough, J. L., Ross, P. Cell proliferation in normal epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 623-628 (1984).
  11. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  12. Suter, M. M., et al. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Veterinary Dermatology. 20 (5-6), 515-532 (2009).
  13. McLafferty, E., Hendry, C. The integumentary system: anatomy, physiology and function of skin. Nursing Standard. 27 (7), 35-43 (2012).
  14. Monteiro-Riviere, N. A. Toxicology of the skin. , (2010).
  15. Dellambra, E., Odorisio, T., D'Arcangelo, D., Failla, C. M., Facchiano, A. Non-animal models in dermatological research. ALTEX. 36 (2), 177-202 (2019).
  16. Gordon, S., et al. Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology. Altex. 32 (4), 327-378 (2015).
  17. Kandárová, H., et al. The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests - An assessment of the performance of the optimised test. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 33 (4), 351-367 (2005).
  18. Kandárová, H., et al. Assessment of the skin irritation potential of chemicals by using the SkinEthic reconstructed human epidermal model and the common skin irritation protocol evaluated in the ECVAM skin irritation validation study. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 34 (4), 393-406 (2006).
  19. OECD. Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. , (2019).
  20. Alépée, N., Grandidier, M. H., Cotovio, J. Sub-categorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkinTM reconstructed human epidermis skin corrosion test method according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicology in Vitro. 28 (2), 131-145 (2014).
  21. OECD. Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. , (2019).
  22. Mehling, A., et al. In vitro RHE skin sensitisation assays: applicability to challenging substances. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 108, 104473(2019).
  23. SENS-IS | EURL ECVAM - TSAR. , Available from: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-11 (2020).
  24. Lelièvre, D., et al. The episkin phototoxicity assay (EPA): development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency. Toxicology in Vitro. 21 (6), 977-995 (2007).
  25. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  26. Pellevoisin, C., Bouez, C., Cotovio, J. Cosmetic industry requirements regarding skin models for cosmetic testing. Skin Tissue Models. , 3-37 (2018).
  27. Niehues, H., et al. 3D skin models for 3R research: the potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function. Experimental Dermatology. 27 (5), 501-511 (2018).
  28. Netzlaff, F., Lehr, C. -M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 167-178 (2005).
  29. Prieux, R., Eeman, M., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G. Mimicking cigarette smoke exposure to assess cutaneous toxicity. Toxicology in Vitro. 62, 104664(2020).
  30. Petracca, B., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G., Eeman, M. Bench approaches to study the detrimental cutaneous impact of troposperic ozone. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology. 31, 137-148 (2021).
  31. Dijkhoff, I. M., et al. Impact of airborne particulate matter on skin: a systematic review from epidemiology to in vitro studies. Particle and fibre toxicology. 17 (1), 35(2020).
  32. El Ghalbzouri, A., Siamari, R., Willemze, R., Ponec, M. Leiden reconstructed human epidermal model as a tool for the evaluation of the skin corrosion and irritation potential according to the ECVAM guidelines. Toxicology in Vitro. 22 (5), 1311-1320 (2008).
  33. Chacón, M., et al. Development of an in-house reconstructed human epidermis model as an alternative method in skin corrosion assessment. Toxicology in Vitro. 65, 104779(2020).
  34. Pedrosa, T. doN., et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro. 42, 31-37 (2017).
  35. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838(2017).
  36. Poumay, Y., Coquette, A. Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of dermatological research. 298 (8), 361-369 (2007).
  37. Rikken, G., Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Organotypic 3D skin models: human epidermal equivalent cultures from primary keratinocytes and immortalized keratinocyte cell lines. Methods in Molecular Biology. 2154, 45-61 (2020).
  38. Duval, C., et al. Human skin model containing melanocytes: essential role of keratinocyte growth factor for constitutive pigmentation-functional response to α-melanocyte stimulating hormone and forskolin. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (12), 947-957 (2012).
  39. Hutter, V., Kirton, S. B., Chau, D. Y. S. Immunocompetent human in vitro skin models. Skin Tissue Models. , 353-373 (2018).
  40. Kinsner, A., Lesiak-Cyganowska, E., Śladowski, D. In vitro reconstruction of full thickness human skin on a composite collagen material. Cell and Tissue Banking. 2 (3), 165-171 (2001).
  41. Black, A. F., Bouez, C., Perrier, E., Schlotmann, K., Chapuis, F., Damour, O. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tissue Engineering. 11 (5-6), 723-733 (2005).
  42. Reijnders, C. M. A., et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Engineering. Part A. 21 (17-18), 2448-2459 (2015).
  43. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  44. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  45. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. 3D cell printing of perfusable vascularized human skin equivalent composed of epidermis, dermis, and hypodermis for better structural recapitulation of native skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019(2019).
  46. Pittelkow, M. R., Scott, R. E. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive burns. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 771-777 (1986).
  47. Elias, P. M., Ahn, S. K., Brown, B. E., Crumrine, D., Feingold, K. R. Origin of the epidermal calcium gradient: regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms. Journal of Investigative Dermatology. 119 (6), 1269-1274 (2002).
  48. Elias, P. M., et al. Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation-specific markers. Journal of Investigative Dermatology. 119 (5), 1128-1136 (2002).
  49. Lee, S. E., Lee, S. H. Skin barrier and calcium. Annals of Dermatology. 30 (3), 265-275 (2018).
  50. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  51. Poumay, Y., et al. A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies. Archives of Dermatological Research. 296 (5), 203-211 (2004).
  52. Ponec, M., et al. The formation of competent barrier lipids in reconstructed human epidermis requires the presence of vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  53. Savini, I., et al. Characterization of keratinocyte differentiation induced by ascorbic acid: Protein kinase C involvement and vitamin C homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 118 (2), 372-379 (2002).
  54. Pasonen-Seppänen, S., et al. Vitamin C enhances differentiation of a continuous keratinocyte cell line (REK) into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology. 116 (4), 287-297 (2001).
  55. Beer, H. D., et al. Expression and function of keratinocyte growth factor and activin in skin morphogenesis and cutaneous wound repair. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 34-39 (2000).
  56. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of structural biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  57. Rice, R. H., Thacher, S. M. Involucrin: a constituent of cross-linked envelopes and marker of squamous maturation. Biology of the Integument. , 752-761 (1986).
  58. Elias, P. M., Barrier Feingold, K. R. Skin Barrier. , (2011).
  59. Marionnet, C., et al. Morphogenesis of dermal-epidermal junction in a model of reconstructed skin: beneficial effects of vitamin C. Experimental Dermatology. 15 (8), 625-633 (2006).
  60. Frikke-Schmidt, H., Lykkesfeldt, J. Keeping the intracellular vitamin C at a physiologically relevant level in endothelial cell culture. Analytical Biochemistry. 397 (1), 135-137 (2010).
  61. Castro-Muñozledo, F., Hernández-Quintero, M., Marsch-Moreno, M., Kuri-Harcuch, W. Cultivation, serial transfer, and differentiation of epidermal keratinocytes in serum-free medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 236 (1), 167-172 (1997).
  62. De Vuyst, E., et al. Reconstruction of normal and pathological human epidermis on polycarbonate filter. Epidermal Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 191-201 (2013).
  63. Chen, R. H., Zhu, J., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., Li, Y. The tolerance of human epidermal cells to trypsinization in vitro. Cell and Tissue Banking. 21 (2), 257-264 (2020).
  64. Pohanish, R. P. Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2, (2012).
  65. Tsaousis, K. T., et al. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clinical and Experimental Ophthalmology. 41 (5), 484-490 (2013).
  66. Kim, S. I., et al. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry. 492, 8-12 (2016).
  67. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  68. Fartasch, M., Ponec, M. Improved barrier structure formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 366-374 (1994).
  69. Bouwstra, J. A., Honeywell-Nguyen, P. L., Gooris, G. S., Ponec, M. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research. 42 (1), 1-36 (2003).
  70. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M. Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacology and Physiology. 15 (1), 4-17 (2002).
  71. Hubaux, R., Wauters, A., Chrétien, A., Poumay, Y., Salmon, M. Reconstructed human epidermis response to urban particulate matter activates multiple stress-related pathways and impacts the skin barrier function. 23th IFSCC Conference. , 125-134 (2017).
  72. Lin, Y. -C., et al. Testing method development and validation for in vitro skin irritation testing (SIT) by using reconstructed human epidermis (RhE) skin equivalent - EPiTRI®. Alternatives to Animal Testing. , 8-19 (2019).
  73. Alexander, F. A., Eggert, S., Wiest, J. Skin-on-a-chip: Transepithelial electrical resistance and extracellular acidification measurements through an automated air-liquid interface. Genes. 9 (2), 114(2018).
  74. van den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
  75. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An in vitro skin irritation test (SIT) using the EpiDerm reconstructed human epidermal (RHE) model. Journal of Visualized Experiments. (29), e1366(2009).
  76. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical pharmacology advances and applications. 8, 163-176 (2016).
  77. De Wever, B., Kurdykowski, S., Descargues, P. Human skin models for research applications in pharmacology and toxicology: introducing nativeSkin, the "missing link" bridging cell culture and/or reconstructed skin models and human clinical testing. Applied In Vitro Toxicology. 1 (1), 26-32 (2015).
  78. Klicks, J., von Molitor, E., Ertongur-Fauth, T., Rudolf, R., Hafner, M. In vitro skin three-dimensional models and their applications. Journal of Cellular Biotechnology. 3 (1), 21-39 (2017).
  79. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 22 (12), 695-705 (1986).
  80. Johansen, C. Generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Journal of Visualized Experiments. (130), e56863(2017).
  81. Boelsma, E., Verhoeven, M. C. H., Ponec, M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). Journal of Investigative Dermatology. 112 (4), 489-498 (1999).
  82. Zhao, X., et al. Photocrosslinkable gelatin hydrogel for epidermal tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (1), 108-118 (2016).
  83. Peura, M., et al. Paracrine factors from fibroblast aggregates in a fibrin-matrix carrier enhance keratinocyte viability and migration. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (2), 658-664 (2010).
  84. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCat keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology. 112 (3), 343-353 (1999).
  85. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue engineering. Part C, Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  86. Alameda, J. P., et al. IKKα regulates the stratification and differentiation of the epidermis: Implications for skin cancer development. Oncotarget. 7 (47), 76779-76792 (2016).
  87. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  88. Staiano-Coico, L., et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing. Journal of Experimental Medicine. 178 (3), 865-878 (1993).
  89. Egelrud, T. Desquamation in the stratum corneum. Acta Dermato-Venereologica. 80, Supp 208 44-45 (2000).
  90. Jean, J., Lapointe, M., Soucy, J., Pouliot, R. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. Journal of Dermatological Science. 53 (1), 19-25 (2009).
  91. Lotte, C., Patouillet, C., Zanini, M., Messager, A., Roguet, R. Permeation and skin absorption: reproducibility of various industrial reconstructed human skin models. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 15, Suppl 1 18-30 (2002).
  92. Ponec, M., Weerheim, A., Lankhorst, P., Wertz, P. New acylceramide in native and reconstructed epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 581-588 (2003).
  93. Thakoersing, V. S., et al. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  94. Thakoersing, V. S., et al. presence of monounsaturated fatty acids in the stratum corneum of human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  95. Van Smeden, J., et al. Combined LC/MS-platform for analysis of all major stratum corneum lipids, and the profiling of skin substitutes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (1), 70-79 (2014).
  96. Mieremet, A., et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation. Scientific Reports. 9 (1), 7811(2019).
  97. Mieremet, A., et al. Unravelling effects of relative humidity on lipid barrier formation in human skin equivalents. Archives of Dermatological Research. 311 (9), 679-689 (2019).
  98. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., Van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by Chitosan modulated dermal matrices. PLoS ONE. 12 (3), 0174478(2017).
  99. Mieremet, A., et al. Contribution of palmitic acid to epidermal morphogenesis and lipid barrier formation in human skin equivalents. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6069(2019).
  100. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal fifferentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  101. De Vuyst, E., Salmon, M., Evrard, C., Lambert de Rouvroit, C., Poumay, Y. Atopic dermatitis studies through in vitro models. Frontiers in Medicine. 4, 119(2017).
  102. Danso, M. O., et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 134 (7), 1941-1950 (2014).
  103. Soboleva, A. G., Mezentsev, A., Zolotorenko, A., Bruskin, S., Pirusian, E. Three-dimensional skin models of psoriasis. Cells Tissues Organs. 199 (5-6), 301-310 (2014).
  104. Desmet, E., Ramadhas, A., Lambert, J., Gele, M. Van In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Experimental Biology and Medicine. 242 (11), 1158-1169 (2017).
  105. Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Past, present and future of in vitro 3D reconstructed inflammatory skin models to study psoriasis. Experimental Dermatology. 27 (5), 512-519 (2018).
  106. Pendaries, V., et al. Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation. Journal of Investigative Dermatology. 134 (12), 2938-2946 (2014).
  107. Niehues, H., et al. Epidermal equivalents of filaggrin null keratinocytes do not show impaired skin barrier function. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (6), 1979-1981 (2017).
  108. Reuter, C., Walles, H., Groeber, F. Preparation of a three-dimensional full thickness skin equivalent. Methods in Molecular Biology. 1612, 191-198 (2017).
  109. Bataillon, M., et al. Characterization of a new reconstructed full thickness skin model, t-skinTM, and its application for investigations of anti-aging compounds. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2240(2019).
  110. Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments. (96), e52576(2015).
  111. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. Journal of Visualized Experiments. (54), e2937(2011).
  112. Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57500(2018).
  113. Wei, Z., et al. Two-dimensional cellular and three-dimensional bio-printed skin models to screen topical-use compounds for irritation potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 109(2020).
  114. Derr, K., et al. Fully three-dimensional bioprinted skin equivalent constructs with validated morphology and barrier function. Tissue Engineering - Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  115. Frankart, A., et al. Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Experimental Dermatology. 21 (11), 871-875 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи