Методическая статья

Одноклеточная мультиплексированная флуоресцентная визуализация для визуализации вирусных нуклеиновых кислот и белков и мониторинга ВИЧ, HTLV, HBV, HCV, вируса Зика и инфекции гриппа

DOI:

10.3791/61843

⸱

29 октября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол для подхода флуоресцентной визуализации, multiplex immunofluorescent cell-based detection DNA, RNA и protein (MICDDRP), метод, способный одновременно флуоресцентной одноклеточной визуализации вирусного белка и нуклеиновых кислот различного типа и цепкости. Этот подход может быть применен к широкому спектру систем.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Захват динамических процессов репликации и сборки вирусов был затруднен отсутствием надежных технологий гибридизации in situ (ISH), которые позволяют чувствительную и одновременную маркировку вирусных нуклеиновых кислот и белков. Обычные методы флуоресценции ДНК in situ гибридизации (FISH) часто не совместимы с иммуноокрашиванием. Поэтому мы разработали подход к визуализации , MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection of DNA, RNA и protein), который позволяет одновременно проводить одноклеточную визуализацию ДНК, РНК и белка. По сравнению с обычной ДНК FISH, MICDDRP использует технологию разветвленной ДНК (bDNA) ISH, которая значительно улучшает чувствительность и обнаружение олигонуклеотидного зонда. Небольшие модификации MICDDRP позволяют визуализировать вирусные белки одновременно с нуклеиновыми кислотами (РНК или ДНК) различной нити. Мы применили эти протоколы для изучения жизненных циклов нескольких вирусных патогенов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, человеческий Т-лимфотропный вирус (HTLV)-1, вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус Зика (ZKV) и вирус гриппа A (IAV). Мы продемонстрировали, что можем эффективно маркировать вирусные нуклеиновые кислоты и белки в различных спектрах вирусов. Эти исследования могут предоставить нам улучшенное механистическое понимание множественных вирусных систем и, кроме того, служить шаблоном для применения мультиплексированной флуоресцентной визуализации ДНК, РНК и белка в широком спектре клеточных систем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как тысячи коммерческих антител доступны для специфической маркировки белков с помощью обычных иммуноокрашающих подходов, и хотя слитые белки могут быть спроектированы с помощью фотооптимизированных флуоресцентных меток для отслеживания нескольких белков в образце1, микроскопическая визуализация белка часто не совместима с обычной флуоресцентной гибридизацией ДНК in situ (FISH)2 . Технические ограничения в одновременной визуализации ДНК, РНК и белка с использованием флуоресцентных подходов препятствовали глубокому пониманию репликации вируса. Отслеживание как вирусной нуклеиновой кислоты, так и белка во время течения инфекции позволяет вирусологам визуализировать фундаментальные процессы, которые лежат в основе репликации и сборки вируса 3,4,5,6.

Мы разработали подход к визуализации, multiplex immunofluorescent cell-based detection DNA, RNA и Protein (MICDDRP)3, который использует технологию разветвленной ДНК (bDNA) in situ для повышения чувствительности обнаружения нуклеиновых кислот 7,8,9 . Кроме того, этот метод использует парные зонды для повышения специфичности. Зонды, специфичные для последовательности bDNA, используют ветвящиеся предусилители и усилители ДНК для получения интенсивного и локализованного сигнала, улучшая предыдущие методы гибридизации, которые основывались на нацеливании на повторяющиеся области в ДНК9. Инфицированные клетки в клиническом контексте часто не содержат обильного вирусного генетического материала, обеспечивая товар для чувствительного метода обнаружения флуоресцентных нуклеиновых кислот в диагностических условиях. Коммерциализация технологии бДНК с помощью таких подходов, как RNAscope7 и ViewRNA10, заполнила эту нишу. Чувствительность флуоресцентной визуализации бДНК также имеет важное значение в клеточной биологии, позволяя обнаруживать редкие виды нуклеиновых кислот в моделях клеточных культур. Значительное улучшение чувствительности делает методы визуализации на основе бДНК подходящими для изучения вирусов. Потенциальный недостаток, однако, заключается в том, что эти методы сосредоточены на визуализации РНК или РНК и белка. Все реплицирующиеся клетки и многие вирусы имеют геном ДНК или образуют ДНК во время цикла репликации, что делает методы, способные визуализировать как РНК, так и ДНК, а также белок, очень желательными.

В протоколе MICDDRP мы выполняем bDNA FISH для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот с использованием метода RNAscope, с модификациями7. Одной из основных модификаций этого протокола является оптимизация обработки протеазой после химической фиксации. Лечение протеазой облегчает удаление белков, связанных с нуклеиновой кислотой, для повышения эффективности гибридизации зонда. Лечение протеазой сопровождается инкубацией с разветвленным олигонуклеотидным зондом (зонами). После применения зонда (зондов) бДНК образцы промывают и впоследствии инкубируют с предварительным усилителем сигнала и усилителем ДНК. Мультиплексированная гибридизация in situ (ISH), маркировка нескольких генных мишеней, требует целевых зондов с различными цветовыми каналами для спектральной дифференцировки7. Инкубация с усилителями ДНК сопровождается иммунофлуоресценцией (ИФ).

bDNA ISH обеспечивает улучшение сигнал-шум путем усиления сигналов, специфичных для цели, с уменьшением фонового шума от неспецифических событий гибридизации 7,11. Целевые зонды разрабатываются с использованием общедоступных программ, которые предсказывают вероятность неспецифических событий гибридизации, а также вычисляют температуру плавления (Т-м) гибрида зонд-мишень 7,11. Целевые зонды содержат 18-25-базовую область, комплементарную целевой последовательности ДНК / РНК, спейсерную последовательность и 14-базовую хвостовую последовательность. Пара целевых зондов, каждый с отдельной хвостовой последовательностью, гибридизируется с целевой областью (охватывающей ~ 50 оснований). Две хвостовые последовательности образуют сайт гибридизации для датчиков предварительного усилителя, которые содержат 20 сайтов связывания для датчиков усилителя, которые, кроме того, содержат 20 сайтов связывания для зонда метки. Например, область одного килобаза (кб) на молекуле нуклеиновой кислоты нацелена на 20 зондовых пар, создавая молекулярный каркас для последовательной гибридизации с предусилителем, усилителем и зондом метки. Таким образом, это может привести к теоретическому выходу 8000 флуоресцентных меток на молекулу нуклеиновой кислоты, что позволяет обнаруживать отдельные молекулы и значительно улучшать по сравнению с обычными подходамиFISH 7 (см. Рисунок 1A для схемы усиления сигнала бДНК). Чтобы настроить зонды для мультиплексированного ISH, каждый целевой зонд должен находиться в другом цветовом канале (C1, C2 или C3). Эти целевые зонды с различными цветовыми каналами имеют различные 14-базовые хвостовые последовательности. Эти хвостовые последовательности будут связывать различные усилители сигнала с различными флуоресцентными зондами, что позволит легкой спектральной дифференциации по нескольким мишеням. В представленном Протоколе, таблица 4 на этапе 9, содержит дополнительную информацию о флуоресцентной маркировке целевых зондов. Кроме того, на рисунках 2 и 3 приведены примеры того, как мы выбрали соответствующий усилитель 4-FL (A, B или C) (флуоресцентный зонд и заключительная стадия гибридизации) для достижения специфической флуоресцентной маркировки нескольких мишеней вирусных нуклеиновых кислот после инфекций ВИЧ-1 и HTLV-1.

Мы продемонстрировали несколько применений одновременной флуоресцентной визуализации РНК, ДНК и белков, наблюдая критические стадии репликации вируса с высоким пространственно-временным разрешением 3,4,5. Например, одновременная одноклеточная визуализация вирусной РНК, цитоплазматической и ядерной ДНК и белка позволила нам визуализировать ключевые события во время заражения ВИЧ-1, в том числе следование РНК, содержащей ядра в цитоплазме, до входа в ядер и интеграции провирусной ДНК3. Кроме того, мы применили MICDDRP для характеристики влияния факторов хозяина и медикаментозного лечения на вирусную инфекцию и репликацию 4,5. В Ukah et al. мы отслеживали реактивацию транскрипции ВИЧ-1 в моделях латентных клеток, обработанных различными агентами, реверсирующими латентность, для визуализации транскрипции ВИЧ и обращения латентности4. Кроме того, MICDDRP может позволить нам визуализировать фенотипические изменения, связанные с противовирусным ингибированием, приписываемые лечению малыми молекулами или ограничению фактора хозяина. В качестве доказательства концепции надежности и широкой применимости нашего подхода мы продемонстрировали, что мы можем использовать модификации нашего протокола для эффективной маркировки вирусной нуклеиновой кислоты для отслеживания инфекции не только вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, но и человеческим Т-лимфотропным вирусом (HTLV)-1, вирусом гепатита В (HBV), вирусом гепатита С (HCV), Вирус Зика (ZIKV) и вирус гриппа А (IAV). Поскольку жизненный цикл ВИЧ-1 состоит как из вирусной ДНК, так и из видов РНК, мы выполнили большую часть нашей оптимизации MICDDRP после кинетики репликации ВИЧ-1. Однако, кроме того, мы продемонстрировали, что мы можем отслеживать синтез различных вирусных транскриптов РНК одной или обеих чувств (+) и антисмысловой (-) нити у вирусов, таких как ZIKV, IAV, HBV и HCV, для мониторинга вирусной транскрипции и репликации 3,4,5,6. Исследования направлены на улучшение механистического понимания нескольких вирусных процессов и служат руководством для реализации этой технологии флуоресцентной визуализации в широком спектре клеточных моделей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Семенные клетки (суспензия против адгезивных клеток) на обтекателях или слайдах камеры (в представленном протоколе используются чехлы).

  1. Посев суспензионных клеток
    1. Приготовьте покрытые поли-D-лизином (PDL) покровные листы (облегчает прилипание клеток суспензии к крышке), сначала инкубируя покровные листы в этаноле (EtOH) в течение 5 минут (стерилизует покровы и удаляет любые остатки). Затем промыть 2 раза в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) перед инкубацией крышки в PDL (20 мкг/мл) в течение 30 минут (мин) при комнатной температуре (RT).
    2. Удалите PDL и помойте 2x в PBS. Пеллетные клетки (ранее инфицированные/обработанные на основе желаемых условий визуализации) и повторное суспендирование 106клеток в 50 мкл PBS. Поместите 50 мкл клеток на стекло (с PDL-покрытием) и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
  2. Посев адгезивных клеток
    1. Культивирование клеток на стерильном покрове помещают в 6-луночную посуду и заражают клетки вирусными частицами или обрабатывают интересующим соединением. Позвольте клеткам достичь 50-70% слияния до подготовки образца к экспериментам по визуализации.

2. Клеточная фиксация: сохранение клеточной морфологии для флуоресцентных исследований визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите 4% PFA и PBS на RT в течение не менее 30 минут до клеточной фиксации.

  1. Аспирируйте клеточную среду, промывайте клетки на покровных листах 3x в PBS и фиксируйте клетки в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. Аспирировать PFA и промывные ячейки в PBS 2x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки теперь можно обезвоживать и хранить, если экспериментатор желает возобновить эксперимент в другую дату. Фиксированные клетки могут быть обезвожены в EtOH перед хранением.
    1. Удалите PBS после промывки после клеточной фиксации и замените 500 мкл 50% EtOH (v/v в воде). Инкубировать на RT в течение 5 мин.
    2. Удалите 50% EtOH и замените 500 мкл 70% EtOH. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
    3. Удалите 70% EtOH и замените 500 мкл 100% EtOH. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
    4. Удалите 100% EtOH и замените свежим 100% EtOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоженные клетки могут храниться при -20 °C в течение 6 месяцев. Запечатывают пластины лентой или парапленкой перед хранением для предотвращения испарения EtOH.
    5. Регидратировать клетки для перехода на мультиплексированную флуоресцентную маркировку клеток/вируса.
    6. Удалите 100% EtOH и замените 500 мкл 70% EtOH. Инкубировать на RT в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам высыхать в любое время. Всегда используйте достаточное количество раствора, чтобы погрузить все клетки.
    7. Удалите 70% EtOH и замените 500 мкл 50% EtOH. Инкубировать на RT в течение 2 мин.
    8. Удалите 50% EtOH и замените на 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте разбавление протеазы, зонды гибридизации и промывочный буфер до обработки протеазой (этап 4) и применения целевого зонда (этап 5). Конкретные инструкции по подготовке реагентов представлены в начале каждого соответствующего этапа.
РеагентовДругие примечания
Раствор протеазыПодготовка в 1X PBS
Мишень олигонуклетодных зондовРазбавление в буфере гибридизации
Буфер для стиркиПромывка после целевых этапов гибридизации
Буфер гибридизацииРецепт представлен в таблице 3

Таблица 1: Ключевые реагенты в протоколе MICDDRP.

3. Пермеабилизация клеток: увеличивает доступ к клеткам и клеточным органеллам для проникновения крупных молекул (антител, зонды гибридизации нуклеиновых кислот)

  1. Удалите 1x PBS после клеточной фиксации или регидратации и замените 500 мкл 0,1% (v/v) Tween-20 в 1x PBS. Инкубировать в RT в течение 10 мин. Заменяйте один за другим. Вымойте один раз с 500 мкл 1x PBS и добавьте свежий 1x PBS.

4. Покровная иммобилизация на стеклянном слайде и лечение протеазой для удаления белков, связывающих нуклеиновые кислоты, из фиксированной вирусной / клеточной нуклеиновой кислоты для повышения эффективности гибридизации

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время клеточной пермеабилизации готовят раствор разбавленной протеазы III (см. особенности реагента в таблице материалов). Дайте протеазе достичь RT за 10 мин до пермеабилизации.

  1. Поместите небольшую каплю лака для ногтей на стерилизованную стеклянную горку. Высушите спину (сторону без клеточного слоя) и поместите край обшивки на каплю лака для ногтей, стороной с прилипшими клетками вверх. Добавьте несколько капель PBS на иммобилизованный покров, чтобы предотвратить высыхание.
    1. Нарисуйте круг (на расстоянии около 3 мм от крышки) по периметру крышки, теперь приклеенное к слайду с помощью гидрофобной барьерной ручки (водоотталкивающей ручки, которая удерживает реагенты локализованными на клетках).
  2. Разбавляют протеазу III в 1x PBS (100 мкл/крышка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию протеазы может потребоваться скорректировать в зависимости от различий в типах клеток, зондов или целевых нуклеиновых кислот с помощью эмпирической оптимизации (см. Обсуждение). Для наиболее эффективной маркировки РНК/ДНК в различных вирусных системах мы добились успеха со следующими разведениями, представленными в таблице 2 ниже, с разведениями в диапазоне от (1 до 2)-(от 1 до 15) (протеаза до 1x PBS).
Зондовые мишениРазведение протеазы в 1X PBS (от Protease III до 1X PBS)
ДНК/РНК ВИЧ-1от 1 до 5
HTLV-1 ДНК/РНКот 1 до 5
HBV pgRNA и общая HBV РНКот 1 до 15
РНК IAVот 1 до 15
ЗИКВ РНК1 до 2

Таблица 2: Разведения протеазы III в PBS для гибридизации вирусных нуклеиновых кислот.

  1. Нанесите 1x PBS на крышку после иммобилизации и нанесите разбавленную протеазу III.
  2. Инкубировать в увлажненной духовке при 40 °C в течение 15 мин.
  3. Декант протеазного раствора и погружные слайды в 1x PBS. Перемешивать с помощью качающейся посуды в течение 2 мин на RT. Повторите мытье с новым 1x PBS.
    1. Только для обнаружения ДНК промывайте образцы три раза водой без нуклеазы в течение 2 мин каждая, а затем инкубируйте с 5 мг/мл РНКазы А, разведенной в PBS в течение 30 мин при 37 °C.
    2. Декантируйте раствор РНКазы А и промывайте 3 раза в течение 2 мин сверхчистой водой. Продолжайте использовать ISH целевого зонда (зондов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер гибридизации улучшает обнаружение vDNA, не влияя на эффективность окрашивания вРНК для представленных результатов (репрезентативные результаты). Разбавляйте зонды КАНАЛА ДНК 1 (C1) 1:1 с помощью гибридизационного зонда. Разбавляют РНК-зонды C2 и C3 в буфере гибридизации. Зонды C2 и C3, используемые в наших исследованиях визуализации, находятся в решениях 50X (1:50; целевой зонд для буфера гибридизации).
  4. Подготовьте буфер гибридизации в воде без нуклеазы, следуя приведенной ниже пошаговой процедуре:
    1. В пробирку объемом 15 мл добавляют 700 мкл нуклеазной свободной воды, 300 мкл 50% (масса/объем (мас./об.)) декстрана сульфата, 300 мкл 5 М NaCl, 125 мкл 200 мМ цитрата натрия (рН 6,2) и 375 мг (порошок) этиленкарбоната.
    2. Хорошо перемешайте, используя вихрь, чтобы растворить этиленкарбонат (убедитесь, что весь порошок растворен и прозрачный раствор).
    3. Добавьте 25 мкл 10% (объем/объем (v/v)) Tween-20 и достаточное количество воды без нуклеазы для получения 2,5 мл (2x раствора).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный рецепт буфера гибридизации можно найти в таблице 3 ниже. Раствор стабилен в течение недели. Обеспечьте достаточное перемешивание моющего средства Tween-20, соблюдая при этом осторожность, чтобы предотвратить пузырьки раствора.
РеагентКонцентрация запасовДополнительные примечания
Вода без нуклеазН.А.
Декстран сульфат50% (с об.)Очень вязкий
Хлорид натрия5 М
Цитрат натрия (рН 6,2)200 мМХранить при температуре 4 °C
ЭтиленкарбонатН.А.Порошок
Анимация движения-2010% (об/об)

Таблица 3: Буферный перечень реагентов гибридизации.

5. Инкубация с помощью зондов гибридизации мишеней ДНК/РНК: целевые олигонуклеотидные зонды связываются с областью (областями) интереса, создавая молекулярный каркас для связывания предварительных усилителей, усилителей и флуоресцентных зондов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Теплые днк/РНК-зонды при 40 °C в течение 10 мин (во время клеточной пермеабилизации) и охлаждаются до RT в течение не менее 10 мин, если лечение РНКазой не включено. Если обработка РНКазой или дальнейшая обработка образца необходима до гибридизации целевого зонда, нагревайте зонды соответственно. Спинные зонды C2 и C3 после нагревания и разбавляются в буфере гибридизации. После разбавления зонды C2 и C3 можно ненадолго нагревать. Нагревайте 50-кратный буфер для промывки (см. Таблицу материалов для более подробной информации) при 40 °C в течение 10-20 мин и разбавляйте до 1 раза в воде класса молекулярной биологии.

  1. Инкубировать 200 мкл буфера гибридизации при 67 °C в течение 10 мин перед добавлением гибридизационного зонда (зондов). Разбавление зонда в буфере гибридизации (рецепт приведен в таблице 2). Добавьте 50 мкл/крышку.
  2. Инкубировать в увлажненной печи при 40 °C в течение 2 часов (ч). Зонды деканта и погружные слайды в 1-кратный буфер промывки. Перемешивать, качая посуду в течение 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.

6. Гибридизация усилителя (Amp) 1-FL: добавление предварительного усилителя, который комплементарен хвостовой последовательности целевых днк/РНК-зондов (Шаг 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Усилители должны быть на RT перед использованием. Достаньте каждый отдельный усилитель из холодильника за 30 минут до использования и оставьте на скамейке в RT.

  1. Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
  2. Добавьте 1 каплю Amp 1-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной духовке при 40 °C в течение 30 мин.
  3. Декантный усилитель 1-FL и погружение в 1x буфер промывки. Перемешивать, качая посуду 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.

7. Amp 2-FL Гибридизация: инкубация с усилителем сигнала с родственной последовательностью распознавания с предварительными усилителями (Amp 1-FL)

  1. Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
  2. Добавьте 1 каплю Amp 2-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной печи при 40 °C в течение 15 мин.
  3. Декантный усилитель 2-FL и погружение в 1-кратный буфер промывки. Перемешивать, качая посуду 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.

8. Amp 3-FL гибридизация: инкубация со вторым усилителем сигнала

  1. Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
  2. Добавьте 1 каплю Amp 3-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной духовке при 40 °C в течение 30 мин.
  3. Декантный усилитель 3-FL и погружение в 1-кратный буфер промывки. Перемешивать, качая посуду 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.

9. Гибридизация Amp 4-FL: флуоресцентная этикетка и конечная стадия гибридизации

ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, см. Таблицу 4, чтобы выбрать подходящий Amp 4 (A, B или C) - FL на основе каналов целевого зонда (зондов). Оцените, какой Amp 4-FL необходим для маркировки ДНК/ РНК, представляющей интерес. Пример приведен в таблице ниже:

ABC
Канал ДНК 1 (C1)488550550
Канал ДНК/РНК 2 (C2)550488647
Канал РНК 3 (C3)647647488

Таблица 4: Выбор флуоресцентного зонда Amp 4 (A, B или C)-FL для мультиплексированного ISH.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для мультиплексированных FISH (несколько целей) выбор правильного усилителя 4 (A, B или C) - FL имеет решающее значение для правильной маркировки интересующей вас цели. Целевые зонды (шаг 5) имеют различные цветовые каналы (C1, C2 или C3), которые диктуют свою соответствующую флуоресцентную метку (Alexa 488, Atto 550 или Alexa 647) в зависимости от выбранного Amp 4-FL. Примеры выбора комбинаций флуорофоров для мультиплексированной визуализации приведены в условных обозначениях рисунков 2 и 3. В качестве дополнительного примера, выбор Amp 4B-FL будет избирательно маркировать зонды ДНК C1 с помощью Зондов Atto 550 и зондов РНК C3 с Alexa 647.

  1. Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
  2. Добавьте 1 каплю Amp 4-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной печи при 40 °C в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После шага 9.2 держите образцы закрытыми, защищенными от света.
  3. Декантный усилитель 4-FL и погружение в 1x буфер промывки. Перемешивать, качая посуду в течение 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья. Вымойте с 1x PBS (2 мин) и храните в PBS.

10. Иммуноокрашивание белка: для маркировки белка (белков), представляющих интерес

  1. Декантируйте PBS и добавьте 200 мкл блокирующего буфера (1% мас./об BSA, 10% v/v FBS в PBS с 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) к крышке. Инкубировать 1 ч на РТ.
  2. Декант блокирует буфер и применяют 200 мкл первичного антитела, разведенного в ПБСТ + 1% мас./об.БСА. Инкубировать 1 ч на РТ.
  3. Дважды промыть горку ПБСТ в течение 10 мин при РТ с встряхиванием.
  4. Применяют вторичные антитела по выбору в течение 1 ч при РТ в ПБСТ + 1% мас./об.БСА.
  5. Промыть горку с ПБСТ в течение 10 мин при РТ с встряхиванием.

11. Ядерное окрашивание: ядра против окрашивания после иммуноокрашивания

  1. Декантировать PBST и наносить DAPI или ядерное пятно на выбор в течение 1 мин на RT.
  2. Дважды промойте горку PBS в течение 10 мин на RT с встряхиванием.

12. Монтаж

  1. Поместите 1 каплю антизатухретого раствора (например, Prolong Gold) на новый стерильный стеклянный слайд (сначала очистите слайд с EtOH и дайте высохнуть, чтобы убедиться, что на стекле нет остатков). С помощью этого же наконечника нанесите каплю антитеплевидного раствора, чтобы покрыть область размером примерно с крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антизатухающий раствор очень вязкий и может быть трудным для пипетки. Отрезание наконечника от наконечника объемом 200 мкл перед пипеткой может смягчить эти проблемы.
  2. Снимите крышку с образцом клетки с слайда и погрузитесь в PBS, чтобы удалить остаточный лак для ногтей сзади с помощью щипцов и PBS. Сухие щипцы и задняя часть крышки с помощью Kimwipe.
  3. Аккуратно втирают крышку в каплю антизатухретого раствора, помещая образец сбоку (сторону с клеточным слоем) покровного слипа на каплю).
  4. Дайте образцам высохнуть в течение ночи.

13. Визуализация

  1. Изображение с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема MICDDRP изображена на рисунке 1. Маркировка ДНК и РНК сопровождается иммуноокрашиванием. Использование разветвленных усилителей увеличивает сигнал, позволяя обнаруживать молекулы одиночных нуклеиновых кислот.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема MICDDRP и пошаговый рабочий процесс. (A) сигнал бДНК усиливается с помощью разве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одновременная визуализация РНК, ДНК и белка часто требует обширной оптимизации. Двумя широко используемыми методами являются маркировка 5-этинил-2-дезоксиуридина (EdU) и ДНК FISH. Маркировка EdU была применена для визуализации вирусной ДНК и белка одновременно, поскольку EdU включен в зарождающуюся ДНК и впоследствии маркируется азидосодержащими флуоресцентными красителями с помощью химии щелчков. Таким образом, маркировка EdU может быть использована для мониторинга кинетики репликации нативных вирусов ДНК вирус...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана полностью или частично Национальными институтами здравоохранения (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 и U54 AI150472). Мы благодарим д-ра Раймонда Ф. Шинази и Сэди Амичай за предоставление клеток, инфицированных вирусом гриппа А.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% PFA
50% сульфат декстранаAmreso198Для буфера для гибридизации ДНК
50X буфер промывкиACD Bio320058
6-луночные планшеты
Амплификатор 1-FLACD Bio
Amplifier 2-FLACD Bio
Amplifier 3-FLACD
Amplifier 4-FLACD BioConsult Amp-4 таблица в протоколе
Anti-HCV NS5a антителоAbcamab13833Mouse monoclonal; работает с генотипами HCV 1a, 1b, 3 и 4
Anti-HIV-1 p24 моноклональное антителоNIH AIDS Reagent Program3537
Anti-Mov10 антителоAbcamab80613Rabbit поликлональный
Антитела против PB1GeneTexGTX125923Антитела против белка гриппа
Бычий сывороточный альбуминБлокирующий реагент для иммуноокрашивания
Клеточные среды с добавками Носители, подходящие для клеточной модели
Покровные
DAPIACD BioЯдерное окрашивание (набор RNAscope от ACD Bio)
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (1X PBS)Gibco14190250без кальция и магния
ЭтиленкарбонатSigmaE26258
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Используйте специфический FBS в зависимости от того, в какой сыворотке были подняты вторичные антитела (например, козий FBS)
Fisherbrand colorfrost плюс предметные стекла для микроскопаFisher Scientific12-550-17/18/19Предварительно очищенный
HCV-GT2a-sense-C2 зондACD Bio441371HCV(+) сенсорный РНК-зонд
HIV-gagpol-C1ACD Bio317701ВИЧ-1 кДНК-зонд
HIV-nongagpol-C3ACD Bio317711-CРНК-зонд HIV-1
HybEZ гибридизационная печьACD Bio321710/321720
ImmEdge гидрофобная барьерная ручкаVector LaboratoriesH-4000
ЛакДля иммоболизации покровного стекла до скольжения перед лечением протеазой
Вода без нуклеазыAmbionAM9937
Poly-d-лизин (PDL)Покровные стекла 20 & микро; г/мл PDL в течение 30 минут
Зонд разбавительACD Bio300041Для разбавления РНК С2 или С3 зондов
Prolong gold antifadeInvitrogenP36930
Protease IIIACD Bio322337
РНКоскоп®   Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221
РНКаза АВторичные
Слайды
ХлоридДля буфера для гибридизации ДНК Цитрат
натрия, pH 6,2Для буфера для гибридизации ДНК
Для буфера для гибридизации ДНК и PBS-T
V-HBV-GTDACD Bio441351Total HBV РНК
V-HBV-GTD-01-C2ACD Bio465531-C2HBV pgRNA зонд
V-HCV-GT2a зондACD Bio441361HCV(-) sense RNA зонд
ACD Bio495071-C3HTLV-1 (-) sense RNA зонд нацеленный на HBZ
V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2HTLV-1 ДНК-зонд
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD Bio495061HTLV-1 (+) сенсорный РНК-зонд
V-influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221IAV РНК-зонд
V-ZIKA-pp-O2ACD Bio464531Зика(+) сенсорный РНК-зонд
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2ACD Bio478731-C2Зика(-) смысловая РНК зонд
Bioстекла для ногтей антитела Qiagen натрия Tween-20 V-HTLV-HBZ-sense-C3

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).
  4. Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
  5. Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
  6. Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721(2019).
  9. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  10. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
  11. Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  12. Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
  13. Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
  14. Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).
  15. Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Multiplex Fluorescence ImagingViral Nucleic Acid DetectionViral Protein VisualizationSingle Cell AnalysisBranched DNA ISH TechnologyImmunofluorescent Cell Based DetectionConfocal MicroscopyHIV 1 Infection StudyHBV RNA QuantificationHCV Infection Imaging

Похожие статьи