Murine Модель ишемической травмы сетчатки индуцированных переходных двусторонних общих сонной артерии окклюзии

Сетчатка является нейросенсорной тканью для зрительной функции. Так как значительное количество кислорода необходимо для зрительной функции, сетчатка известна как один из самых высоких кислорода требовательных тканей в организме¹. Сетчатка подвержена сосудистым заболеваниям, так как кислород доставляется через кровеносные сосуды. Различные типы сосудистых заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия и сетчатки кровеносных сосудов (вен или артерий) окклюзии, может вызвать ишемию сетчатки. Для исследования патологических механизмов ишемии сетчатки необходимы воспроизводимые и клинически значимые экспериментальные модели ишемии сетчатки. Окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) путем вставки интралюминальной нити является наиболее часто используемый метод для развития виво-грызунов моделей экспериментальной ишемии^{головного мозга 2,3}. Из-за близости офтальмологической артерии (OpA) к MCA, модели MCAO также используются одновременно, чтобы понять патофизиологию ишемии^{сетчатки 4,5,6}. Чтобы вызвать ишемию головного мозга наряду с ишемией сетчатки, длинные нити, как правило, вставляются через разрез общей сонной артерии (CCA) или внешней сонной артерии (ECA). Эти методы трудно выполнить, требуют длительного времени, чтобы завершить операцию (более 60 минут для одной мыши), и привести к высокой изменчивости в результатах после^{операции 7}. По-прежнему важно разработать более качественую модель для улучшения этих проблем.

В этом исследовании мы просто использовали короткие переходные двусторонние окклюзии CCA (tBCCAO) с иглами и зажимом, чтобы вызвать ишемию сетчатки у мышей и проанализировали типичные результаты ишемических травм сетчатки. В этом видео мы дадим демонстрацию процедуры tBCCAO.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Кейо.

1. Подготовка хирургических инструментов и животных

1. Автоклав хирургических инструментов и держать их в 70% этилового спирта. Перед каждой новой хирургической процедурой, чистые хирургические инструменты тщательно используя 70% этилового спирта.
2. Подготовка самцов мышей BALB/cAJc1 (6 недель, 26-28 кг) в комнате, свободной от конкретных патогенов (SPF), для поддержания стерильных условий до, во время и после операции.

2. Переходные двусторонние общие окклюзии сонной артерии (tBCCAO)

1. Поставь мышь под наркоз через внутриперитонеалевую инъекцию с сочетанием мидазолама (40 мкг/100 МКЛ), медетомидина (7,5 мкг/100 МКЛ) и буторфанола тарта (50 мкг/100 МКЛ), как описано ранее^8,9. Держите спину мыши шкуры держать мышь подальше от натыкаясь глаза, пока мышь полностью анестезируется.
   1. Судите глубину анестезии, щипать мышеловку, пока она не имеет ответа, из которых метод обычно используется для проверки полной анестезии¹⁰.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, менее 5 минут, необходимых для мышей, чтобы заснуть. Правильные рецепты для общей анестезии могут быть разными по учреждениям.
2. Нанесите одну каплю 0,1% очищенного гиалуроната натрия раствор глазной капли на глаза, чтобы предотвратить сухость на глазах под наркозом.
3. Поместите мышь на спину и исправить лапы мыши с помощью клеевых лент.
4. Дезинфицировать область шеи мыши с помощью 70% этилового спирта до операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная обрезка меха не была выполнена, так как это может привести к последующему воспалению^{кожи 11,12}.
5. Выполните сагиттаальный разрез шеи лезвием(рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен быть сделан на средней линии между шеей, грудиной и трахеей.
6. Отделяйте обе слюнные железы, тщательно используя два типса и мобилизуйте их для визуализации лежащих в основе CCAs.
7. Изолировать право CCA тщательно от соответствующих вагальных нервов и сопровождающих вен, не нанося ущерба их структурам, и поместить два 6-0 шелковые швы под CCA. Свяжите две связи плотно, чтобы блокировать кровоток(рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры, небольшие вены могут быть повреждены. Если кровотечение видно, вытирая требуется для визуализации CCAs четко.
8. Найти левый CCA тщательно от соответствующих вагальных нервов и сопровождающих вен, не нанося ущерба их структурам, и occlude левой CCA в течение 2 секунд зажимом (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 6-0 шелковый шов иглы необходимо поместить под левой CCA, чтобы отметить сайт для зажима.
9. После повторного открытия левой CCA, швовые раны шеи 6-0 шелковый шов и применить мазок антибиотика (50 МЛ) на шею, чтобы ингибировать бактериальную инфекцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягко удалить зажим, чтобы избежать повреждения артериальной стенки при повторном открытии левой CCA.
10. Введать 0,75 мг/кг атипамизола гидрохлорид интраперитонально мыши, чтобы помочь мыши оправился от глубокой анестезии быстро. Верните мышь в клетку мыши с предварительно нагретыми прокладками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте мыши оставить без присмотра, пока мышь не приходит достаточно сознания для поддержания стернальной лежачих.
11. Ввесните 0,4 мг/кг тартрата буторфанола мыши для ведения боли, когда мышь просыпается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. В качестве первого намека на успешный tBCCAO, веки опустив мышь можно наблюдать (Рисунок 2).
12. Для эвтаназии, вводить 3x смеси MMB для мышей и пожертвовать ими для экспериментов.

3. Общие наблюдения (выживаемость и опущение век)

1. После операции проверьте выживаемость по всем причинам смерти в день 0 (после операции), 1, 3 и 7.
2. Оцените опущение век по 4-очковой рейтинговой шкале: 1 - отсутствие опущения, 2 - мягкое опущение (50%), 3 - тяжелое опущение (более 50%) и 4 - тяжелое опущение с выделением глаз.

4. Перфузия крови сетчатки

1. Ввись 200 л FITC-декстрана (25 мг/мл) в левый желудочек мыши, который обычно используется для наблюдения перфузии крови в сосудах^{сетчатки мыши 13,14}.
2. Через 2 минуты после кровообращения, enucleate глаза и исправить в 4% параформальдегид в течение 1 часа. Сетчатки были тщательно получены и плоские, как описано ранее¹⁵, и рассмотрены с помощью флуоресцентного микроскопа.
3. Сфот фотографируете целые крепления сетчатки при 4x увеличении и сливайте в один с помощью анализатора слияния, ранее описанного^16.
4. Измерьте пронизанные области с помощью инструмента анализа судов в программном обеспечении NIH Fiji/ImageJ.

5. Западная помарка

1. Через 3 и 6 часов после tBCCAO, получить глаза мышей и немедленно перейти к чашке Петри, содержащей холодный PBS изолировать сетчатку.
2. После изоляции сетчатки, выполнять западные blotting, как ранее описано⁹.
3. Инкубировать антителами для гипоксии-индуцированный фактор-1 "(HIF-1 "; общий маркер гипоксии) и для β-Actin (внутренний контроль загрузки) в одночасье следуют инкубации HRP-спряженных вторичных антител. Визуализуя сигналы с помощью химилюминесценции.

6. Количественный ПЦР (qPCR)

1. 6, 12 и 24 часов после tBCCAO, процесс полученных сетчатки для qPCR, как описано ранее¹⁷.
2. Выполните qPCR с помощью ПЦР-системы в режиме реального времени. Используемые праймеры перечислены в таблице 1. Рассчитайте изменения складок между уровнями различных транскриптов методом_КС Т.

7. Иммуногистохимия (IHC)

1. Через 3 дня после tBCCAO, получить глаза мышей и вставлять в парафин.
2. Вырезать парафин-встроенные глаза микротом, чтобы получить секции глаз.
3. Де-парафинизировать и испачкать глаз разделы толщиной 5 мкм, как описано ранее¹³.
4. Инкубировать с антителом для глиального фибриллярного кислого белка (GFAP; надежный маркер для астроцитов и клеток Мюллера в сетчатке) в одночасье следуют инкубации Alexa Fluor 555-спряженных вторичных антител.
5. Используйте DAPI (4',6-diamidino-2-фенилиндол) для окрашивания ядра в сетчатке. Визуализация сигналов с помощью флуоресцентной микроскопа.
6. Оцените морфологию скоринга по 4-балльной рейтинговой шкале, как описано^{ранее 13,18}: 0 - нет сигнала, 1 - несколько положительных глиальных конечных футов в слое ганглионных клеток (GCL), 2 - несколько обозначенных процессов, достигающих от GCL до внешнего ядерного слоя (ONL), и 3 - наиболее маркированные процессы, достигаемые от GCL до ONL.

8. Электроретинография (ERG)

1. Через 3 и 7 дней после tBCCAO, выполните ERG с помощью купола Ganzfeld, системы приобретения и светодиодных стимуляторов, как описано^{ранее 9}.
2. После темной адаптации в одночасье, анестезировать мышей с сочетанием MMB под тусклым красным светом.
3. Используйте смешанный раствор 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина для расширения зрачков.
4. Поместите активные электроды на контактные линзы и поместите эталонный электрод во рту.
5. Получите ответы ERG от обоих глаз каждого животного.
6. Запись scotopic ответы под темной адаптации с различными стимулами.
7. Измерьте амплитуды волны от базовой линии до самой низкой точки волны.
8. Измерьте амплитуды b-волны от самой низкой точки а-волны до пика b-волны.
9. Держите всех мышей в тепле во время процедуры с помощью тепловых колодок.

9. Оптическая когерентная томография (ОКТ)

1. Через 2 недели после tBCCAO, выполнить OCT с помощью системы SD-OCT, как сообщалось^{ранее 8,9}.
2. Для измерения, субъект мышей к mydriasis смешанным раствором 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина, а также общей анестезии смесью MMB.
3. Получить B сканирование изображений из экваториальных ломтиков ан-лицо сканирования.
4. Изучите сетчатку на 0,2, 0,4 и 0,6 мм от головы зрительного нерва.
5. Измерьте толщину сетчатки от слоя нервного волокна сетчатки (NFL) до внешней ограничивающей мембраны (ELM) и учитывайте среднее измеренное значение как толщину сетчатки отдельной мыши.
6. Участок результаты, как паук диаграммы.

После системной циркуляции FITC-декстрана в течение 2 минут были обследованы сосуды сетчатки левой и правой сетчатки у фиктивных мышей и мышей, управляемых tBCCAO(Дополнительный рисунок 1). FITC-декстран был полностью виден в обеих сетчатках у фиктивных мышей и левой сетчатки у мышей, управляемых tBCCAO, в то время как он был частично обнаружен в правой сетчатке у мышей, управляемых tBCCAO.

После tBCCAO, опущение век было рассмотрено(рисунок 2). Правые глаза показали мягкий (оценка 2; 75%) и тяжелое веко (оценка 3 и 4; 25%) опустив, в то время как левые глаза не опустив (оценка 1; 93,75%) за исключением одной мыши (оценка 2; 6,25%). Хотя тяжелое опущение век с выделением глаз не наблюдалось у мышей, управляемых tBCCAO, мы могли видеть одну мышь для этого фенотипа (оценка 4; 6,25%).

Снижение кислородного статуса в тканях приводит к стабилизации HIF-1 и индукции ряда гипоксии-ответных генов, таких как EPO, VEGF и BNIP319,20,21. Во-первых, молекулярная биологическая гипоксия с использованием общего гипоксического маркера HIF-1 была оценена с помощью западного blotting(рисунок 3). Увеличение экспрессии HIF-1 было значительно отмечено в правой сетчатке через 3 и 6 часов после tBCCAO. Далее, выражения гипоксии-ответных генов были оценены с помощью qPCR(Дополнительный рисунок 2). Через 6 часов после tBCCAO не произошло существенных изменений в выражениях генов, реагирующих на гипоксию. Через 12 часов после tBCCAO, мы обнаружили, Binp3 выражение значительно увеличилось и небольшое увеличение экспрессии Epo было показано в правой сетчатке. Через 24 часа после tBCCAO, мы также могли бы найти небольшое увеличение экспрессии Epo в правой сетчатке, хотя это не было статистически значимым. Выражение Vegf не было изменено с 6 до 24 часов у мышей, управляемых tBCCAO.

Сетчатка реактивный глиоз был рассмотрен через 3 дня после tBCCAO (Рисунок 4), как глиа, такие как астроциты и клетки Мюллера были тесно связаны с ишемиейсетчатки 22. GFAP широко используется для обнаружения астроцитов и клеток Мюллера в сетчатке23. Средние показатели морфологии для маркировки GFAP в правой сетчатке был самым высоким среди обеих сетчатки у фиктивных мышей и левой сетчатки у мышей, управляемых tBCCAO. На основе локализации экспрессии GFAP считается, что изменение морфологии в маркировке GFAP отражает активацию клеток Мюллера.

ERG был использован для изучения дисфункции сетчатки после tBCCAO (Рисунок 5). Амплитуды b-волны в правом глазу резко снизились через 3 и 7 дней после tBCCAO. Однако амплитуды а-волны в правом глазу существенно не изменились. Когда дело доходит до левого глаза, мы не могли видеть никаких изменений в амплитуды а- и b-волн(Дополнительный рисунок 3).

Мы выполнили OCT, чтобы определить изменение толщины сетчатки после tBCCAO(рисунок 6). Толщина сетчатки в правом глазу резко увеличилась через 2 недели после tBCCAO, в то время как не было никакой разницы в толщине сетчатки в левом глазу между tBCCAO- и фиктивных мышей.

Рисунок 1: Схема модельной процедуры и кровообращения в кругу Уиллиса. Схематическая иллюстрация показала индуцированную tBCCAO модель модели сетчатки и кровообращение сетчатки. CCA, ECA, ICA, PCA и OpA представляют общую сонную артерию, внешнюю соонную артерию, внутреннюю соонную артерию, заднюю связуя артерию и офтальмологическую артерию, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Век опустился после tBCCAO. Тяжесть опущения век оценивалась по 4-очковому рейтингу, основанному на эталонных изображениях: 1 - отсутствие опущения, 2 - мягкое опущение (50% опущения), 3 - тяжелое опущение (более 50% опустив) и 4 - тяжелое опущение с выделением глаз. Опущение век наблюдалось после tBCCAO и поддерживалось в ходе экспериментального наблюдения. Результаты (sham: n No 10, tBCCAO: n No 16) были построены как участок рассеянной точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Стабилизация HIF-1 после tBCCAO. Представитель иммуноблоскопов и количественных анализов (группы в течение часа 3; фиктивный: n No 3, tBCCAO: n No 6 и группы в течение часа 6; обман и tBCCAO: n No 6) для HIF-1 и β-Actin показали, что HIF-1 был стабилизирован в правой сетчатке 3 и 6 часов после tBCCAO. 0,05. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Реактивный глиоз после tBCCAO. Представитель sagittal разделы сетчатки (фиктивный: n No 4, tBCCAO: n No 4) и количественные анализы маркировки GFAP (красный) по морфологии скоринга (0-3) показали, что GFAP маркировки, в основном ограничивается в NFL-GCL, был расширен на весь внутренний слой, от GCL до ONL (белые стрелки) в правой сетчатке после tBCCAO. Шкала баров, 50 мкм. DAPI (синий) был использован для окрашивания ядра в сетчатке. NFL, GCL, IPL, INL и ONL представляют слой нервного волокна, слой ганглионных клеток, внутренний плексиформный слой, внутренний ядерный слой и внешний ядерный слой, соответственно. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как медиана с межквартильным диапазоном, 25-м и 75-м процентильным. 0,05. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Визуальная дисфункция правого глаза после tBCCAO. (A)Репрезентативные волновые формы темно-адаптированной ERG выполняются через 3 и 7 дней после tBCCAO. Интенсивность стимуляции (cd.s/m2): 0.005. (B)Количественные анализы показали, что произошло снижение амплитуды b-волны в правом глазу (фиктивно: n No 5, tBCCAO: n No 6), в то время как амплитуды волны не изменились. 0,05, 0,01 л; 0,01. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Изменение толщины сетчатки после tBCCAO. Репрезентативные изображения OCT в сетчатке сетчатки, работаемой в фиктивных и tBCCAO, и количественные анализы показали, что произошло увеличение толщины сетчатки в правой сетчатке (фиктивная: n No 4, tBCCAO: n No 8). Не произошло никаких изменений в толщине сетчатки левой сетчатки (фиктивно: n No 4, tBCCAO: n No 8). Шкала баров 200 (верхний) и 100 (нижний) мкм, соответственно. 0,05. Значения горизонтальной оси диаграмм представляют 0,2, 0,4 и 0,6 мм, удаленных от головы зрительного нерва (0), которая была обнаружена зеленой линией. Данные были проанализированы с помощью двухотверной ANOVA следуют Bonferroni пост-специальный тест. Диаграммы паука были представлены как средние ± стандартного отклонения. NFL, INL, ONL и ELM являются слоем нервного волокна, внутренним ядерным слоем, внешним ядерным слоем и внешней ограничивающей мембраной, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: Перфузия крови сетчатки после tBCCAO. Репрезентативные изображения плоского монтажа сетчатки (с более высоким увеличением каждого изображения) после 2 мин циркуляции FITC-декстрана и количественные анализы показали, что полная перфузия наблюдается в обеих сетчатках у фиктивных мышей и левой сетчатке у мышей, управляемых tBCCAO. Тем не менее, правая сетчатка у мышей, управляемых tBCCAO, показала частичную перфузию крови. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Шкала баров составляет 800 и 400 мкм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 2: Выражение гипоксии-ответных генов после tBCCAO. Количественные анализы показали переходное увеличение экспрессии Bnip3 mRNA в правой сетчатке со статистической значимостью через 12 часов после tBCCAO. Выражение Эпо мРНК показало растущую тенденцию в правой сетчатке в течение 24 часов после tBCCAO, хотя его значения не были существенно отличаются по сравнению с фиктивной правой сетчаткой. 0,01. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 3: Визуальная функция в левом глазу после tBCCAO. Количественные анализы показали, что в левом глазу не произошло никаких изменений амплитуды а- и b-волн (фиктивно: n No 5, tBCCAO: n No 6). Пзгт; 0,05. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 4: Показатели выживаемости после tBCCAO в C57BL6 и BALB. Кривые выживаемости Каплан-Мейера показали, что почти все мыши погибли в течение 3 дней после tBCCAO у мышей C57BL6. Когда дело доходит до мышей BALB, более длительное время зажима в tBCCAO вызывает внезапную и тяжелую смерть животных (выживаемость в день 7, 20 сек: 10%, 10 сек: 20%, 2 сек: 81%, и 0 сек: 95%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 5: стабилизация HIF-1 после одностороннего ЦАО. Репрезентативный иммунобло и количественный анализ (фиктивный: n No 3, односторонний ЦАО: n No 3) для HIF-1 и β-Actin показали, что HIF-1 не стабилизировался в сетчатке через 3 часа после одностороннего CCAO. Пзгт; 0,05. Данные были проанализированы с помощью студенческого t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 6: Тяжелое веко опускается после tBCCAO с длинным временем зажима. 10 секунд tBCCAO индуцированных тяжелое опущение век, который был оценен по 4-очковой рейтинговой шкале: 1 - нет опустив, 2 - мягкий опустив (50%), 3 - тяжелое опущение (более 50%), и 4 - тяжелое опущение с глазной разрядкой, как описано на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Авторов нечего раскрывать.