Представлен метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией легких, сохраняющих расположение клеток в дыхательных путях, альвеолах и интерстиции для структурно-функционального анализа. Постоянное давление в дыхательных путях поддерживается с помощью воздушно-инфляционной камеры, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек. Легкие обрабатываются для гистологических исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Воздушная инфляция мышиных легких с сосудистой перфузией-фиксацией
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гистология легких часто используется для исследования вклада, обеспечиваемого клетками воздушного пространства во время гомеостаза легких и патогенеза заболеваний. Однако широко используемые методы фиксации на основе инстилляции могут вытеснять клетки воздушного пространства и слизь в конечные дыхательные пути и могут изменять морфологию тканей. Для сравнения, методы фиксации сосудов превосходят в сохранении местоположения и морфологии клеток в воздушном пространстве и слизистой оболочки. Однако, если одновременно не применяется положительное давление в дыхательных путях, области легких могут коллапсировать, а капилляры могут выпячиваться в альвеолярные пространства, что приводит к искажению анатомии легких. Здесь мы описываем недорогой метод воздушной инфляции во время сосудистой перфузии-фиксации для сохранения морфологии и расположения дыхательных путей и альвеолярных клеток и интерстиций в легких мышей для последующих гистологических исследований. Постоянное давление воздуха подается в легкие через трахею из герметичной, заполненной воздухом камеры, которая поддерживает давление через регулируемую колонку жидкости, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек.
Введение
Гистология легких представляет собой золотой стандарт для оценки архитектуры легких во время здоровья и болезни и является одним из наиболее часто используемых инструментов исследователямилегких1. Одним из наиболее критических аспектов данной методики является правильная изоляция и сохранение легочной ткани, так как вариабельность на этом этапе может привести к ухудшению качества тканей и ошибочным результатам1,2,3. У живых животных объем легких определяется балансом между внутренней упругой отдачей легкого и внешними силами, передаваемыми от грудной с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального еврейского здравоохранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол состоит из трех компонентов. Первый компонент детализирует конструкцию воздушного накачки с перфузионным/фиксаторным оборудованием. Во втором разделе описывается, как настроить оборудование для эксперимента. В заключительном разделе описано, как подготовить животное и провести эксперимент.
1. Конструкция водотолщавого аппарата(рисунок 1В)
- Снимите плунжер со скользящего наконечника шп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В неповрежденной грудной клетке легкие удерживаются открытыми внешними силами, приложенными стенкой грудной клетки через плевральное пространство6,14. При введении диафрагмы во время рассечения целостность плеврального пространства упраздняется и легкие должны разрушиться(рисунок 2А,2В). Для повторного расширения легких проводится надув воздуха. В качестве первого шага применяется 25 см давления воды для обеспечения .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя обычно используются, методы фиксации на основе интратрахеи вытесняют лейкоциты из дыхательных путей и могут изменить нормальную архитектуру легких. Метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией, который предусмотрен в данном протоколе, преодолевает эти подводные камни и более точно сохраняет анатомию легких. Ключи к получению высококачественной ткани из метода перфузионно-фиксации сосудов включают тщательный мониторинг давления надувания воздуха, предотвращение утечек воздуха и обеспечение адекватной пер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансировалась грантами Национального института сердца, легких и крови (NHLBI) HL140039 и HL130938. Авторы хотели бы поблагодарить Шеннон Хотт и Джазалле МакКлендон за их технический опыт.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 00117XF-Запорный кран 1 ход 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Артикул # EW-00117-XF | Запорный кран |
| BD 60 мл шприц, скользящий наконечник | BD | 309654 | Шприц, используемый для создания водяного столба |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Игла для перфузии/фиксации сосудов |
| Женская Луэр Нить Стиль Панельное крепление 1/4-28 UNF для мужчины | Luer Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Женский Луэр |
| Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи | Sigma-Aldrich | H3393 | раствор гепарина. |
| Адаптер Luer-Stub BD Intramedic 20 калибра | BD Biosciences | 427564 | Адаптер Luer-Stub Male |
| Luer (2) на внутренний Тройник с резьбой Luer | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Прозрачный пластик Трубка из ПВХ | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Трубка |
| параформальдегид водный раствор - 32% | Электронная микроскопия Sciences | 15714-S | Фиксирующий раствор. Разбавленный до 4% фосфатным буферным физиологическим раствором |
| Permatex Ultra Blue Многоцелевой RTV Силиконовый | Permatex | 81724 | Силиконовый прокладчик для герметичного уплотнения камер |
| Фосфатно-солевой буфер, 1x Без кальция и магния | Corning | 21-040-CV | Бутылка, используемая для создания камеры воздушного надувания, и буфер, используемый для гепарина и фиксирующих растворов |
| Sterilite Ultra Seal 16,0 чашек прямоугольный контейнер для хранения продуктов | Sterilite | 0342 | Контейнер для обработки животных |
Ссылки
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bach....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
