В данном исследовании представлена высоковоспроизводимая крупная животная модель почечной ишемии-реперфузионного повреждения у свиней с использованием временной чрескожной двусторонней баллонно-катетерной окклюзии почечных артерий в течение 60 мин и реперфузии в течение 24 ч.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель крупного животного для острого повреждения почек путем временной двусторонней окклюзии почечной артерии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Острое повреждение почек (ОПН) связано с более высоким риском заболеваемости и смертности после операции. Ишемия-реперфузионный травма (ИРИ) является наиболее распространенной причиной ОКИ. Чтобы имитировать этот клинический сценарий, это исследование представляет высоковоспроизводимую модель почечного ИРИ у свиней на больших животных с использованием временной чрескожной двусторонней баллонно-катетерной окклюзии почечных артерий. Почечные артерии закупоривают в течение 60 мин путем введения баллонных катетеров через бедренную и сонную артерии и продвижения их в проксимальную часть артерий. Йодированный контраст вводится в аорту для оценки любого помутнения почечных сосудов и подтверждения успеха окклюзии артерии. Это дополнительно подтверждается сглаждение формы импульсного сигнала на кончике баллонных катетеров. Баллоны сдувают и удаляют через 60 мин двусторонней окклюзии почечной артерии, а животным дают восстановиться в течение 24 ч. В конце исследования значительно повышается креатинин плазмы и азот мочевины крови, при этом сКФ и диуреза значительно снижаются. Потребность в йодированном контрасте минимальна и не влияет на функцию почек. Двусторонняя окклюзия почечной артерии лучше имитирует клинический сценарий периоперационной почечной гипоперфузии, а чрескожный подход минимизирует влияние воспалительной реакции и риск заражения, наблюдаемый при открытом подходе, таком как лапаротомия. Способность создавать и воспроизводить эту клинически релевантную модель свиней облегчает клинический перевод на людей.
Введение
Острое повреждение почек (ОПН) является часто диагностируемым состоянием среди хирургических пациентов, связанным со значительной заболеваемостью и смертностью1,2. Имеющиеся данные показывают, что ОКИ может поражать даже половину всех госпитализированных пациентов во всем мире и приводит к 50% смертности у пациентов в отделении интенсивнойтерапии 1,3. Несмотря на высокую распространенность, текущая терапия ОКИ по-прежнему ограничена профилактическими стратегиями, такими как управление жидкостью и диализ. Поэтому существует постоянный интерес к изучению альтернативных методов лечения ОКИ4,5,6.
ОПН обычно классифицируется на преретинальный, внутренний и пост-почечный на основе его этиологии4,5,6. Большинство хирургических пациентов с ОКИ связаны с препочечниками из-за гиповолемии, что приводит к ишемии-реперфузионного повреждения (ИРИ) почек2. Клинически диуреза уменьшается, а уровень креатинина увеличивается из-за снижения функции почек. Почка является органом с высокой скоростью метаболизма и восприимчива к ишемии. Высоковоспроизводимая модель почечной ИРИ на крупных животных необходима для получения лучшего представления о патофизиологии ОПН и ее потенциальных терапевтических подходах5.
Для имитации клинического сценария периоперфузии почек периоперативно считается подходящей модель двусторонней окклюзии почечной артерии. Ранее описанные модели, влекущие за собой одностороннюю окклюзию почечной артерии с резекцией контралатеральной почки или без нее, не обеспечивают достаточной клинической применимости7,8. Хотя этих моделей достаточно для возникновения ОКИ, они не похожи на реальные клинические сценарии ни с точки зрения типа, ни продолжительности травмы.
Целью данной работы является представление свиной модели чрескожной двусторонней временной окклюзии почечных артерий баллонно-катетерной окклюзией при ангиографии. Двусторонняя окклюзия почечной артерии имитирует клинический сценарий почечной гипоперфузии с последующим удалением баллона для реперфузии9,10. Описаны технические этапы, включая катетеризацию, катетерное руководство, ангиографию и гемодинамический мониторинг. Этот метод не только позволяет осуществлять строго контролируемую и воспроизводимую окклюзию почечных артерий, но и чрескожный подход минимизирует влияние воспалительной реакции, ограничивая количество оскорблений для организма по сравнению с открытым подходом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследования in vivo были проведены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения по уходу за животными и их использованию и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Бостонской детской больницы (Протокол 18-06-3715). Все животные получали гуманую заботу в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию. На рисунке 1 показана временная шкала, включая анестезию, хирургическую подготовку и временные точки для измерения первичных результатов этого исследования.
1. Индукция, анестезия и интубация
- Для предотвращения ненужного стресса и дискомфорта успокойте свиней внутримышечной инъекцией смеси тилитамина/золазепама 4-6 мг/кг и ксилазина 1,1-2,2 мг/кг, а также изофлурана 3% с помощью маски для лица.
- Каннулировать ушную вену для получения венозного доступа с помощью канюли 20 г внутривенно после дезинфекции области 95% этанолом. Начинают поддерживающую инфузию (0,9% NaCl при 5 мл/кг/ч).
- Интубировать свинью эндотрахеальной трубкой (размер 7 для свиней весом 40-50 кг) после подтверждения адекватности анестезии. Выполняют баллон-вентиляцию с частотой 12 вдохов/мин и транспортируют свинью в операционную.
- Поместите животное на операционный стол в лежачем положении. Немедленно запустите механическую вентиляцию с положительным давлением с FiO2 0,50, приливным объемом 10 мл / кг и частотой 12 вдохов / мин при непрерывной капнографии.
- Поместите пульсоксиметр на ухо или нижнюю губу для непрерывного мониторинга.
- Поддерживайте нормотермию (37 °C) с помощью воздушной нагретой подушки.
- Для поддержания общей анестезии сохраняют введение изофлурана на уровне 0,5-4% через эндотрахеальную трубку. На протяжении всей процедуры непрерывно контролируйте ЭКГ, артериальное давление, температуру и капнографию для измерения глубины анестезии.
- Вставьте катетер Фолея, чтобы проверить состояние жидкости животного и контролировать выход мочи, собирая мочу в дренажный мешок.
ПРИМЕЧАНИЕ:Самки свиней предпочтительнее самцов из-за анатомических особенностей их уретры, что позволяет легче катетеризацию.
2. Хирургическая подготовка и сосудистый доступ
- Задрапировщик животного стерильным способом.
- Дезинфицируйте правую боковую область шеи, применяя бетадин, а затем 95% этанол в течение 3 раз.
- Выполняют разрезание для катетеризации правой сонной артерии и правой яремной веной. Втягивайте грудино-клитоплоидную мышцу латерально и рассекают ее вниз до правой сонной артерии и правой яремной вены.
- Вставьте 5F ангиографическую оболочку как в артерию, так и в вену. Закрепите его шелковым швом 2-0.
- Вставьте оболочку ангиографии 5F по методике Зельдингера в левую бедренную артерию.
- Для выполнения техники Селдингера проколоть бедренную артерию используют полую иглу. Вставьте мягкий наконечник направляющей проволоки через просвет и продвините его в бедренную артерию.
- Держите направляющую рукой зажатой рукой, снимая иглу. Пропустите ангиографическую оболочку через направляющую проволоку в бедренную артерию и выньте направляющую проволоку. При необходимости используйте ультразвуковое руководство.
3. Индукция почечной ишемии-реперфузионного повреждения
- Вводят 200 МЕ/кг гепарина натрия внутривенно для достижения системной антикоагуляции (целевое время свертывания крови (ACT) > 300 с).
- Выполните ангиографию путем введения йодированного контрастного вещества под рентгеноскопией для выявления почечных артерий.
ПРИМЕЧАНИЕ:Чтобы снизить риск контрастно-индуцированной нефротоксичности, разбавьте йодированное контрастное вещество в растворе 1:1 с нормальным физиологическим раствором. Сравняйте дозировку для всех животных, чтобы обеспечить эквивалентное дозирование. - Определите почечные артерии, вручную выдвините направляющую проволоку в направляющий катетер.
- Расположите направляющий катетер 5F JL4 в левой почечной артерии через правую сонную артерию(рисунок 1A).
- Расположите второй направляющий катетер 5F JL4 в правой почечной артерии через левую бедренную артерию(рисунок 1А).
- Используйте направляющие провода для направления чрескожного транслюминальной ангиопластики (ПТА) дилатационного катетера 5F в каждую почечную артерию.
ПРИМЕЧАНИЕ:Предпочтительно располагать баллон на проксимальной почечной артерии таким образом, чтобы после раздувания баллона не оставалось никаких ветвей или коллатерали почечной артерии. - Поместите каждый баллонный катетер на место и подключите напорную линию к каждому катетеру.
- Проверьте наличие сигналов артериального пульса в мониторе давления, чтобы обеспечить правильное позиционирование катетера.
- Надувайте каждый воздушный шар и стремитесь к давлению примерно 2,5 атм внутри воздушногошара (рисунок 1B).
- Для подтверждения прекращения притока крови к почкам наблюдают уплощение пульсовой формы на кончике баллонного катетера.
- Вводят йодированное контрастное вещество (разведение 1:1) и проверяют на помутнение почечных сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно заполнение баллона йодированным контрастным веществом для визуализации надутого баллона. Однако этот метод не так чувствителен, как уплощение пульсовой волны для подтверждения окклюзии почечных артерий. - После 60 мин окклюзии осторожно сдуть и удалить баллонные катетеры из почечных артерий.
- Выполнить ангиографию (с использованием разбавленного контрастного вещества 1:1) для подтверждения проходимости почечной артерии и установления реперфузии почек(рисунок 1С).
- Удалите оболочку ангиографии 5F из левой бедренной артерии.
- Применяют твердое давление в месте катетеризации в течение 30 мин.
- Обратить вспять эффект гепарина путем введения протамина (3 мг/кг) до нормализации ACT.
- Для отбора проб мочи в послеоперационный период прикрепите трубку к катетеру Фоли шелковым швом 2-0 с помощью прерванного шва на коже.
- Оставьте ангиографические оболочки в правой сонной артерии и правой яремной вене на месте и закрепите их шелковым швом 2-0, используя прерванный стежок, чтобы обеспечить забор крови на протяжении всего исследования.
- Закройте разрез шеи шелковым швом 2-0 с помощью непрерывного шва в 2 слоя.
- Вводите бупивакаин (3 мг/кг) в месте разреза, чтобы свести к минимуму боль.
- Продолжайте гидратировать животное с 0,9% NaCl при 5 мл / кг / ч в общей сложности 2 ч после окончания ишемии.
- Поместите фентаниловый пластырь (25-50 мкг/ч) на спину животного, чтобы свести к минимуму послеоперационную боль.
- Ввести внутримышечную инъекцию бупренорфина (0,005-0,1 мг/кг) для минимизации послеоперационной боли.
- Следите за животным и поддерживайте его на механической вентиляции до пробуждения.
4. Восстановление животных
- После пробуждения разместяют животное в помещении с контролируемой температурой.
- Продолжайте поворачивать животное с одной боковой стороны на другую, пока оно не придет в полное сознание и способность к амбулированию.
- Обеспечьте водой и пищей ad libitum.
5. Функциональная оценка
- Соберите образцы крови и мочи в соответствии с желаемым протоколом.
ПРИМЕЧАНИЕ:В этом исследовании были обозначены следующие временные точки: исходный уровень (1 ч после начала протокола гидратации и до окклюзии почечных артерий), конец ишемии и реперфузия (2 ч, 6 ч, 24 ч). - Соберите образцы артериальной и венозной крови. Храните их в литий-гепариновом или вакутайнах с эдтаиновым покрытием для последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ:Забор крови непосредственно из катетеров в сонной артерии и яремной вене. - Соберите образцы мочи из катетера Фоли и храните их в пробирках по 15 мл для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ:Соберите мочу из дренажного мешка, подключенного к катетеру Фоли. - Для определения диуреза опорожняют дренажный мешок и собирают мочу в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ:В течение 6-часовой точки, в которой дренажный мешок не подключен к катетеру Фолея, закройте трубку, подключенную к катетеру Фоли, на 30 минут, а затем соберите мочу с помощью шприца 60 мл для определения диуреза.
6. Эвтаназия
- После окончания периода реперфузии выполните анестезию и контролируйте, как описано выше.
- Продолжайте гидратацию с 0,9% NaCl при 5 мл/кг/ч.
- Используйте артериальные и венозные катетеры для забора крови и катетер Фолея для определения диуреза. Соберите окончательные образцы крови и мочи и рассчитайте выход мочи.
- Выполните 15-сантиметровый разрез лапаротомии средней линии с использованием лезвия размером 10 от кифоидного до среднего таза.
- Используйте прямой боковой втягиватель для втягивки кожи живота.
- Рассеките боковые перитонеальные прикрепления брюшной стенки, чтобы обнажить правое и левое забрюшинное.
- Выявляют и тупо рассеклают как почечные артерии, так и вены.
- Обжигайте как почечные артерии, так и вены шелковым швом 2-0 и выполняйте двустороннюю нефрэктомию для сбора образцов целых тканей для гистологического и метаболического анализа.
- Усыпить животное предпочтительным методом эвтаназии (например, экссангинация, пентобарбитал)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Функциональный анализ
Репрезентативные результаты этого исследования получены от 6 животных, и показанные данные являются средними ± стандартной погрешности среднего значения. Функция почек оценивается путем определения диуреза, оценки скорости клубочковой фильтрации (eGFR), креатина плазмы и азота мочевины крови (BUN). Биомаркеры функции почек оценивают с помощью портативного химического анализатора. сКФ рассчитывается по следующей формуле: сКФ =1,879 × BW1,092/PCr0,6
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ОКИ является распространенным клиническим расстройством, затрагивающим до 50% госпитализированных взрослых пациентов во всем мире6,12. Клинически релевантная животная модель необходима для дальнейшего изучения патофизиологии заболевания и потенциальных терапевтических целей. Хотя существует несколько мышиных моделей, воспроизводящих ОКИ, они не полностью имитируют свои соответствующие клинические сценарии и анатомию почки человека. В этом исследовании предлагаетс...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Артура Неддера за его помощь и руководство. Эта работа была поддержана премией Ричарда А. и Сьюзан Ф. Смит за инновации, Майклом Б. Кляйном и семьей, Фондом семьи Сидман, Благотворительным фондом Майкла Б. Рукина, Благотворительным исследовательским фондом Кеннета С. Гриффина и Бостонским инвестиционным советом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,9% натрия хлорид для инъекций, usp, 100 мл viaflex пластиковый контейнер | Baxter | 2B1302 | Для гидратации животных |
| Агент контраст 100,0 мл для инъекций btl ioversal 74% | CARDINAL HEALTH | 133311 | Для визуализации сосудистой сети |
| Bard Bardia Closed System Мочевой дренажный мешок | BARD Inc | 802001 | Для сбора мочи |
| BD Vacutainer K2 EDTA | BD | 367841 | Для хранения образцов крови |
| BD Vacutainer Lithium Heparin | BD | 366667 | Для хранения образцов крови |
| Betadine | Henry Schein | 6906950 | Для дезинфекции кожи |
| Bookwalker retractor | Codman | Для ретракции | |
| кожи Bupivacaine 0,25% | Hospira Вводите | в место разреза для обезболивания | |
| Бупренорфин SR | Zoo Pharm | 10 мг/мл флакон, Доза: 0,2 мг/кг SC | |
| Катетеризационная ангиография 5,0 Fr x100,0 см 0,038 в JR4 | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 7523-21 | Для идентификации почечных артерий |
| Манжета эндотрахеальной трубки | Emdamed | Для создания безопасных дыхательных путей на время операции | |
| EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Монитор насыщения кислородом | GE Healthcare Madison WI | Для контроля насыщения кислородом | |
| Encore 26 инфлятор | BOSTON SCIENTIFIC | 710113 | Для надувания баллонных катетеров |
| Этанол 95% (Этиловый спирт) | Henry Schein | Для дезинфекции кожи | |
| Фентаниловый пластырь | Mylan | Доза: 25-50 мкг/ч, TD | |
| Gold с силиконовым покрытием Foley | TELEFLEX MEDICAL INC | Для мочи сбор | |
| Гепарин натрия | LEO Pharma A/S | Доза: 200 МЕ/кг IV | |
| i33 | Phillips | Используйте ультразвуковое руководство для катетеризации бедренной кости при необходимости | |
| Диагностический проводник Inqwire - 0,035" (0,89 мм) - 260 см (102") - 1,5 мм j-tip | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 6609-33 | Для направления баллонных катетеров к почечным артериям |
| Катетер для внутривенного введения, размер 20 калибра | Santa Cruz Biotechnology | Inc SC-360097 | Для введения жидкости |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 21283620 | Дозировка: 3%, INH |
| Metzenbaum тупой изогнутый 14,5 см - 5(3/4)" | Rudolf Medical | RU-1311-14M | Для рассечения и разрезания тканей |
| Неонатальный одноразовый набор датчиков с устройством промывки 30 мл/ч и двойными 4-х ходовыми запорными кранами для непрерывного мониторинга | Argon Medical | 041588505A | Для измерения давления |
| Powerflex pro PTA дилатационный катетер 6 x 20 мм - длина вала (135 см) | CARDINAL HEALTH | 4400602X | Для окклюзии почечных артерий |
| Линии контроля давления mll/mll - 12" прозрачные, mll/mll | Smiths Medical | B1571/MX571 | Для измерения давления |
| Процедурный пакет | Molnlycke Health Care | 97027809 | Хирургическая простыня, марлевые салфетки, шприцы, стакан и т.д |
| Протамин | Henry Schein | 1044148 | Для реверсирования |
| гепаринаЛезвие скальпеля - размер #10 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-010 | Для разрезов кожи |
| Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr | strl Peoplesoft | 1550 | Для соединения трубок |
| Прямой боковой ретрактор | Codman | Для втягивания кожи | |
| Шов perma hnd 18in 2-0 тесьма шелк blk | CARDINAL HEALTH 1 | A185H | Для наложения швов в месте разреза и закрепления катетеры |
| Шприц контрастный инъекционный 10мл фиксированный мужской люэр красный | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | MSS111-R | Для введения контрастного вещества |
| Шприц медицинский 60мл ll plst strl ltx free disp | CARDINAL HEALTH 1 | BF309653 | Для сбора мочи и промывания ангиокаты |
| Тилзолан (тилетамин/золазепам) | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 07-893-1467 | Доза: 4-6 мг/кг, в/м |
| ксилазин | Путни, ИНК | Доза: 1,1-2,2 мг/кг, в/м |
Ссылки
- Ali Pour, P., Kenney, M. C., Kheradvar, A. Bioenergetics consequences of mitochondrial transplantation in cardiomyocytes. Journal of the American Heart Association. 9 (7), 014501(2020).
- Giraud, S., Favreau, F., Chatauret, N., Thuillier, R., Maiga, S., Hauet, T. Contribution of large pig for renal ischemia-reperfusion and transplantation studies: The Preclinical Model. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 14(2011).
- Amdisen, C., et al. Testing Danegaptide effects on kidney function after ischemia/reperfusion injury in a new porcine two week model. PLoS ONE. 11 (10), 1-13 (2016).
- Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 13 (10), 629-646 (2017).
- Bonventre, J. V., Weinberg, J. M. Recent advances in the pathophysiology of ischemic acute renal failure. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (8), 2199-2210 (2003).
- Case, J., Khan, S., Khalid, R., Khan, A. Epidemiology of Acute Kidney Injury in the Intensive Care Unit. Critical Care Research and Practice. 2013, 9(2013).
- Jabbari, H., et al. Mitochondrial transplantation ameliorates ischemia/reperfusion-induced kidney injury in rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165809(2020).
- Malagrino, P. A., et al. Catheter-based induction of renal ischemia/reperfusion in swine: Description of an experimental model. Physiological Reports. 2 (9), 1-13 (2014).
- Freeman, R. V., et al. Nephropathy requiring dialysis after percutaneous coronary intervention and the critical role of an adjusted contrast dose. American Journal of Cardiology. 90 (10), 1068-1073 (2002).
- Gasthuys, E., et al. Postnatal maturation of the glomerular filtration rate in conventional growing piglets as potential juvenile animal model for preclinical pharmaceutical research. Frontiers in Pharmacology. 8 (431), 1-7 (2017).
- Doulamis, I. P., et al. Mitochondrial transplantation by intra-arterial injection for acute kidney injury. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 319 (3), 403-413 (2020).
- Rewa, O., Bagshaw, S. M. Acute kidney injury-epidemiology, outcomes and economics. Nature Reviews Nephrology. 10 (4), 193-207 (2014).
- Grossini, E., et al. Levosimendan Protection against Kidney Ischemia/Reperfusion Injuries in Anesthetized Pigs. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (2), 376-388 (2012).
- Laskey, W. K., et al. Volume-to-creatinine clearance ratio. A pharmacokinetically based risk factor for prediction of early creatinine increase after percutaneous coronary intervention. Journal of the American College of Cardiology. 50 (7), 584-590 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
