Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация 3D-органоидов цельных легких из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для моделирования биологии и болезней развития легких

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62456

⸱

12 апреля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 3Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

В этой статье

Краткое содержание

В статье описана пошаговая направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в трехмерные цельные органоиды легких, содержащие как проксимальные, так и дистальные эпителиальные клетки легких вместе с мезенхимой.

Аннотация

Развитие и заболевания легких человека было трудно изучать из-за отсутствия биологически значимых модельных систем in vitro . Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) могут быть дифференцированы поэтапно в 3D-многоклеточные органоиды легких, состоящие как из эпителиальных, так и из мезенхимальных клеточных популяций. Мы резюмируем эмбриональные сигналы развития, временно вводя различные факторы роста и небольшие молекулы для эффективной генерации окончательной энтодермы, передней передней энтодермы передней части и впоследствии клеток-предшественников легких. Эти клетки затем внедряются в матричную среду с пониженным фактором роста (СКФ), что позволяет им спонтанно развиваться в 3D-органоиды легких в ответ на внешние факторы роста. Эти целые легкие органоиды (WLO) проходят ранние стадии развития легких, включая ветвящийся морфогенез и созревание после воздействия дексаметазона, циклического AMP и изобутилксантина. VLO обладают эпителиальными клетками дыхательных путей, экспрессирующими маркеры KRT5 (базальный), SCGB3A2 (клубный) и MUC5AC (кубок), а также альвеолярными эпителиальными клетками, экспрессирующими HOPX (альвеолярный тип I) и SP-C (альвеолярный тип II). Мезенхимальные клетки также присутствуют, включая актин гладких мышц (СМА) и рецептор фактора роста А,, полученный из тромбоцитов (PDGFRα). Полученные из iPSC VLO могут поддерживаться в условиях 3D-культуры в течение многих месяцев и могут быть отсортированы для поверхностных маркеров для очистки определенной клеточной популяции. Полученные из iPSC WLO также могут быть использованы для изучения развития легких человека, включая передачу сигналов между эпителием легких и мезенхимой, для моделирования генетических мутаций функции и развития клеток легких человека и для определения цитотоксичности инфекционных агентов.

Введение

Легкое является сложным, гетерогенным, динамическим органом, который развивается в шесть различных стадий - эмбриональное, псевдогландулярное, канальцевое, мешковидное, альвеолярное и микрососудистое созревание1,2. Последние две фазы происходят до и послеродово в развитии человека, в то время как первые четыре стадии происходят исключительно во время развития плода, если не происходят преждевременные роды3. Эмбриональная фаза начинается в эндодермальном зародышевом слое и завершается бутонизацией трахеи и почек легких. Развитие легких происходит частично через передачу сигналов между эпителиальными и мезенхимальными клетками4. Эти взаимодействия приводят к ветвлению легких, пролиферации, определению клеточной судьбы и клеточной дифференцировке развивающегося легкого. Легкое делится на проводящие зоны (трахея к терминальным бронхиолам) и дыхательные зоны (дыхательные бронхиолы к альвеолам). Каждая зона содержит уникальные типы эпителиальных клеток; включая базальные, секреторные, реснитчатые, щеточные, нейроэндокринные и ионоцитарные клетки в проводящих дыхательных путях5, за которыми следуют альвеолярные клетки I и II типа в респираторном эпителии6. Многое до сих пор неизвестно о развитии и реакции на повреждение различных типов клеток. Производные от iPSC модели органоидов легких позволяют изучать механизмы, которые управляют развитием легких человека, влияние генетических мутаций на легочную функцию и реакцию эпителия и мезенхимы на инфекционные агенты без необходимости первичной легочной ткани человека.

Маркеры, соответствующие различным стадиям эмбриональной дифференцировки, включают CXCR4, cKit, FOXA2 и SOX17 для окончательной энтодермы (DE)7, FOXA2, TBX1 и SOX2 для передней эндодермы передней части (AFE)8 и NKX2-1 для ранних клеток-предшественников легких9. При эмбриональном развитии легких передняя кишка делится на дорсальный пищевод и вентральную трахею. Почки правого и левого легких выглядят как два независимых выхода вокруг почка трахеи10. Во время ветвящегося морфогенеза мезенхима, окружающая эпителий, производит эластичную ткань, гладкую мускулатуру, хрящи и сосудистую систему11. Взаимодействие между эпителием и мезенхимой имеет важное значение для нормального развития легких. Это включает в себя секрецию FGF1012 мезенхимой и SHH13 , производимую эпителием.

Здесь мы описываем протокол направленной дифференциации hiPSCs в трехмерные (3D) целые органоиды легких (WLO). Хотя существуют аналогичные подходы, которые включают выделение клеток-предшественников легких путем сортировки на стадии LPC для получения альвеолярных органоидов14,15 (дистальных) органоидов или органоидов дыхательных путей16 (проксимальных) или генерируют вентрально-передние сфероиды передней скаты, чтобы сделать органоиды легких человека, экспрессирующие альвеолярные клетки и мезенхимальные маркеры и органоиды предшественников почек17 , сила этого метода заключается в включении как эпителиальных, так и мезенхимальных типов клеток легких для моделирования и оркестрации морфогенеза, созревания и расширения легких in vitro.

Этот протокол использует малые молекулы и факторы роста для направления дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток через окончательную энтодерму, переднюю эндодерму передней части и клетки-предшественники легких. Эти клетки затем индуцируются в 3D-органоиды целых легких через важные этапы развития, включая ветвление и созревание. Резюме протокола дифференцировки показано на рисунке 1а с репрезентативными изображениями яркого поля эндодермальной и органоидной дифференцировки, показанными на рисунке 1b. На рисунке 1c,d показаны детали экспрессии генов эндодермальной дифференцировки, а также экспрессия генов как проксимальной, так и дистальной популяций эпителиальных клеток легких после завершения дифференцировки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол исследования был одобрен Советом по институциональному обзору Программы защиты исследований человека UCSD (181180).

1. Окончательная индукция энтодермы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (День 1 - 3)

  1. Медленно оттаивайте матричную среду с пониженным фактором роста (СКФ)-базальной мембраной (БМ) на льду за 30 минут до использования. В холодной смеси DMEM/F12 разбавляют матричную среду СКФ BM 1:1 таким образом, чтобы она составляла 50% этой среды. Поместите наконечники пипеток P1000 в морозильную камеру для охлаждения перед использованием.
  2. Покрыть каждую скважину 12-луночной пластины 500 мкл 50% ГКФ-базальной мембранной матричной среды, приготовленной в ледяном DMEM/F12. После того, как нужное количество лунок покрыто, удалите любую избыточную смесь среды и/или пузырьки из скважин и поместите пластину на лед или холодильник при 4 °C в течение 20 мин для установки. Затем переместите пластину в инкубатор при 37 °C на ночь, чтобы гелеобразную и высушенную.
  3. Как только hiPSCs достигнут 70-90% слияния, добавьте 10 мкМ ингибитора Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632 за час до диссоциации. Аспирировать со среды и промыть один раз фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS). Диссоциируют hiPSCs путем добавления среды отсоединения клеток (0,5 мл / лунка 12-луночной пластины) и инкубируют в течение 20 мин при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе.
  4. Извлеките пластины из инкубатора и добавьте в лунки 0,5 мл/12 лунки среды для пропускания стволовых клеток (табл. 1); осторожно тритурировать клетки с помощью наконечника P1000 для получения одноэлементной суспензии. Перенос диссоциированных клеток в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл; центрифуга в течение 5 мин при 300 х г.
  5. Аспирировать со среды и повторно суспендировать клеточную гранулу 1 мл среды mTeSR Plus, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ (Y-27632). Выполните подсчет ячеек. Добавьте 2,0 x 105 hiPSCs в 1 мл mTeSR, дополненного ингибитором ROCK Y-27632 на лунку 12-луночной пластины со средним покрытием СКФ-базальной мембраны. Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Число посева ячеек должно быть оптимизировано для каждой строки ячейки. Через 24 ч после нанесения покрытия скважины должны быть на 50%-70% сливающимися.
  6. На 1-й день аспирировать из mTeSR Plus и добавить индукционную среду Definitive Endoderm (DE) (таблица 1), дополненную 100 нг/мл человеческого активина A и 5 мкМ ингибитора GSK3β/активатора Wnt CHIR99021.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DE-среда с ингибитором GSK3β/активатором Wnt CHIR99021 должна быть удалена в течение 20-24 ч индукции DE 1-го дня для успешной дифференцировки.
  7. На 2-й и 3-й день переведите на индукционную среду DE, дополненную 100 нг/мл только активина А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация DE не должна превышать в общей сложности 72 ч, иначе эффективность снизится. На 4 день, если наблюдается отмирание крупных клеток, уменьшают общее время воздействия среды DE на 6-12 ч.
  8. Для анализа эффективности DE подтвердите более 90% экспрессии CXCR4 и/или cKit с помощью проточной цитометрии или иммунофлуоресцентного анализа FOXA2 и/или SOX17 (рисунок 2a).

2. Индукция передней эндодермы передней передней кости (AFE) (День 4 - 6)

  1. На 4-й день замените среду на бессывороточную базальную среду (SFBM) (таблица 1), дополненную 10 мкМ SB431542 и 2 мкМ дорсоморфина для индукции АФЭ. Меняйте носитель AFE ежедневно в течение 3 дней (день 4, день 5 и день 6).
  2. Чтобы проанализировать эффективность AFE, подтвердите надежную экспрессию SOX2, TBX1 и FOXA2 с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (рисунок 2b).

3. Дифференцировка клеток-предшественников легких (LPC) (день 7 - 16)

  1. На 7 день разморозьте СКФ-базальную мембранную матричную среду на льду. Аспирируйте от носителя AFE и хорошо промойте 1x PBS. Добавить 1 мл раствора для отсоединения клеток и инкубировать в течение 10 мин при 37 °C.
  2. Добавьте 1 мл закалочной среды (2% FBS в DMEM/F12) в скважины, содержащие раствор для отсоединения клеток. Храните ячейки в виде агрегатов, мягко испешивая вверх и вниз. Убедитесь, что все клетки смещены и перенесены в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г.
  3. Удаляют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в закалочной среде, дополненной 10 нг/мл человеческого рекомбинантного костного морфогенного белка-4 (BMP4), 0,1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА), 3 мкМ ингибитора GSK3β/активатора Wnt CHIR99021 и 10 мкМ ингибитора горных пород Y-27632.
  4. Выполните подсчет ячеек. Добавьте 2,5 х 105 клеток к 100 мкл холодной матричной среды ГКФ-базальной мембраны, хорошо перемешайте и поместите каплю в лунку из 12-луночной пластины. Инкубируют пластину при 37 °C в течение 30-60 мин, чтобы дать среде полимеризоваться. Добавьте 1 мл среды LPC, дополненной 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 на лунку, гарантируя, что капля среды полностью погружена и инкубируется при 37 °C в течение ночи.
  5. На 8-й день, через 24 ч после индукции LPC, измените среду LPC для удаления ингибитора ROCK Y-27632. Меняйте среду LPC через день в общей сложности 9-11 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда становится желтой в течение 24 часов, меняйте среду каждый день.
  6. Для анализа эффективности LPC подтвердите надежную экспрессию внутриклеточного транскрипционного фактора NKX2-1 или выполните проточную цитометрию поверхностных маркеров CD47hi/CD26low15 или CPM18 (рисунок 2c). Грубо говоря, сфероиды LPC должны быть круглыми и прозрачными (рисунок 2c).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует продолжать дифференциацию органоидов легких, если эффективность NKX2-1 ниже 30%.

4.3D индукция органоидов легких (День 16 - 22)

  1. На 17 день разморозить на льду СКФ-базальную мембранную матричную среду. Аспирируйте индукционную среду LPC. Затем добавьте в скважину 2 мкг/мл диспазы (1 мл) и повторно суспендируйте смесь среды/диспазы пипеткой P1000. Инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Снова тритурировать смесь и инкубировать при 37 °C еще 15 мин.
  2. Перенесите диспазу и клетки в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл. Используйте охлажденный PBS (2-3 мл) для промывки скважины и повторного суспендирования смеси диспазы и клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г. Вручную удалите супернатант, стараясь не засыпать слой гранул среды/клетки. Повторите охлажденную промывку PBS и центрифугируйте коническую центрифужную трубку еще на 5 минут при 400 х г.
  3. Вручную удалите супернатант, а затем добавьте 2 мл диссоциационного раствора на основе трипсина в трубку конической центрифуги. Инкубировать при 37 °C в течение 12 мин.
  4. После инкубации повторно суспендируйте клетки с помощью наконечника пипетки P1000. Затем добавьте равный объем закалочной среды в трубку конической центрифуги и открутите вниз при 400 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в закалочной среде + 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная индукция органоидов легких происходит, когда клетки встроены в виде агрегатов, а не отдельных клеток, соответствующим образом корректируют пипетирование.
  5. Выполните подсчет ячеек. Рассчитайте объем, необходимый для получения 5,0-8,0 х 104 ячеек на скважину. Ячейка Aliquot LPC объединяется в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и центрифугу в течение 5 мин при 400 х г. Удалите избыток супернатанта, стараясь не перемешивать ячейку гранулы. Оставьте только 10 мкл остаточной среды.
  6. Повторно суспендировать клеточную гранулу в 200 мкл холодной матричной среды СКФ-базальной мембраны и добавить к мембранным вставкам клеточной культуры (диаметр 6,5 мм, пора 0,4 мкм, полиэфирная мембрана). Инкубировать пластину при 37 °C в течение 30-60 мин, чтобы дать возможность полимеризации матричной среды СКФ-базальной мембраны.
  7. Добавьте 1 мл 3D органоидной индукционной среды (таблица 1), дополненную фактором роста фибробластов-7 (FGF7) (10 нг/мл), FGF10 (10 нг/мл), ингибитором GSK3β/активатором Wnt CHIR (3 мкМ), эпидермальным фактором роста (EGF) (10 нг/мл) и 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 в базолатеральную камеру мембранной вставки. Меняйте среду через день в течение 6 дней.

5.3D Ветвление органоидов легких (День 23 - 28)

  1. На 23 день переход на 3D-ветвящуюся среду (таблица 1), дополненную FGF7 (10 нг/мл), FGF10 (10 нг/мл), ингибитором GSK3β/активатором Wnt CHIR99021 (3 мкМ), РА (0,1 мкМ), EGF (10 нг/мл) и фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) / плацентарным фактором роста (PlGF) (10 нг/мл). Меняйте среду через день в течение 6 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 6-й день дифференциации ветвления 3D должно быть несколько ветвящихся органоидов (рисунок 2).

6.3D созревание органоидов легких (29 - 34 день)

  1. На 29-й день переходят на 3D-среду созревания (таблица 1), которая такая же, как 3D-среда ветвления, но с добавлением дексаметазона (50 нМ), цАМФ (100 мкМ) и 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), ингибитора фосфодиэстеразы, также называемого изобутилксантином (100 мкМ). Меняйте среду через день в течение 6 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 24 ч после созревания 3D ветвящиеся органоиды должны расширяться и превращаться в прозрачные сферы.

7.3D Иммуноцитохимия органоидов легких

  1. Для 3D-анализа органоидов всего легкого зафиксируйте матричную среду СКФ-базальной мембраны в мембранных вставках с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 1 ч при 4 °C. Встраивается в парафиновый воск и монтируется на слайды в соответствии со стандартными опубликованными протоколами.
  2. Выполните извлечение антигена перед окрашиванием. Маркеры дыхательных путей включают KRT5, MUC5AC и SCGB3A2. Альвеолярные маркеры включают SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 и HOPX (рисунок 3).

8. Удаление целых органоидов легких из матричной среды СКФ-базальной мембраны для прохождения, FACS или криоконсервации

  1. Чтобы диссоциировать органоиды из матричной среды СКФ-базальной мембраны, удаляют среду из базальной камеры и добавляют 2 мкг/мл диспазы (1 мл) в апикальную камеру.
  2. Аккуратно тритурировать смесь среды/диспазы пипеткой P1000 и поместить в инкубатор на 15 мин. Осторожно снова протрите смесь и инкубируйте еще 15 минут.
  3. Добавьте 1 мл охлажденного PBS (4 °C) и перенесите органоиды с матричной средой в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл. Отжим при 400 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушить клетку гранулы.
  4. Промыть еще раз 1 мл охлажденного PBS и открутить при 400 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушить смесь среды и клеток.
  5. Добавьте 1 мл раствора клеточной отслоения к конической центрифужной трубке, аккуратно тритурат повторно суспендируйте матричную среду/ячейку СКФ-базальной мембраны. Поместите в инкубатор на 12 мин для пассирования клеток в виде агрегатов или для криоконсервации) или на 20 мин для одноклеточной суспензии.
  6. Добавьте равный объем закалочной среды и открутите при 400 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование в закалочной среде + 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в трубке не должно быть видно остаточной среды базальной мембраны. Если остаточная среда остается, повторите шаги 8.5 и 8.6.
  7. Выполните подсчет ячеек. Рассчитайте объем, необходимый для последующих приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Через 24 часа после нанесения покрытия, день 1, иПСК должны быть на 50%-90% сливающимися. На 2 день ДЭ должен быть 90%-95% сливающимся. Во время индукции DE обычно наблюдается значительная гибель клеток на 4-й день, но прикрепленные клетки сохраняют компактную морфологию булыжника (рисунок 2b). Прекратить дифференцировку, если большинство адгезивных клеток отделяются, и рассмотреть возможность сокращения воздействия DE-среды активином А на 6-12 ч. Во время индукции AFE гибель клеток минималь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Успешная дифференциация 3D-органоидов целых легких (WLO) опирается на многоступенчатый 6-недельный протокол с вниманием к деталям, включая время воздействия факторов роста и малых молекул, клеточную плотность после прохождения и качество hiPSCs. Сведения об устранении неполадок см. в таблице 2. hiPSCs должны быть примерно на 70%-80% сливающимися, с менее чем 5% спонтанной дифференциацией до диссоциации. Этот протокол требует среды "mTeSR plus"; однако простая среда "mTeSR" также использовалась с сопостав...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Калифорнийским институтом регенеративной медицины (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cell Culture
12 луночные планшетыCorning3512
12-луночные вставки, 0,4 мкм, полупрозрачныйVWR10769-208
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
аскорбиновая кислотаSigmaA4544
B27 без ретиноевой кислотыThermoFisher12587010
Бычий сывороточный альбумин (БСА) Фракция V, 7,5% растворGibco15260-037
ДиспазаStemCellTech7913
DMEM/F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife Технологии35050061
Хам s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove' s Модифицированный Дульбекко s Medium (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonothioglycerolSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/кейс)Stem Cell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (ингибитор горных пород)R& D Systems1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin AR& D Systems338-AC
All-trans ретиноевая кислота (RA)Sigma-AldrichR2625
BMP4R& D Systems314-BP/CF
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CHIR99021Abcamab120890
ДексаметазонSigma-AldrichD4902
ДорсоморфинR& D Systems3093
ЭФРR& D Systems236-EG
FGF10R& D Systems345-FG/CF
FGF7R& D Systems251-КГ/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-метилксантин)Sigma-AldrichI5879
SB431542R& D Systems1614
VEGF/PIGFR& D Systems297-VP/CF
strong>Первичные антителаDilution rate
CXCR4-PER& D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.14583333
KRT5 Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R& D SystemsAF30750.180555556
SPB (зрелый)7 Hills486041: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (зрелый)LS BioLS-B91611:100 (F); 1:500 (W) a
<

Ссылки

  1. Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
  2. Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
  3. Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).
  4. Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
  5. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  8. Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
  9. Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
  10. Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
  11. Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
  12. Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
  13. Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
  16. McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).
  17. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
  18. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
  19. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  20. Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
  21. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  22. Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  23. Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
  24. McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
  25. Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
  26. Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).
  27. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  28. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
  29. McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
  30. Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).
  31. Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
  32. Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Генерация 3D-органоидов цельных легких из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для моделирования биологии и болезней развития легких
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.