Методическая статья
Кишечный эпителий обеспечивает не только всасывание питательных веществ, но и защиту от вредных веществ. Наиболее апикально-эпителиальное межклеточное соединение, т. е. плотное соединение, регулирует параклеточную растворенную и ионную проницаемость. Здесь описан протокол подготовки листов слизистой оболочки и оценки селективности ионов плотных соединений методом камеры Уссинга.
Метод камеры Уссинга был впервые изобретен датским ученым Хансом Уссингом в 1951 году для изучения трансклеточного транспорта натрия через кожу лягушки. С тех пор этот метод был применен ко многим различным тканям для изучения физиологических параметров транспорта через мембраны. Метод камеры Юссинга предпочтительнее других методов, потому что можно использовать нативную ткань, что делает его более применимым к тому, что происходит in vivo. Однако, поскольку используется нативная ткань, пропускная способность низкая, время ограничено, а подготовка тканей требует навыков и обучения. Эти камеры использовались для изучения специфических белков-транспортеров в различных тканях, понимания патофизиологии заболеваний, таких как при муковисцидозе, изучения транспорта и поглощения лекарств и особенно способствовали пониманию транспорта питательных веществ в кишечнике. Учитывая весь процесс эпителиального транспорта ткани, важны не только трансэпителиальные пути, но и параклеточные пути. Плотные соединения являются ключевым фактором, определяющим тканеспецифическую параклеточную проницаемость по всему кишечнику. В этой статье метод камеры Уссинга будет использоваться для оценки параклеточной пермселективности ионов путем измерения трансэпителиальной проводимости и потенциалов разбавления.
Метод камеры Уссинга был впервые разработан датским ученым Хансом Уссингом. Уссинг впервые использовал его для измерения тока короткого замыкания транспорта натрия через кожу лягушки после того, как было замечено, что NaCl может транспортироваться через кожу против крутого градиента концентрации1. Его система состояла из лягушачьей шкуры, установленной между двумя камерами с доступом к обеим сторонам кожи. Каждая камера содержала раствор Рингера, который циркулировал и аэрировался. Два узких агаровых звеньевых моста, расположенных рядом с кожей и соединенных с насыщенными электродами KCl-каломеля, измеряли разность потенциалов, считываемую поте....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все животные, используемые в этих экспериментах, содержались в учреждении по уходу за животными в Университете Сидзуоки, и эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами исследований на животных, установленными Университетом Сидзуоки. Все эксперименты проводились с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Сидзуока (разрешения No 205272 и No 656-2303).
1. Подготовка электродов NaCl
ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды, используемые в этих экспериментах, состоят из концентрированных NaCl или KCl. Электроды KCl/calomel приобретаются на коммерческой основе. Перед началом эксперимен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты, показанные в настоящем документе, являются результатами, которые были частью более крупного проекта, который был завершен (см. ref.4,23,24).
Трансэпителиальная электропроводность тонкой кишки снижается у мышей Cldn15-/-.
Базовая трансмукозальная проводимость (в условиях короткого замыкания) среднего.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом эксперименте камеры Ussing использовались для измерения исходных электрических параметров и потенциала разбавления NaCl в тонком кишечнике мышей Cldn15-/- и WT. При проведении экспериментов с камерой Уссинга очень важно убедиться, что мембранный препарат, используемый в экспериментах, является жизнеспособным. Обычно это делается путем добавления глюкозы или активатора аденилатциклазы форсколина и наблюдения за тем, есть ли соответствующее повышение Isc (100-300 мкА/ см2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет потенциальных конфликтов интересов для раскрытия.
Эта работа поддерживается 17K00860 (до HH) и 19K20152 (до NI). WH хотел бы поблагодарить Стипендиальный фонд Оцука Тосими за их финансовую поддержку с 2018 по 2021 год.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| #3 полиэтиленовая трубка | Hibiki | внешний диаметр 1,0 мм; внутренний диаметр 0,5 мм | |
| #7 полиэтиленовая трубка | Hibiki | внешний диаметр 2,3 мм; внутренний диаметр 1,3 мм | |
| 10 мл стопорный шприц | Terumo | SS-10LZ | Стопорные шприцы необходимы для предотвращения смещения иглы во время наполнения |
| 19 г игла | Terumo | NN-1938R | Пожалуйста, соблюдайте осторожность при работе с иглами и утилизируйте в контейнере для острых предметов |
| иглу 23 г | Terumo | NN-2332R | Пожалуйста, соблюдайте осторожность при работе с иглами и утилизируйте в контейнере для острых |
| 5 мм перфоратор | NA | NA Используйте для пробивания отверстий в фильтровальной бумаге и парапленке | |
| акупунктурные иглы | Seirin | NS | Используется в качестве рассекающих штифтов для прикалывания ткани к диссекционной пластине |
| Агар | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Зажимы типа «крокодил» | NA | NA Подключает электрод к усилителю | |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | Используется для коррекции разницы осмоляльностей в разведении HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| для вскрытия | Вам понадобятся, ножницы и изогнутые щипцы | ||
| Пластины | Мы использовали 10 см пластины для клеточных культур и покрытые силиконовым каучуком | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | Для изготовления форсколинового приклада |
| Электрический регистратор | TOA Electronics | PRR-5041 | Другие аналогичные электрические регистраторы доступны в продаже |
| Усилитель напряжения эпителия | Nihon Kohden | CEZ9100 | Другие эквивалентные усилители доступны в виде коммерчески фильтровальной |
| бумаги, нарезанной на квадраты | NA | NA | Punched with 5 mm punched, используется для удержания кишечной подготовки |
| тонкими щипцами | Fast Gene | FG-B50476 | Для тупого рассечения мышечного слоя |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Сделайте запас 10 мМ в ДМСО, конечная концентрация будет 10 & микро; M |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Индометацин | Sigma | I7338-5G | Сделайте запас 1 мМ в 21 мМ NaHCO3, конечная концентрация 10 &м; M |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/каломельный электрод | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-глутамин | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Смешанный газ (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Используется для барботирования раствора Ringer и камер при использовании раствора Ringer | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl электрод | NA | NA | Электроды ручной работы, для которых требуется концентрированный NaCl и серебряная проволока |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Используется для барботажных камер при использовании буферной | |
| парапленки | HEPES Bemis | PM-996 | Используется для помощи в герметизации камер Ussing |
| pH-метр | DKK-TOA Corp | HM-305 | Буфер HEPES необходимо отрегулировать до pH 7,4 при 37 °°; C |
| pH-метр | электрод DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| Силиконовый каучук | Shinetsu Chemical | KE-12 | Используется для заполнения пластин для рассечения |
| серебряной проволокой | Используется для изготовления электродов NaCl | ||
| Маленькие баночки с пластиковыми крышками | NA | NA | Использование для электродов NaCl |
| стереомикроскоп | Zeiss | Stemi 305 | Стереомикроскоп позволяет видеть глубину, поэтому вы можете легче рассекать ткань |
| Tris (основание Trizma) | Sigma | T1503-1KG | Сделать 1М раствор для регулировки pH буферов HEPES |
| Использование камер | Sanki Kagaku Kougei | Эти камеры изготовлены на заказ для непрерывной перфузии Использование камер с диаметром окна 5 мм | |
| Водяной насос и система нагрева | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | НТТ-110 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение