Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Динамика образования проплатлетов эксплантов костного мозга мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последняя стадия мегакариопоэтиса приводит к цитоплазматическим расширениям из зрелых мегакариоцитов, так называемых проплацелетов. Многое было изучено о формировании проплатлетов с использованием in vitro-дифференцированных мегакариоцитов; однако появляется все больше доказательств того, что традиционные системы культивирования не точно повторяют процесс дифференцировки/созревания, который происходит внутри костного мозга. В этой рукописи мы представляем метод эксплантата, первоначально описанный в 1956 году Тьери и Бессисом для визуализации мегакариоцитов, которые созрели в своей родной среде, тем самым обходя потенциальные артефакты и неправильные интерпретации. Свежие костные мозги собирают путем промывки бедренных костей мышей, нарезают на поперечные сечения 0,5 мм и помещают в инкубационную камеру при 37 °C, содержащую физиологический буфер. Мегакариоциты постепенно становятся видимыми на периферии экспланта и наблюдаются до 6 часов под перевернутым микроскопом, соединенным с видеокамерой. Со временем мегакариоциты меняют свою форму, причем некоторые клетки имеют сферическую форму, а другие развивают толстые расширения или расширяют множество тонких пластин с обширным ветвлением. Проводятся как качественные, так и количественные исследования. Этот метод имеет то преимущество, что он прост, воспроизводим и быстр, так как присутствуют многочисленные мегакариоциты, и классически половина из них образует проплацелеты за 6 часов по сравнению с 4 днями для культивируемых мышиных мегакариоцитов. В дополнение к изучению мышей-мутантов, интересным применением этого метода является прямая оценка фармакологических агентов в процессе расширения проплатлетов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, который может происходить в культурах.
Введение
Метод эксплантации костного мозга был впервые разработан Тьери и Бессисом в 1956 году для описания формирования цитоплазматических расширений мегакариоцитов крыс как начального события в образовании тромбоцитов1. Используя фазовый контраст и кинематографические методы, эти авторы охарактеризовали трансформацию зрелых круглых мегакариоцитов в «кальмароподобные» тромбоцитогенные клетки с цитоплазматическими расширениями, показывающими динамические движения удлинения и сокращения. Эти руки становятся все тоньше, пока не станут нитевидными с небольшими отеками вдоль рук и на кончиках. Эти типичные удлинения мегакариоцитов, полученные in vitro
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Подготовка реагентов
- Готовят реагенты, как описано в таблице 1.
- Для запаса I растворите каждый порошок отдельно. Убедитесь, что осмолярность препарата выше 295 мОсм/л. Этот раствор можно хранить при 4 °C в течение одного года.
- Для буферного приготовления тирода внесите раствор, как описано в таблице 1,отрегулируйте объем до 10....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Качественные результаты. В начале эксперимента все клетки уплотняются в области костного мозга. Требуется 30 минут, чтобы клетки стали хорошо видны на периферии эксплантов. Затем мегакариоциты распознаются по их большому размеру, и их эволюция затем может быть изучена с течением времени (размер, форма, динамика, расширение проплатлетов и высвобождение тромбоцитов)(рисунок 2A). Малые мегакариоциты имеют диаметр от 20 до 30 мкм, и их ядра полилобулированы, в то время как зрелы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем простой и недорогой метод in vitro для оценки эффективности мегакариоцитов для расширения процибетов, выросших в костном мозге. Модель эксплантата костного мозга для мышей имеет четыре основных преимущества. Во-первых, не требуются продвинутые технические навыки. Во-вторых, время, необходимое для получения мегакариоцитарных проплацелетов, довольно короткое, всего 6 часов для метода экспланта, по сравнению с минимумом 4 дня для обычного метода культивирования, начиная с мышиных прародителей. В-.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Жана-Ива Ринкеля, Жюли Бошер, Патрисию Лоффер, Моник Фройнд, Кетти Кнез-Хипперт за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом ANR (Agence National de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 и ANR-18-CE14-0037.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шприцы 5 мл | Terumo | SS+05S1 | |
| иглы 21 калибра | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Инкубационные камеры | Электронная микроскопия Sciences | 70324-02 | Глубина: 0,2 мм |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH скорректированный к 7,5 |
| Сывороточный альбумин человека | Разрешенный препарат VIALEBEX | : n° 3400956446995 | 20% (200мг/мл -100 мл) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Электронная микроскопия | Sciences 72200-40 | 22 мм x 55 мм |
| Микроскоп | Leica Microsystems SA, Вестлар, Германия | DMI8 - 514341 | воздушный объектив |
| микроскоп | камера Leica Microsystems SA, Вестлар, Германия | K5 CMS GmbH -14401137 | разрешение изображения: 4,2 мегапикселя |
| Мышиная сыворотка | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma S7653 | ||
| 2PO4. H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10 000 единиц/мл пенициллина, 10 000 μ г/мл стрептомицина и 29,2 мг/мл глутамина |
| Лезвие бритвы | Электронная микроскопия Sciences | 72000 | |
| Сахароза D (+) | Sigma | G8270 |
Ссылки
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
