Методическая статья

Динамика образования проплатлетов эксплантов костного мозга мыши

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62501

⸱

20 мая 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.

Аннотация

Последняя стадия мегакариопоэтиса приводит к цитоплазматическим расширениям из зрелых мегакариоцитов, так называемых проплацелетов. Многое было изучено о формировании проплатлетов с использованием in vitro-дифференцированных мегакариоцитов; однако появляется все больше доказательств того, что традиционные системы культивирования не точно повторяют процесс дифференцировки/созревания, который происходит внутри костного мозга. В этой рукописи мы представляем метод эксплантата, первоначально описанный в 1956 году Тьери и Бессисом для визуализации мегакариоцитов, которые созрели в своей родной среде, тем самым обходя потенциальные артефакты и неправильные интерпретации. Свежие костные мозги собирают путем промывки бедренных костей мышей, нарезают на поперечные сечения 0,5 мм и помещают в инкубационную камеру при 37 °C, содержащую физиологический буфер. Мегакариоциты постепенно становятся видимыми на периферии экспланта и наблюдаются до 6 часов под перевернутым микроскопом, соединенным с видеокамерой. Со временем мегакариоциты меняют свою форму, причем некоторые клетки имеют сферическую форму, а другие развивают толстые расширения или расширяют множество тонких пластин с обширным ветвлением. Проводятся как качественные, так и количественные исследования. Этот метод имеет то преимущество, что он прост, воспроизводим и быстр, так как присутствуют многочисленные мегакариоциты, и классически половина из них образует проплацелеты за 6 часов по сравнению с 4 днями для культивируемых мышиных мегакариоцитов. В дополнение к изучению мышей-мутантов, интересным применением этого метода является прямая оценка фармакологических агентов в процессе расширения проплатлетов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, который может происходить в культурах.

Введение

Метод эксплантации костного мозга был впервые разработан Тьери и Бессисом в 1956 году для описания формирования цитоплазматических расширений мегакариоцитов крыс как начального события в образовании тромбоцитов1. Используя фазовый контраст и кинематографические методы, эти авторы охарактеризовали трансформацию зрелых круглых мегакариоцитов в «кальмароподобные» тромбоцитогенные клетки с цитоплазматическими расширениями, показывающими динамические движения удлинения и сокращения. Эти руки становятся все тоньше, пока не станут нитевидными с небольшими отеками вдоль рук и на кончиках. Эти типичные удлинения мегакариоцитов, полученные in vitro и в жидких средах, имеют определенное сходство с тромбоцитами, наблюдаемыми в фиксированном костном мозге, где мегакариоциты выступают длинными расширениями через синусоидальные стенки в кровообращение2,3. Открытие и клонирование ТПО в 1994 г. позволило дифференцировать мегакариоциты в культуре, способные образовывать расширения проплатлетов, напоминающие описанные в костном мозговых эксплантатах4,5,6. Однако созревание мегакариоцитов гораздо менее эффективно в условиях культивирования, в частности, обширная внутренняя мембранная сеть зрелых мегакариоцитов костного мозга недоразвита в культивированных мегакариоцитах, что затрудняет исследования механизмов биогенеза тромбоцитов7,8.

Здесь мы подробно описываем модель экспланта костного мозга, основанную на Тьери и Бессисе, чтобы проследить в реальном времени за образованием проплатлетов мышиных мегакариоцитов, которые полностью созрели в своей родной среде, тем самым обходя возможные артефакты in vitro и неправильные интерпретации. Представлены результаты, полученные у взрослых мышей дикого типа, иллюстрирующие способность мегакариоцитов к расширению проплацетов, их морфологию и сложность проплацелетов. Мы также внедряем стратегию быстрой количественной оценки для проверки качества для обеспечения точности и надежности данных в процессе регистрации мегакариоцитов. Протокол, представленный здесь, является самой последней версией метода, опубликованной в виде главы книгиранее 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Подготовка реагентов

  1. Готовят реагенты, как описано в таблице 1.
    1. Для запаса I растворите каждый порошок отдельно. Убедитесь, что осмолярность препарата выше 295 мОсм/л. Этот раствор можно хранить при 4 °C в течение одного года.
    2. Для буферного приготовления тирода внесите раствор, как описано в таблице 1,отрегулируйте объем до 100 мл с дистиллированной водой и добавьте 0,1 г безводной D (+) сахарозы. При необходимости отрегулируйте pH 7,3 с использованием 1 N HCl и осмолярность до 295 мОсм/л. Для предотвращения роста бактерий добавляют пенициллин G в конечной концентрации 10 Ед/мл и сульфат стрептомицина в конечной концентрации 0,29 мг/мл. Процедить конечный раствор через поры 0,22 мкм.

2. Подготовка экспериментального установки

  1. В день эксперимента нагрейте буфер Тирода при 37 °C и включите нагревательную камеру микроскопа, чтобы довести температуру до 37 °C.
  2. Подготовьте все необходимые инструменты, такие как таймер, инкубационные камеры, шприцы 5 мл, 21 г, щипцы, лезвие бритвы, пипетки Пастера, стеклянные слайды и 15 мл центрифужная трубка(рисунок 1А).

3. Выделение костного мозга мыши

  1. Усыпленить мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель путем удушьяCO2 и вывиха шейки матки. Это должно быть сделано быстро компетентным и квалифицированным человеком.
  2. Чтобы избежать микробного загрязнения, замочите тело мыши в 70% (v/v) этаноле перед удалением бедренных кочных кочных кочных масс. Используйте инструменты, продезинфицированные в 70% этаноле для рассечения. Соберите две бедренные кости и очистите их, удалив любую адгезивную ткань. После быстрого погружения в этанол поместите их в 15 мл центрифужную трубку, содержащую 2 мл буфера Tyrode.
  3. Отрежьте эпифизы острым лезвием бритвы и промывайте костный мозг с помощью шприца 5 мл, заполненного буфером Tyrdode 2 мл. Чтобы достичь этого, введите иглу 21 G в отверстие бедренной кости (со стороны колена) и медленно нажмите на поршень, чтобы извлечь неповрежденный цилиндр костного мозга(рисунок 1B,C). Держите сеанс сбора костного мозга как можно короче (менее 10 минут).

4. Сечение костного мозга и помещение в инкубационную камеру

  1. Используйте пластиковую пипетку объемом 3 мл, чтобы аккуратно и аккуратно перенести неповрежденный костный мозг на стеклянную горку. Важно, чтобы образцы были покрыты буфером для предотвращения высыхания(рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте потока-опрокидываемого потока, чтобы свести к минимуму сдвиги, которые могут диссоциировать ткань.
  2. Под стереомикроскопом (10x) отрежьте концы костного мозга, которые могли быть сжаты во время промывки. Затем вырежьте поперечные участки острым лезвием бритвы. Срезы должны быть достаточно тонкими, чтобы можно было провести подробное наблюдение, но гарантировать, что мегакариоциты не повреждаются при сжатии (обычно толщина около 0,5 мм)(рисунок 1E,F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Секции выполнены с острым лезвием бритвы и под лупой для регулировки их толщины примерно до 0,5 мм. Выбираются только участки равномерной толщины. Эта процедура не сложна, но ее стандартизация требует некоторого опыта.
  3. Используя пластиковую пипетку, соберите 10 секций в трубку объемом 1 мл, содержащую буфер Тирода(рисунок 1G).
  4. Аккуратно перенесите секции в инкубационную камеру диаметром 13 мм(рисунок 1Н).
  5. Аспирируйте буфер и отрегулируйте объем до 30 мкл буфера Tyrode, дополненного 5% сывороткой мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Именно на этом этапе могут быть добавлены фармакологические средства для оценки их влияния на образование проплателетов.
  6. Расположите секции на расстоянии. Запечатайте самоклеящуюся камеру с помощью крышки размером 22 х 55 мм. Наклоняйте крышку во время прилипания, чтобы избежать образования пузырьков воздуха(рисунок 1I).
  7. Поместите камеру в нагревательную камеру при 37 °C. С этого момента запускается хронометр (T= 0 ч). Эксперимент длится 6 ч при 37 °C (T= 6 ч).

5. Наблюдение в режиме реального времени за эксплантами костного мозга

  1. Используйте инвертированный фазоконтрастный микроскоп (40-кратный объектив для увеличения), соединенный с видеокамерой, для наблюдения за эксплантами костного мозга. Дайте клеткам инкубироваться в течение 30 минут перед началом наблюдения. Во время наблюдения необходимо корректировать фокус, потому что мегакариоциты движутся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможны и другие режимы наблюдения (например, ДВС-травма, флуоресценция с использованием мышей, чьи мегакариоциты экспрессируют эндогенный флуоресцентный маркер), но фазово-контрастная микроскопия оптимальна для четкой визуализации длинных и тонких расширений мегакариоцитов, что позволяет точно количественно оценить. Через 30 мин клетки костного мозга постепенно мигрируют на периферию экспланта, образуя монослой. После 1 ч инкубации мегакариоциты можно идентифицировать по их большим размерам и полилобуляционным ядрам(рисунок 1J,K). После 3 ч инкубации количество мегакариоцитов увеличивается, а некоторые имеют длительные расширения.
  2. Делайте видео для записи трансформации мегакариоцитов.

6. Количественная оценка проплателет-расширяющих мегакариоцитов

  1. Нарисуйте карту для локализации каждого участка в инкубационной камере(рисунок 1K).
  2. Через 1 ч определите видимые мегакариоциты (т.е. гигантские полилобулированные клетки) на периферии каждого участка и нарисуйте их положения на рисунке. Повторите эту процедуру через 3 и 6 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На основании рисунка каждый мегакариоцит может быть легко локализован с течением времени и проанализирована эволюция их морфологии (например, размер, деформация, расширение проплатлетов и т.д.). Другой возможностью является использование специального навигационного программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Качественные результаты. В начале эксперимента все клетки уплотняются в области костного мозга. Требуется 30 минут, чтобы клетки стали хорошо видны на периферии эксплантов. Затем мегакариоциты распознаются по их большому размеру, и их эволюция затем может быть изучена с течением времени (размер, форма, динамика, расширение проплатлетов и высвобождение тромбоцитов)(рисунок 2A). Малые мегакариоциты имеют диаметр от 20 до 30 мкм, и их ядра полилобулированы, в то время как зрелы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем простой и недорогой метод in vitro для оценки эффективности мегакариоцитов для расширения процибетов, выросших в костном мозге. Модель эксплантата костного мозга для мышей имеет четыре основных преимущества. Во-первых, не требуются продвинутые технические навыки. Во-вторых, время, необходимое для получения мегакариоцитарных проплацелетов, довольно короткое, всего 6 часов для метода экспланта, по сравнению с минимумом 4 дня для обычного метода культивирования, начиная с мышиных прародителей. В-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Жана-Ива Ринкеля, Жюли Бошер, Патрисию Лоффер, Моник Фройнд, Кетти Кнез-Хипперт за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом ANR (Agence National de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 и ANR-18-CE14-0037.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприцы 5 млTerumoSS+05S1
иглы 21 калибраBD Microlance301155
CaCl2.6H2OSigma21108
Coverwall Инкубационные камерыЭлектронная микроскопия Sciences70324-02Глубина: 0,2 мм
HEPESSigmaH-3375pH скорректированный к 7,5
Сывороточный альбумин человекаРазрешенный препарат VIALEBEX: n° 340095644699520% (200мг/мл -100 мл)
KClSigmaP9333
MgCl2.6H2OSigmaBVBW8448
Micro Cover GlassЭлектронная микроскопияSciences 72200-4022 мм x 55 мм
МикроскопLeica Microsystems SA, Вестлар, ГерманияDMI8 - 514341воздушный объектив
микроскопкамера Leica Microsystems SA, Вестлар, ГерманияK5 CMS GmbH -14401137разрешение изображения: 4,2 мегапикселя
Мышиная сывороткаBioWestS2160-010
NaClSigma S7653
2PO4. H2OSigmaS9638
NaHCO3SigmaS5761
PSG 100xGibco, Life Technologies1037-01610 000 единиц/мл пенициллина, 10 000 μ г/мл стрептомицина и 29,2 мг/мл глутамина
Лезвие бритвыЭлектронная микроскопия Sciences72000
Сахароза D (+)SigmaG8270

Ссылки

  1. Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
  2. Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
  3. Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
  4. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  5. Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
  6. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  7. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  8. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
  9. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
  10. Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
  11. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  12. Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).
  13. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  14. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  15. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  16. Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи